多依果又称栘衣果，是蔷薇科栘[木衣]属热带植物云南栘[Docynia delavayi（Franch.）Schneid.]的果实，在我国主产于云南、贵州等地[1-3]。其药食兼用，富含多种营养物质和多酚类活性成分，具有健胃消食和抗衰老等功能[4-6]。多依果是云南地方特色水果，仅云南糯扎渡镇种植面积就达12 000多亩。
多依果的常见吃法是舂碎后拌以调料生吃，但因质地酸涩不符合外地人口味，受限于地域环境难以推广。其传统加工方式有泡果、果酱、果饮料等多种形式[7-9]，但方式简单，附加值低。相关研究表明，多依果富含抗氧化活性成分[10-18]，将其酿造成果醋，尽可能的保存其功能性成分，可大大增加多依果的经济效益，推动多依果产业的现代化发展。
10月份～12月份是多依果的成熟采摘期，此时云南普洱室温（17℃～24℃）可满足多依果发酵温度条件。本研究以云南特色水果多依果为原料，室温（17℃～24℃）条件下，经过醋酸发酵，以总酸度、可溶性固形物含量及感官评分为评价指标，采用单因素结合响应面法优化多依果醋的酿造工艺参数，并对其总黄酮成分和体外抗氧化活性进行测定，旨在酿造一款较好保存多依果抗氧化活性功能的果醋，为多依果的深加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
多依果（成熟期）：市售；安琪果酒酵母：安徽中科中佳公司；醋酸菌：山东和众康源生物科技有限公司。
焦亚硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；芦丁（纯度级别≥98%）、DPPH、ABTS（分析纯）：合肥博美生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LH-B55数显折光仪：杭州陆恒生物科技有限公司；GMK-702R糖度测定仪：北京西诺远大科技有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；pH-100手持式pH计：上海力辰邦西仪器科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 多依果醋加工工艺流程及操作要点
1.3.1.1 加工工艺流程
1.3.1.2 操作要点
（1）鲜果准备：挑选成熟期多依果鲜果，洗净，晾干。
（2）打浆：鲜果去皮、切块，按料液比 1∶2（g/mL）称重、加水、打浆。
（3）酶解：果浆中添加0.2%的果胶酶，室温（17℃～24℃）酶解 6 h。
（4）糖度调整：添加26%的白砂糖，以达到多依果酒精发酵所需的酒精度（10.8%vol）要求。
（5）灭菌：添加二氧化硫（60 mg/kg）进行灭菌。
（6）酵母菌接种：称取4%的酵母菌粉，水浴活化30 min，接入发酵液中。
（7）初始pH值调整：加入柠檬酸，调节发酵液pH值为3.4。
（8）酒精发酵：室温（17℃～24℃）发酵6 d。
（9）酒精度调整：加水稀释多依果酒至试验所需酒精度。
（10）醋酸菌接种：按试验所需称取醋酸菌粉，活化培养48 h，接入发酵液中。
（11）装料：按试验所需比例将调配好的原料装入发酵罐中。
（12）醋酸发酵：室温（17℃～24℃）发酵试验所需时间。
（13）过滤：发酵液纱布过滤，得多依果醋成品。
1.3.2 多依果醋发酵工艺优化
1.3.2.1 单因素试验
试验前进行预试验，得初始发酵适宜条件为初始酒精度7%vol、醋酸菌接种量0.3%、装料量40%，室温（17℃～24℃）发酵15 d。在预试验基础上，以可溶性固形物含量、酸度和感官评分为评价指标，考察初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol）、醋酸菌添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、装料量（20%、30%、40%、50%、60%）和发酵时间（9、12、15、18、21 d）对多依果醋发酵的影响。
1.3.2.2 响应面优化试验
基于单因素试验，选择初始酒精度（A）、醋酸菌接种量（B）、装料量（C）和发酵时间（D）为考察因子，以感官评分为响应值（Y），采用Box-Behnken试验方法进行四因素三水平的响应面优化试验。响应面试验设计见表1。
表1 多依果醋酿造工艺响应面优化试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of D.delavayi fruit vinegar
水平因素A初始酒精度/（%vol）B醋酸菌接种量/% C装料量/% D发酵时间/d-1 6 0.3 30 12 0 7 0.4 40 15 1 8 0.5 50 18
1.3.3 指标测定方法
1.3.3.1 感官评定
多依果醋感官评定参照NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》中感官检验与要求制定，具体评定标准见表2。
