花青素是一类常见的天然色素，属于多酚类化合物[1]。自然界中的花青素一般不以游离态形式存在，常与1个或多个葡萄糖通过糖苷键连接形成花色苷[2-3]，主要包括：飞燕草型、天竺葵型、矢车菊型、芍药型、牵牛花型和锦葵型6种基本分子结构[4]，其广泛存在于植物的果实、叶片和花瓣中，使植物呈现不同颜色[5]。此外，花青素还具有较强的自由基清除能力[6]、抗氧化能力以及刺激抗氧化酶合成能力等[7]。
茄子，茄科植物，中国各地均有栽种，是具有重要经济价值的蔬菜之一[8]，也是提取花青素的重要原材料，主要含有飞燕草型花青素[9]。因花青素的抗氧化活性与其分子结构中苯环上所连羟基的总数有关[10]，所以相比于其它5种花青素，飞燕草型花青素分子上的羟基数量要多出1个～2个，表现出更强的抗氧化活性[11-12]，是一种更强有力的抗氧化剂。而相比于其它植物中含有的花青素，茄子皮中所含的花青素具有更好的稳定性[13]。
随着社会的不断发展和生活水平的逐渐提高，人们对自身的健康也越来越重视[14]，对于花青素提取工艺的研究也越来越受到人们的关注[15]。对于提取剂的研究，如蒋召雪等[16]以茄子皮为原料，对比蒸馏水、乙醇、丙酮3种提取剂对花青素提取效果的影响，得出乙醇为最佳的提取剂。李玲等[17]同样以茄子皮为原料，研究了不同浓度乙醇提取剂对花青素提取效果的影响，确定最佳提取剂为70%乙醇溶液。对于树脂纯化效果的研究，郭菲[18]以紫茄皮为原料，通过进行静态、动态吸附与解吸附试验，筛选出AB-8型树脂为最佳吸附树脂。蒋晓岚等[19]以紫色茄子皮为原料，盐酸和乙醇混合溶液为提取剂，使用AB-8型树脂及C18层析柱进行纯化，得到了较纯的飞燕草型花青素单体。
此外，提取花青素的方法有很多，常用的有机溶剂提取法、微波辅助与超声波辅助提取法等[20]，以及溶剂分离、层析和离子沉淀等纯化方法[21]。其中采用乙醇溶液浸泡为最常用的粗提取方法[22]。大孔树脂吸附技术因具有选择性高、易于预处理与回收等优点[23]，已广泛应用于分离和纯化等领域[24]，是纯化花青素的主要方法[21]。在花青素提取、纯化领域中，常用的吸附树脂有AB-8、D101、X-5、S-8、001 ×7、D113、DM130、ADS-17等。其中关于纯化茄子皮花青素的研究中，大多使用的是AB-8、D101等树脂，而对于D113、ADS-17型树脂从未报道使用。对于从植物中提取花青素的研究报道，所涉及的花青素大多为矢车菊型花青素，而对于提取飞燕草型花青素的报道较少。本试验使用乙醇溶液从茄子皮中提取花青素并用树脂吸附法进行纯化，以探讨提取剂乙醇浓度及6种树脂（AB-8、D101、001×7、D113、DM130、ADS-17） 对花青素提取率及纯化效果的影响，以期为从茄子皮中提取花青素提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茄子：哈尔滨地区市售，取茄子皮于冰箱中-18℃冷冻保存；无水乙醇（分析纯）、飞燕草型花青素标准品（纯度97.8%）：上海甄准生物科技有限公司；AB-8、ADS-17、D101、D113、DM130、001×7（凝胶型）树脂：天津市津达正通环保科技有限公司。6种树脂的理化性质如表1所示。
表1 6种树脂的理化性质
Table 1 Physical and chemical properties of six resins
树脂型号类型粒径范围/mm比表面积/（m2/g）平均孔径/nm树脂结构AB-8 弱极性大孔吸附树脂 0.30～1.25 480～520 13.0～14.0 苯乙烯-二乙烯苯聚合物ADS-17 非极性大孔吸附树脂 0.4～1.0 90～150 25.0～30.0 苯乙烯高聚物D101 非极性大孔吸附树脂 0.2～0.6 480～530 10.0～12.0 苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有磺酸基D113 弱极性阳离子交换树脂 0.35～0.55 516.76 5.34 丙烯酸共聚交联高分子基体上带有羧酸基DM130 弱极性大孔吸附树脂 0.30～1.25 500～550 9.0～10.0 苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有季铵基001×7（凝胶型） 非极性阳离子交换树脂 0.4～0.6 苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有磺酸基
1.2 仪器与设备
