黄酒是世界上最古老的酒类之一，被称为液体蛋糕，更是中华民族的传统酒，它是以稻米、黑米、黍米、玉米、小麦等为主要原料，经蒸料、加曲、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒等工艺酿制而成[1]，含有葡萄糖、麦芽糖、糊精、甘油、有机酸、氨基酸等营养物质[2-3]，尤其是氨基酸的种类和含量都非常高，酒精含量约为14%～20%。黄酒可饮用，可作药引，亦可烹饪调味。
随着国民经济的快速发展和人们生活水平的不断提高，全民健康意识均普遍增强，人们更注重自身的健康状况和日常养生，消费者对高酒精度、口感剧烈的白酒的热度逐渐减退，转而崇尚健康、养生、营养、口感温和的酒类，而黄酒恰好是低度、营养、保健的酿造酒[4-5]。将具有一定保健功能的物质加入酒中，符合民众酒类消费的心理。近年来，挖掘并研发出具有一定保健功能的酒类已成为诸多学者研究的热点。林娟等[6]以绿茶和糯米为主要原料，采用正交试验优化发酵工艺，研发出清亮透明、香醇浓郁、酸甜适中的发酵型保健茶酒。胡会萍等[7]探究了绿茶对甜米酒的影响，结果表明，绿茶汁的茶水料液比为1∶40（g/mL）时得到的米酒品质最佳。刘蒙佳等[8]以果酒专用酵母RW为酿酒菌种，优化了正山小种红茶和番石榴汁发酵酒的工艺，研发出具有茶香、番石榴果香的风味酒。
山茱萸为植物山茱萸的干燥成熟果肉，在我国大量种植，主产区分布在河南、浙江、安徽等地，是我国卫健委颁布的药食同源作物之一。山茱萸肉含有16种氨基酸和大量人体所必需的微量元素，性酸、微温，具有补肝肾、涩精气、治疗腰膝酸痛、耳鸣、眩晕等功效，具有较好的保健功能[9-11]。诸多现代医学研究已证实，山茱萸肉富含多糖、熊果酸、皂甙、环烯醚萜甙、齐墩果酸、没食子酸等活性成分，具有消炎、抗菌、提高免疫力、抗衰老等功效[12-13]，近年来也陆续应用在保健、功能食品研发方面，比如保健饮料、养生白酒、果酱、果脯、果肉罐头等[14-19]。对发酵酒而言，主要是通过将功能性物质浸泡、调配、勾兑等工艺加工而成，用山茱萸发酵黄酒的相关研究尚在起步阶段，尤其是发酵工艺方面的数据比较缺乏。因此，本文采用单因素和正交试验对山茱萸黄酒的加工工艺进行优化，旨在为山茱萸的精深加工提供新思路，为保健黄酒的开发奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山茱萸（一级）：河南宛西制药股份有限公司；糯米（一级）：黑龙江五常市兴旺米业有限公司；酒曲：浙江力克生物科技有限公司；明胶（食品级）：清远市清新区和畅食品原料有限公司；黄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
恒温水浴锅（HH-S4）：江苏金怡仪器科技有限公司；旋转蒸发器（RE 52-86A）：上海亚荣生化仪器厂；电热恒温培养箱（DHP-9022）：上海精宏仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（723N）：上海束句仪器科技有限公司；酸度计（PHS-25）：上海雷磁仪器有限公司。超声波清洗机（TP300）：北京天鹏电子新技术有限公司；台式低速自动平衡离心机（MG/LDZ4-1.2）：北京中西远大科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 山茱萸提取液的制备
提取：取除杂后的山茱萸果肉，冷冻干燥后粉碎，过40目筛，以5倍的质量加入蒸馏水，在一定温度下超声波辅助提取70 min，重复操作2次，3 000 r/min离心15 min后过滤，合并滤液，过滤后使用旋转蒸发仪进行浓缩，得到山茱萸粗提液。
降酸：采用碳酸钙和碳酸钠对粗提液进行降酸处理，总酸测定采用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法，pH值采用酸度计进行测定。
降涩：采用明胶对粗提液进行脱涩处理，去除其中的单宁。向山茱萸提取液中加入0.17%的明胶，在脱涩时间为35 min、脱涩温度为32℃的条件下进行脱涩处理，离心后取上清液测定单宁含量。单宁含量的测定采用Folin-Ciocalteu法[20]。最后，收集降酸、脱涩后的山茱萸提取液，备用。
1.3.2 糯米预处理
糯米用冷水浸泡约14 h，直至米粒浸透无白心，捞出沥干后进行蒸饭。蒸至冒蒸汽5 min后，撒入适量清水，再大火蒸10 min，得到膨胀发亮、松散柔软、颗粒分明的饭粒[21]。摊凉至36℃～38℃即可。
1.3.3 多糖含量的测定
取适量山茱萸黄酒真空蒸发浓缩后加入无水乙醇静置过夜，产生的沉淀依次用80%乙醇、丙酮、乙醚反复淋洗后溶于90℃热水中，不断搅拌并保温3 h后用氯仿多次萃取以除去蛋白质等杂质，制得的山茱萸多糖沉淀再用乙醇、丙酮、乙醚淋洗多次后真空冷冻干燥并称重，即为纯化的山茱萸多糖[22]。