表2 多依果醋酸发酵感官评分
Table 2 Sensory evaluation standards of D.delavayi fruit vinegar
项目 感官描述 评分外观 澄清、透明、色泽诱人 16～20澄清、无杂物、色泽较好 11～15浑浊、有杂物、色泽不自然 ＜10香气 果香和醋香谐调、浓郁、怡人 26～30果香和醋香较好、较怡人 21～25果香和醋香较淡 16～20果香和醋香不足 ＜15滋味 醋质醇厚、柔和 36～40醋质柔和、无涩苦、酸甜适中 31～35醋质纯正无杂 26～30醋质较淡、略苦涩酸 21～25醋质有异味、明显苦涩酸 ＜20典型性 典型完美、有多依果独具清香 8～10典型性一般 4～7无多依果典型性 ＜3
1.3.3.2 理化和微生物指标
总酸参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中酸碱指示剂滴定法测定；可溶性固形物含量参考GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中折光计法测定；菌落总数参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定；大肠菌群计数参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定。
1.3.3.3 总黄酮含量的测定
总黄酮含量参考SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》测定。
1.3.3.4 体外抗氧化活性测定
抗氧化性参考GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性测定 DPPH和ABTS法》测定。
样品溶液多依果醋的制备：采用响应面优化的最佳工艺参数酿造的多依果产品；原果汁：果肉与水料液比1∶2（g/mL）；维生素 C：0.15%维生素 C 水溶液。
1.4 数据处理与分析
采用Design-Expert 8.0进行响应面试验设计与分析，Origin 2018进行数据处理与绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 初始酒精度对多依果醋发酵的影响
初始酒精度对多依果醋发酵的影响见图1。
图1 初始酒精度对多依果醋发酵的影响
Fig.1 Effect of initial alcohol content on acetic fermentation of D.delavayi fruit
由图1可知，初始酒精度在5%vol～9%vol时，随着酒精度的增加，多依果醋的总酸度呈先上升后趋于平缓的趋势，感官评分和可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势。在初始酒精度为7%vol时，感官评分达到最高（89分），总酸度为4.0 g/100 mL。酒精度大于7%vol后，产酸量逐步放缓，也影响果醋的口感[19]。因此，综合考虑选取醋酸发酵初始酒精度为7%vol。
2.1.2 醋酸菌接种量对多依果醋发酵的影响
醋酸菌接种量对多依果醋发酵的影响见图2。
图2 醋酸菌接种量对多依果醋发酵的影响
Fig.2 Effect of acetic acid bacteria on acetic fermentation of D.delavayi fruit
由图2可知，醋酸菌接种量在0.1%～0.5%时，随着醋酸菌的增加，多依果醋的总酸度呈先上升后趋于平缓的趋势，感官评分和可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势。在醋酸菌接种量为0.4%时，感官评分达到最高（91分），总酸度为4.2 g/100 mL。醋酸菌接种量大于0.4%后，产酸量变化很小，果醋的口感反而下降。因此，综合考虑选取醋酸菌接种量为0.4%。
2.1.3 装料量对多依果醋发酵的影响
装料量对多依果醋发酵的影响见图3。
图3 装料量对多依果醋发酵的影响
Fig.3 Effect of loading amount on acetic fermentation of D.delavayi fruit
由图3可知，装料量在20%～60%时，随着装料量的增加，多依果醋的总酸度和可溶性固形物含量均呈先上升后趋于平缓的趋势，感官评分呈现先上升后下降的趋势。在装料量为40%时，感官评分达到最高（88分），总酸度为4.3 g/100 mL。装料量大于40%后，虽然产酸量增多，但果醋的口感下降。因此，综合考虑选取醋酸发酵装料量为40%。
2.1.4 发酵时间对多依果醋发酵的影响
发酵时间对多依果醋发酵的影响见图4。
图4 发酵时间对多依果醋发酵的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on acetic fermentation of D.delavayi fruit