721G可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SQP124电子分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；CR21N高速冷冻型离心机：日立工机株式会社；恒温加热板、空层析柱：艳涛玻璃仪器经销部。
1.3 方法
1.3.1 花青素粗溶液的制备
准确称取剪碎的茄子皮样品，每份200 g分别置于烧杯中，4种不同浓度的乙醇溶液各1 L为提取剂，浓度分别为50%、60%、70%、80%。将提取剂倒入装有茄子皮的烧杯中，将烧杯放于加热板上，恒温60℃浸泡90 min。冷却至室温25℃后过滤，将滤液放于转速为9 000 r/min的高速冷冻型离心机中离心5 min。离心后所得上清液即为花青素粗溶液，避光保存备用。
1.3.2 花青素粗溶液的纯化
6种树脂各取100 g分别放于烧杯中，倒入无水乙醇溶液使其浸没树脂，浸泡2 h。采用湿法装柱，1种类型的树脂需4根空层析柱，每根层析柱需树脂100 g，取6种树脂分别灌入空层析柱中。以树脂体积3倍的去离子水冲洗各填装树脂后的层析柱并确保流出液中不含乙醇。取上述所得花青素粗溶液100 mL分别以2.5 mL/s的流速通过6种树脂层析柱，依次收集流出液，避光保存待测定。
1.3.3 流出液中花青素的类型及含量分析
准确称取1 mg飞燕草型花青素标准品，用70%乙醇溶液溶解于50 mL容量瓶中并定容至刻度线，即为20 mg/L飞燕草型花青素标样。用可见分光光度计测定其在338 nm～700 nm的绝对吸光度，找到飞燕草型花青素的最大吸收波长。其中，绝对吸光度为待测溶液的吸光度值减去单独测试空比色皿的吸光度值。
在338 nm～700 nm波长范围内，使用可见分光光度计测定由最佳纯化条件所得到的流出液。将测定结果与飞燕草型花青素标样进行对比，从而判断流出液中所含花青素的类型及含量。采用如下公式计算流出液中所含花青素的浓度C。
式中：CS为飞燕草型花青素标样浓度，mg/L；AE为流出液在标样特征峰处的绝对吸光度；AS为标样在特征峰处的绝对吸光度。
为了表示流出液中所含目标花青素的相对纯度，定义流出液中花青素主要特征吸收峰处绝对吸光度与其主要杂质吸收峰处绝对吸光度的比值为相对值R，其计算公式如下。
式中：AC为流出液中花青素主要特征吸收峰处绝对吸光度；AI为流出液中主要杂质吸收峰处绝对吸光度。
花青素的提取率计算公式如下。
式中：P为花青素的提取率，mg/g；m为流出液中计算所得花青素质量，mg；m0为原料茄子皮的质量，g。
2 结果与分析
2.1 提取剂浓度对花青素提取效果的影响
在338 nm～700 nm波长范围内分别测量不同提取剂浓度的花青素粗溶液的绝对吸光度，结果如图1所示。
图1 花青素粗溶液吸收光谱图
Fig.1 Absorption spectrum of anthocyanins in crude solutions
由图1可看出，不同提取剂浓度所得的花青素粗溶液在420、530～550、580 nm及650 nm～660 nm处均有明显的吸收峰，而飞燕草型花青素标样在波长为530 nm～550 nm及580 nm处有相对较高的吸收峰，因此可判断，飞燕草型花青素的特征吸收峰在波长为530 nm～550 nm及580 nm处。其中，在飞燕草型花青素标样吸收曲线中，因为波长为580 nm处的特征吸收峰对应的绝对吸光度值较大，可确定在波长为580 nm处的吸收峰为飞燕草型花青素的主要特征吸收峰。将不同浓度提取剂所得花青素粗溶液的吸收曲线与飞燕草型花青素标样的吸收曲线进行对比，可以得出，在波长420 nm及650 nm～660 nm处的吸收峰为杂质吸收峰，而在各不同提取剂浓度所得的花青素粗溶液吸收曲线中，因为在波长420 nm处的杂质吸收峰对应的绝对吸光度值均最大，所以可确定在波长420 nm处的吸收峰为主要杂质吸收峰。
图2为在波长530 nm～550 nm及580 nm处，不同浓度提取剂对花青素粗溶液绝对吸光度的影响。
图2 提取剂浓度对花青素粗溶液在530 nm～550 nm及580 nm处绝对吸光度的影响
Fig.2 Effect of extractant concentrations on absolute absorbance of anthocyanins crude solutions at 530 nm-550 nm and 580 nm