1.3.4 酒精度测定
采用蒸馏比重法测定室温条件下（25℃）山茱萸黄酒的酒精度[23]。通过查询“酒精度与温度校正表”将酒精度换算成20℃下的酒精度。
1.4 工艺优化试验
1.4.1 单因素试验
以黄酒理化指标和感官评分为主要考察指标，在适宜发酵温度条件下，设置单因素试验分别考察山茱萸提取液与干糯米的液料比、酒曲添加量、酵母添加量和发酵时间对黄酒酒精度、多糖、皂甙含量和感官评分的影响。具体方案设定如下：固定酒曲添加量2.0%、酵母添加量0.25%、糖化2 d、发酵6 d，设定山茱萸提取液与干糯米的液料比分别为 2∶7、3∶7、4∶7、5∶7、6∶7（mL/g）；固定山茱萸提取液与干糯米液料比为4∶7（mL/g）、酵母添加量 0.25%、糖化 2 d、发酵 6 d，设定酒曲添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%；固定茱萸提取液与干糯米液料比为4∶7（mL/g）、酒曲添加量2.0%、糖化2 d、发酵6 d，设定酵母添加量分别为0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%；固定茱萸提取液与干糯米液料比为 4∶7（mL/g）、酒曲添加量 2.0%、酵母添加量0.25%、糖化2 d，设定发酵时间分别为4、5、6、7、8 d。
1.4.2 正交试验
在单因素试验的基础上，选择山茱萸提取液与干糯米的液料比、酒曲添加量、酵母添加量和发酵时间4个因素，采用L9（34）正交试验优化黄酒的发酵工艺。
1.4.3 验证试验
在优化的最佳工艺条件下制备山茱萸黄酒，并对黄酒的酒精度、总糖、总酸、非糖固形物含量等基础指标[24]和多糖、皂甙等活性成分的含量进行测定，最后，结合感官评价[25]结果确定最终工艺。
1.5 数据处理
试验数据采用Excel 2016软件进行统计分析及作图，正交试验设计采用SPSS17.0软件。
2 结果与分析
2.1 山茱萸提取液与干糯米的液料比的确定
液料比对山茱萸黄酒酒精度、总糖含量、总酸含量、感官品质的影响见表1。
表1 液料比对山茱萸黄酒酒精度、总糖含量、总酸含量、感官品质的影响
Table 1 Effects of liquid-solid ratio on wine precision，total sugar content，total acid content，and sensory quality of Chinese rice wine from Cornus officinalis
液料比/（m L/g）酒精度/%v o l总糖/（g/L）总酸/（g/L）色泽口感2∶7 9.5 3 3.5 4.6 淡黄色 清淡3∶7 9.4 3 8.4 5.2 淡黄色 较清淡4∶7 1 0.1 4 2.2 5.5 棕黄色 较醇厚、鲜甜5∶7 1 0.4 4 5.4 6.0 棕红色 较醇厚、微酸6∶7 9.1 4 8.6 6.5 红色 醇厚、微酸、涩
由表 1 可以看出，液料比为2∶7（mL/g）和 3∶7（mL/g）时的黄酒色泽略浅，口感也偏淡，总糖及总酸含量也较低。当液料比为4∶7（mL/g）时，黄酒的感官性质和理化指标较好，而当液料比超过4∶7（mL/g）时，尽管总糖含量较高，但是口感已经变差，这可能是因为山茱萸提取液中的多糖、皂甙等活性物质抑制了菌种的繁殖所致，因此，液料比为4∶7（mL/g）时黄酒整体品质较好，以上指标均符合黄酒国家标准GB/T 13662—2018《黄酒》，属于半甜型黄酒。
2.2 酒曲添加量的确定
酒曲添加量对山茱萸黄酒酒精度的影响见图1。
图1 酒曲添加量对山茱萸黄酒酒精度的影响
Fig.1 Effect of adding amount of koji on alcohol content of Chinese rice wine from Cornus officinalis
由图1可知，随着酒曲添加量的增加，山茱萸黄酒的酒精度呈现先升高后降低的趋势，当酒曲添加量为2.0%时，酒精度为10.4%vol，继续增大酒曲添加量后，黄酒的酒精度升高趋势开始变慢，而当添加量为3.0%时，酒精度反而下降。一般而言，当酒曲添加量较少时，米粒糖化不充分，不能为酵母菌发酵产生酒精提供充足的碳源；而当酒曲添加量较多时，糖化过快对发酵过程也不利，同样导致酒精度下降，且会造成资源浪费。因此，选择酒曲添加量为2.0%比较合适。
2.3 酵母添加量的确定
酵母添加量对山茱萸黄酒酒精度的影响见图2。
图2 酵母添加量对山茱萸黄酒酒精度的影响
Fig.2 Effect of adding amount of yeast on alcohol content of Chinese rice wine from Cornus officinalis