由图4可知，发酵时间在9 d～21 d时，随着发酵时间的增加，多依果醋的总酸度呈先上升后平缓的趋势，感官评分和可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势。在发酵时间为15 d时，感官评分达到最高（91分），总酸度为4.5 g/100 mL。发酵15 d后，总酸度变化较小，果醋口感反而下降。因此，选取醋酸发酵时间为15 d。
2.2 醋酸发酵响应面优化与分析
感官评价是果醋的重要指标，因此醋酸发酵试验以感官评分为响应值。响应面试验优化结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 醋酸发酵响应面试验优化结果
Table 3 Experimental result of response surface design of acetic fermentation
试验号 A初始酒精度/%vol Y感官评分1 6 0.4 40 18 81 2 7 0.5 30 15 83 3 7 0.4 40 15 92 4 7 0.4 50 12 81 B醋酸菌接种量/%C装料量/%D发酵时间/d 5 0.3 30 15 78 6 8 0.4 50 15 82 7 7 7 0.4 30 12 82 8 7 0.3 50 15 83 0.5 40 18 84 10 7 0.5 50 15 82 11 7 0.3 40 12 84 12 7 0.4 40 15 93 13 7 0.4 40 15 93 14 8 0.4 40 12 88 15 7 0.4 40 15 91 16 6 0.3 40 15 81 17 7 0.5 40 12 85 18 7 0.4 50 18 83 19 6 0.4 30 15 77 20 7 0.3 40 18 82 21 8 0.4 40 18 79 22 6 0.5 40 15 81 23 8 0.5 40 15 85 24 7 0.4 30 18 77 25 7 0.4 40 15 94 26 6 0.4 40 12 78 27 8 0.4 30 15 77 28 6 0.4 50 15 76 29 8 0.3 40 15 83 9 7
表4 回归模型方差分析
Table 4 ANOVA for response surface quadratic model
注：**表示极显著（P＜0.01）
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 731.18 14 52.23 68.87 <0.000 1 **A 33.33 1 33.33 43.96 <0.000 1 **B 6.75 1 6.75 8.90 0.009 9 **C 14.08 1 14.08 18.57 0.000 7 **D 12.00 1 12.00 15.82 0.001 4 **AB 1.00 1 1.00 1.32 0.270 1 AC 9.00 1 9.00 11.87 0.003 9 **AD 36.00 1 36.00 47.47 <0.000 1 **BC 9.00 1 9.00 11.87 0.003 9 **BD 0.25 1 0.25 0.33 0.575 0 CD 12.25 1 12.25 16.15 0.001 3 **A2 285.41 1 285.41 376.37 <0.000 1 **B2 91.62 1 91.62 120.82 <0.000 1 **C2 365.68 1 365.68 482.21 <0.000 1 **D2 139.25 1 139.25 183.63 <0.000 1 **残差 10.62 14 0.76失拟项 5.42 10 0.54 0.42 0.880 8纯误差 5.20 4 1.30总和 741.79 28 R2adj=0.971 4，R2pred=0.947 0，信噪比：25.906
感官评分（Y）回归拟合方程：Y=92.60+0.67A+0.75B+1.08C-1.00D+0.50AB+1.50AC-3.00AD-1.50BC+0.25BD+1.75CD-6.63A2-3.76B2-7.51C2-4.63D。由表4可知，模型P值＜0.000 1，达到高度显著水平，表明所得方程有意义；失拟项P值为0.880 8，不显著，表明所构建的模型合理，与试验的差异较小；相关系数R2pred为0.947 0，调整系数R2adj为0.971 4，变异系数＜3%，表明预测值与试验值有较好的相关性，误差较小；模型的信噪比为25.906，远大于4，则表明该模型适用于多依果醋酸发酵感官评分的预测。在该模型中，一次项A、B、C、D 和交叉项 AC、AD、BC、CD 以及二次项 A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），其他因素组合对结果无显著影响（P＞0.05）。根据F值大小可知，4个因素对多依果酒发酵影响的顺序：初始酒精度（A）＞装料量（C）＞发酵时间（D）＞醋酸菌接种量（B）。