由图2可以看出，当提取剂浓度分别为50%、70%、80%乙醇溶液时，花青素粗溶液在530 nm～550 nm及580 nm处的绝对吸光度较高，当提取剂浓度为60%乙醇溶液时，花青素粗溶液在530 nm～550 nm及580 nm处的绝对吸光度较低。表2是由图1及图2中各花青素粗溶液在420 nm处主要杂质吸收峰处的绝对吸光度与580 nm处飞燕草型花青素主要特征吸收峰处的绝对吸光度根据公式（2）计算得出。相对值R为花青素粗溶液中所含飞燕草型花青素相对于所含杂质的比值，可表示不同的提取剂浓度对花青素粗溶液中飞燕草型花青素提取效果的影响。由表2的计算结果可知，当提取剂为70%乙醇溶液时，相对值R最大，花青素粗溶液中含有的飞燕草型花青素相对纯度较高。因此，对飞燕草型花青素提取效果最佳的提取剂为70%乙醇溶液。
表2 提取剂浓度与相对值R
Table 2 Extractant concentrations and relative R
提取剂浓度/% A（420 nm） 相对值R 50 0.211 0.86 60 0.193 0.63 70 0.199 0.89 80 0.243 0.73
2.2 不同类型树脂对花青素纯化效果的影响
将由不同浓度提取剂提取到的4份花青素粗溶液，分别通过 DM130、ADS-17、D113、001×7、AB-8、D101型6种树脂填装的层析柱，其流出液的吸收光谱图如图3所示。
图3 不同浓度提取剂的树脂流出液吸收光谱图
Fig.3 Absorption spectrum of resins effluents with different concentrations of extractant
a.50%乙醇溶液；b.60%乙醇溶液；c.70%乙醇溶液；d.80%乙醇溶液。
由图3与图1对比可知，对于4种浓度不同提取剂所得花青素粗溶液，D113型树脂均可以明显提高530 nm～550 nm及580 nm波长处的绝对吸光度，并有效地降低420 nm及650 nm～660 nm波长处的绝对吸光度，能够有效地提高各流出液中所含飞燕草型花青素的纯度。由图3c中各流出液在420 nm主要杂质吸收峰处的绝对吸光度与580 nm飞燕草型花青素主要特征吸收峰的绝对吸光度，根据公式（2）计算得出相对值R，结果见表3。相对值R为流出液中所含飞燕草型花青素相对于所含杂质的含量，可表示6种树脂对飞燕草型花青素纯度的影响，最优提取条件所得相对值R为0.89。由表3可看出，对飞燕草型花青素纯化效果最佳的是D113型树脂，纯化效果最差的是DM130型树脂。由具体数据可知，相比于70%乙醇溶液所提取到的花青素粗溶液，D113流出液中飞燕草型花青素的纯度提高了48.3%。
表3 不同树脂类型纯化效果
Table 3 Purification effect of different resin types
树脂类型 相对值R AB-8 0.87 ADS-17 0.80 D101 0.86 D113 1.32 DM130 0.72 001×7（凝胶型） 0.85
图4表示D113型、DM130型树脂及提取剂浓度对飞燕草型花青素纯化效果的影响。
图4 D113和DM130树脂及提取剂浓度对飞燕草型花青素纯度的影响
Fig.4 Effect of D113 and DM130 resins and extractant concentration on the purity of delphinidins
由图4可见当提取剂为70%乙醇溶液时，结合D113型树脂从茄子皮中提取飞燕草型花青素，所得相对值R最大为1.32，可以有效地提高飞燕草型花青素的提取率及纯度。D113型树脂具有区别于另外5种树脂的丙烯酸共聚交联高分子基体上带有羧酸基的树脂结构，且具有弱极性及最小的平均孔径，对茄子皮中含有的飞燕草型花青素有很好的透过作用。将所得的最佳流出液和飞燕草型花青素标样溶液在338 nm～700 nm范围内测定绝对吸光度，结果如图5所示。
图5 D113型树脂纯化流出液与标样对比图
Fig.5 Comparison of D113 effluent with standard sample
由图5可以看出，经70%乙醇溶液提取及D113型树脂纯化所得的流出液与飞燕草型花青素标样在各吸收峰处所对应的波长均一致。因此，可确定本研究方法从茄子皮中提取到的花青素类型为飞燕草型花青素，其提取率为1.83 mg/g。
3 结论
本试验使用乙醇溶液浸提与树脂吸附法从茄子皮中提取花青素，经过与飞燕草型花青素标样对比可知，所得花青素类型为飞燕草型花青素。通过对比不同提取剂及树脂对飞燕草型花青素纯度的影响，确定最佳的提取条件是以70%乙醇溶液为提取剂浸泡提取与D113型树脂吸附纯化相结合，在此条件下从茄子皮中提取飞燕草型花青素的提取率为1.83 mg/g。本试验提供了一种从茄子皮中提取并纯化飞燕草型花青素的新思路，以期为以绿色、便捷的试验方法从茄子皮中提取花青素提供一定的参考。
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