随着酵母添加量的增多，黄酒酒精度呈先上升后下降的趋势，当酵母添加量为0.25%时，酒精度最大，为11.2%vol，随后，酒精度呈下降趋势。这可能是酵母添加量过低时，液料发酵不充分，所得酒精含量较低。而当酵母添加量过多时，发酵初期酵母迅速繁殖，呼吸旺盛，代谢产物积累，不利于酒精的积累。因此，选择酵母添加量为0.25%进行后续试验。
2.4 发酵时间的确定
发酵时间对山茱萸黄酒酒精度的影响见图3。
图3 发酵时间对黄酒酒精度的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on alcohol content of Chinese rice wine from Cornus officinalis
添加酵母后随着发酵时间延长，黄酒的酒精度显著增加，当发酵至第6天时，酒精度达到最大，而后开始下降。这可能是随着发酵时间的延长，产物积累增加，促使底物浓度升高，且同时伴有其它次级代谢产物的产生，抑制酒精的生成。因此，发酵时间为6 d时发酵效果较佳。
2.5 正交试验
在单因素试验的基础上，选择液料比、酒曲添加量、酵母添加量和发酵时间4个因素，采用L9（34）正交试验优化黄酒的发酵工艺，设计的因素水平见表2。正交试验结果见表3。
表2 L9（34）正交试验因素水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment
水平 A液料比/（m L/g）D发酵时间/d 1 3∶7 1.5 0.2 0 5 2 4∶7 2.0 0.2 5 6 3 5∶7 2.5 0.3 0 7 B酒曲添加量/%C酵母添加量/%
表3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal experiment
编号 A B C D 酒精度/%vol 1 1 1 1 1 9.43 2 1 2 2 2 11.42 3 1 3 3 3 11.22 4 2 1 2 3 11.31 5 2 2 3 1 10.97 6 2 3 1 2 10.59 7 3 1 3 2 10.96 8 3 2 1 3 10.48 9 3 3 2 1 11.05 k1 10.69 10.57 10.17 10.48 k2 10.96 10.96 11.26 10.99 k3 10.83 10.95 11.05 11.00 R 0.27 0.39 1.09 0.52
对正交试验结果作极差分析可知，4个因素对山茱萸黄酒的酒精度的影响从大到小依次为酵母添加量、发酵时间、酒曲添加量和液料比，即C>D>B>A。根据各因素的k值得出最优的发酵工艺组合为A2B2C2D3，即山茱萸浸提液与干糯米液料比为4∶7（mL/g）、酒曲添加量为2.0%、酵母添加量为0.25%、发酵时间为7 d。
2.6 验证试验
以山茱萸黄酒的酒精度、总糖、总酸、非糖固形物、多糖、山茱萸皂甙含量和感官指标等为考察依据，对正交试验实际最优组合A1B2C2D2和理论最优组合A2B2C2D3进行验证试验并比较分析，结果如表4所示。
表4 验证试验结果
Table 4 Results of verification test
工艺组合指标酒精度/%vol总糖含量/（g/L）总酸含量/（g/L）非糖固形物含量/（g/L）多糖含量/（g/L）山茱萸皂甙含量/（g/L）外观香气口感A1B2C2D2 11.43 44.35 5.7 28.21 30.7 0.045较醇厚，柔和鲜甜、无异味A2B2C2D3 11.56 44.35 5.57 29.01 31.12 0.046棕黄色、清亮透明、有光泽，放置后底部有少量聚集物棕黄色、清亮透明、有光泽，放置后底部有少量聚集物有黄酒特有的醇香和山茱萸的香气有黄酒特有的醇香和山茱萸的香气较醇厚，柔和鲜甜、无异味
两个组合得到的山茱萸黄酒的总糖含量、感官品质无明显差别，而正交试验优化的组合得到的黄酒的酒精度、非糖固形物含量、多糖、山茱萸皂甙含量均略高于组合A1B2C2D2，因此，山茱萸黄酒的最佳工艺条件为山茱萸浸提液与干糯米液料比4∶7（mL/g）、酒曲添加量2.0%、酵母添加量0.25%、发酵时间7 d。
3 结论
将山茱萸提取液经降酸、脱涩处理后加入糯米中，在酒曲的作用下进行发酵酿造山茱萸黄酒。以黄酒的理化指标、感官评分、活性成分含量为依据，通过单因素和正交试验确定山茱萸黄酒的最优发酵工艺条件为山茱萸浸提液与干糯米液料比4∶7（mL/g）、酒曲添加量2.0%、酵母添加量0.25%、发酵时间7 d。该工艺下酿造的黄酒中酒精度为11.56%vol，总糖、多糖、山茱萸皂甙含量分别为44.35、31.12 g/L和0.046 g/L，黄酒呈棕黄色，清亮透明，有特有的醇香和山茱萸香气，口感醇厚。整体来看，黄酒的酒精度、总糖、总酸、非糖固形物含量和感官指标均符合国家相关标准，属于半甜型黄酒。
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