根据回归方程对试验结果进行优化，得多依果醋酸发酵的最优条件：初始酒精度7.18%vol，醋酸菌接种量0.41%，装料量40.6%，发酵时间14.52 d，在此工艺条件下，多依果醋的感官评分理论值为92.88分。根据实际情况将工艺参数修正为初始酒精度7%vol，醋酸菌接种量0.4%，装料量40%，发酵时间15 d。按修正后的工艺参数值进行验证试验，得到多依果醋的实际感官评分为94分，与理论值相对误差为1.20%。由此可知，采用响应面法优化多依果醋酿造工艺条件是准确可行的，模型可用。
2.3 多依果醋品质分析
对按照最优发酵工艺参数制备的多依果醋进行各项指标测定和品质分析。
2.3.1 感官评定
多依果醋为黄橙色，具有多依果的特征香气，酸甜适中，口感谐调，感官评分为94分。
2.3.2 理化和微生物指标测定
多依果醋可溶性固形物含量为（11.3±0.03）%，总酸含量为（4.42±0.15）g/100 mL，菌落总数为（12.5±1.1）CFU/mL，大肠菌群未检出。多依果果醋各项指标检测结果均符合NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》的标准要求。
2.3.3 活性成分总黄酮含量分析
黄酮类化合物有保护心血管系统和提高人体免疫力的功效，而且在清除自由基方面也作用明显[20]。以芦丁含量y（mg/mL）为纵坐标，吸光度x为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.030 2x-0.000 7，相关系数R2=0.999 050。经计算得多依果醋中总黄酮含量为（3.83±0.12）mg/L。
2.3.4 多依果醋体外抗氧化活性分析
将多依果醋对DPPH和ABTS+自由基的清除能力与多依果的原果汁、维生素C相比较，结果如图5所示。
图5 多依果醋、原果汁和维生素C对DPPH和ABTS+自由基清除能力
Fig.5 The free radical scavenging ability of DPPH and ABTS+of fruit vinegar，raw juice and vitamin C
A.DPPH自由基清除率；B.ABTS+自由基清除率。
多依果醋、原果汁和维生素C对DPPH和ABTS+自由基清除能力变化趋势基本一致，随着样品用量的增加而逐渐增大，均呈现持续上升后趋于平缓的总体趋势。维生素C作为纯净物，对DPPH和ABTS+自由基清除能力始终略高于多依果醋和多依果的原果汁。从图5A可知，样品用量在0.4 mL～1.6 mL时，多依果醋、原果汁对DPPH自由基的清除率持续上升，且多依果醋对DPPH自由基的清除能力略高于原果汁；随后变化趋势趋于平缓，果醋对DPPH自由基的清除率最高达到86.8%。从图5B可知，样品用量在0.1 mL～0.3 mL时，多依果醋、原果汁对ABTS+自由基的清除率持续上升，较低量时多依果醋对ABTS+自由基的清除能力略低于原果汁，但随着样品用量的增加，多依果醋的清除率逐渐高于原果汁；随后变化趋势趋于平缓，多依果醋对ABTS+自由基的清除率最高达到80.2%。由此可知，多依果醋较好的保留了多依果的抗氧化活性成分。
3 结论
多依果室温（17℃～24℃）下经酒精发酵得果酒，酒精稀释后进一步醋酸发酵制得多依果醋。通过Box-Behnken响应面法设计和优化多依果醋酸发酵工艺，以感官评分为响应值确定最佳醋酸发酵工艺参数为初始酒精度7%vol、醋酸菌接种量0.4%、装料量40%和发酵时间15d。在此优化酿造工艺条件下，多依果醋为黄橙色，具有多依果的特征香气，酸甜适中，口感谐调，感官评分为 94分，总酸含量为（4.42±0.15）g/100 mL，各项指标检测结果均符合NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》的标准要求。同时，测得多依果醋中总黄酮含量为（3.83±0.12）mg/L，对 DPPH 和 ABTS+自由基的清除率最高可达86.8%和80.2%，果醋自由基清除率与多依果的原果汁相近而略低于维生素C。多依果醋较好的保留了多依果的总黄酮和抗氧化活性成分。
[1]慈晓彤,石辰,王大玮,等.云南栘[木衣]叶片总RNA提取方法的比较与改进[J].西北林学院学报,2020,35(3):95-99.CI Xiaotong,SHI Chen,WANG Dawei,et al.Comparison and improvement of total RNA extraction methods from Docynia delavayi leaves[J].Journal of Northwest Forestry University,2020,35(3):95-99.
[2]黄艳丽,尹锦荣,王琼,等.响应面法优化多依果酒的酿造工艺[J].中国酿造,2020,39(4):205-209.HUANG Yanli,YIN Jinrong,WANG Qiong,et al.Optimization of fermentation technology of Docynia delavayi fruit wine by response surface methodology[J].China Brewing,2020,39(4):205-209.
[3]苏科巧.云南三种特色野果资源的研究现状及开发前景[J].农产品加工,2019(4):90-92,95.SU Keqiao.The research status and development prospect of three kinds of characteristic wild fruit resources in Yunnan[J].Farm Products Processing,2019(4):90-92,95.
[4]木丽云,冷应天.栘（挔）(野山楂)和野生云南杨梅的资源调查及营养成分研究[J].林业科技通讯,2018(8):13-15.MU Liyun,LENG Yingtian.Investigation of resources and nutrition composition of Docynia dcne.Myrica nana and A.Chev[J].Forest Science and Technology,2018(8):13-15.
[5]韩本勇,任英.云南栘依的研究概况[J].民营科技,2014(6):267,280.HAN Benyong,REN Ying.Research overview of Docynia delavayi in Yunnan[J].Non-State Running Science&Technology Enterprises,2014(6):267,280.
[6]黄丽萍,徐新,马二秀,等.民族药食资源栘[木衣]乙醇提取物的降糖、降脂及抗氧化活性研究[J].中药药理与临床,2019,35(5):60-64.HUANG Liping,XU Xin,MA Erxiu,et al.Study on the hypoglycemic,lipid reducing and antioxidant activities of ethanol extract from Docynia delavayi in ethnic medicine and food resources[J].Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica,2019,35(5):60-64.
[7]冀智勇.云南多衣系列产品开发研究[J].食品研究与开发,2006,27(6):113-114.JI Zhiyong.Research on the development of Yunnan Docynia Dcne.series products[J].Food Research and Development,2006,27(6):113-114.
[8]董文明,唐卿雁,刘华戎,等.栘衣果汁饮料加工技术的研究[J].保鲜与加工,2013,13(6):46-50.DONG Wenming,TANG Qingyan,LIU Huarong,et al.Study on the process of Docynia delavayi(Franch.)Schneid.juice drink[J].Storage and Process,2013,13(6):46-50.
[9]朱明君,刘刚,梅雪然,等.冠突散囊菌固态发酵对栘(木衣)茶品质和成分影响的研究[J].食品与生物技术学报,2017,36(8):834-842.ZHU Mingjun,LIU Gang,MEI Xueran,et al.Effect of solid-state fermentation with Eurotium cristatum on the quality and chemical compositions of Docynia indica tea[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2017,36(8):834-842.
[10]PENG J Y,SHI C,WANG D W,et al.Genetic diversity and population structure of the medicinal plant Docynia delavayi(Franch.)Schneid revealed by transcriptome-based SSR markers[J].Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants,2021(21):1-8.
[11]ZHAO X P,SHU G W,CHEN L,et al.A flavonoid component from Docynia delavayi(Franch.)Schneid represses transplanted H22 hepatoma growth and exhibits low toxic effect on tumor-bearing mice[J].Food and Chemical Toxicology,2012,50(9):3166-3173.
[12]DENG X K,ZHAO X P,LAN Z,et al.Anti-tumor effects of flavonoids from the ethnic medicine Docynia delavayi(Franch.)Schneid.and its possible mechanism[J].Journal of Medicinal Food,2014,17(7):787-794.
[13]官智,潭颂德,苏镜娱,等.云南栘（木衣）(Docynia delavayi(Franch.)Schneid.)黄酮成分研究[J].天然产物研究与开发,2000,12(3):34-37.GUAN Zhi,TAN Songde,SU Jingyu,et al.Floavones from the bark of Docynia delavayi(Franch.)Schneid[J].Natural Product Research and Development,2000,12(3):34-37.
[14]李维莉,马银海,彭永芳,等.云南栘依总黄酮提取工艺研究[J].食品科学,2006,27(7):147-149.LI Weili,MA Yinhai,PENG Yongfang,et al.Optimum extracting conditions of flavones in Yunnan Docynia delavayi(Franch.)Schneid[J].Food Science,2006,27(7):147-149.
[15]邓旭坤,赵湘培,梅之南,等.傣药“栘依”中黄酮类活性成分抗炎镇痛作用的研究[C]//2010年全国中药学术研讨会论文集.武汉,中国中西医结合协会,2010:63-68.DENG Xukun,ZHAO Xiangpei,MEI Zhinan,et al.Study on antiinflammatory and analgesic effects of flavonoids active components in traditional Dai medicine “Yiyi”[C].//2010 National Symposium on Traditional Chinese Medicine.Wuhan:Chinese Association of Integrated Traditional and Western Medicine,2010:63-68.
[16]李学玲,张建强,郑琰,等.大果栘依总黄酮的提取与抗氧化性研究[J].云南化工,2018,45(12):58-62.LI Xueling,ZHANG Jianqiang,ZHENG Yan,et al.Study on extraction,identification and antioxidation activity of flavonoids from Docynia delavayi(Franch.)Schneid[J].Yunnan Chemical Technology,2018,45(12):58-62.
[17]毛绍春,李竹英,李聪.栘依树抗氧化剂对香烟烟气自由基及人淋巴细胞姐妹染色单体交换率的影响 [J].生态毒理学报,2006,1(4):379-383.MAO Shaochun,LI Zhuying,LI Cong.Influences of Docynia delavayi Schneid on free radical of cigarette smoke and human's lymphocyte chromosome[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2006,1(4):379-383.
[18]刘海霞,刘刚,张晓喻,等.栘[木衣]属植物多酚的含量测定与比较[J].食品科学,2014,35(24):295-300.LIU Haixia,LIU Gang,ZHANG Xiaoyu,et al.Determination of polyphenol contents in Docynia Dcne[J].Food Science,2014,35(24):295-300.
[19]曹桢,陈善敏,黄小雨,等.紫薯醋发酵工艺优化及品质分析[J].食品与发酵工业,2021,47(4):195-201.CAO Zhen,CHEN Shanmin,HUANG Xiaoyu,et al.Fermentation process optimization and quality analysis of purple sweet potato vinegar[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(4):195-201.
[20]李大成,韦巧艳,舒万鑫,等.响应面法优化桑葚-甘蔗汁复合饮料制备工艺及其抗氧化活性研究[J].食品研究与开发,2021,42(9):113-120.LI Dacheng,WEI Qiaoyan,SHU Wanxin,et al.Optimization of the preparatory process of mulberry-sugarcane juice using response surface methodology and determination of its antioxidant activity[J].Food Research and Development,2021,42(9):113-120.