关于乳状液对生物活性成分包埋的载体构建已经有广泛研究。将不饱和脂肪酸作为油相，既能提高乳状液的营养价值，也能提高不饱和脂肪酸的抗氧化性[1]。蛋白稳定的水包油型乳状液虽被广泛用作生物活性成分的载体，但是仍具有许多缺陷，对环境非常敏感，如加热、冷却，尤其是对pH值和盐浓度最敏感。这些因素都会影响乳状液的物理和化学稳定性，造成分层、絮凝、聚集、破乳和奥斯瓦尔德熟化[2]。因此，通过制备结构更加复杂的乳状液以提高其稳定性是扩大乳状液应用的关键[3]。
蛋白质与多糖都属于高分子聚合物，两者之间通过离散相分离、缔合相分离、共溶3种形式相互作用[4]。许多由天然多糖制备并稳定的乳状液已经在食品工业中广泛应用，如阿拉伯胶、玉米纤维多糖、甜菜多糖[5-7]。多糖充当乳状液的稳定剂主要是源于其增稠作用以及空间稳定性。没有吸附到界面的多糖会增加水相的黏度，降低分层、聚集和絮凝带来的不稳定性。研究发现，蛋白质和多糖可以通过共价键或非共价键形成复合物，对液滴界面层的厚度、黏弹性和电荷密度等都会产生一定的影响，对乳状液的稳定性有一定的改善作用[8]。阿拉伯胶和黄原胶是食品工业中应用广泛的多糖[9-10]。与蛋白乳化剂不同的是，这两种多糖在油滴表面形成厚的空间层，因此对pH值、离子强度和高温不敏感[11]。将蛋白质和多糖复合，用这种复合体制备的乳状液稳定性均有所提升[5]。
灵芝孢子油是采用超临界CO2流体萃取技术，从破壁灵芝孢子中萃取，经浓缩得到的油状脂质物，富集了灵芝孢子中的三萜类、多糖类、核苷类等活性成分，具有抗肿瘤、抑制肿瘤细胞增生及增强免疫等作用[12]。将灵芝孢子油包埋在乳状液中，对灵芝孢子油中的活性成分具有良好的保护效果。本文以大豆分离蛋白为乳化剂，将蛋白与多糖混合，形成蛋白-多糖复合物，将灵芝孢子油作为油相包埋其中，研究多糖的加入对乳状液稳定性和抗氧化性的改善效果，研究结果将对扩大乳状液在食品领域的应用具有积极的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
大豆分离蛋白（纯度＞85%）：索莱宝试剂公司；灵芝孢子油：冠县合作社；阿拉伯胶、黄原胶：阿拉丁试剂公司；无水乙醇、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲醇、盐酸、氢氧化钠（均为分析级）：上海生工股份有限公司。
1.2 仪器与设备
AH 2100型高压均质机：加拿大ATS有限公司；UTC高速剪切乳化均质仪：美国IKA有限公司；UV1000紫外-可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；NanoBrook Omni粒径分析仪：美国布鲁克海文仪器公司；ME104电子天平：瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；BSC-150恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 蛋白-多糖复合乳状液的制备
配制质量分数为2%的大豆分离蛋白母液，21℃下缓慢搅拌1 h使蛋白质充分溶解，将pH值调节至7.0后放入4℃冰箱保存待用。
称取一定量的多糖（阿拉伯胶、黄原胶）溶于去离子水中，搅拌35 min，使其充分溶解，并用0.1 mol/L HCl或者0.1 mol/L NaOH调节pH值至7；然后将多糖溶液加入到大豆分离蛋白溶液中，搅拌35 min，使两者充分混合，然后加入一定量的灵芝孢子油，通过高速剪切乳化均质仪以10 000 r/min的转速剪切1 min制成粗乳液，再用高压均质机在50 MPa、4℃条件下均质3次制备乳状液。最终的乳状液体系：蛋白浓度为1.0%、油的浓度为1.0%、多糖的浓度分别为0.05%、0.10%、0.20%和0.50%（均为质量分数）。所有样品均进行3次重复制备以用于同一测定。
1.3.2 粒径和ζ-电位的测定
采用动态光散射法（dynamic light scattering，DLS）用于大豆蛋白-灵芝孢子油乳状液的表征。取20 μL乳状液样品，用缓冲液稀释100倍。在25℃条件下，激光衍射角为173°、折射指数为1.450测定样品的粒径分布及ζ-电位。
1.3.3 离心稳定性的测定
在2mL离心管中准确加入2mL乳状液，经800r/min离心10 min[13]，在距离心管底部1 cm处取样30 μL，加入5 mL 0.1%的SDS溶液，混匀后在500 nm下测定吸光度，每个样品重复测定3次，结果取平均值。乳状液离心稳定性用下式计算。
式中：A0为离心前乳状液的吸光度；At为离心后乳状液的吸光度。
1.3.4 乳状液储藏试验
将制备好的乳状液放置于恒温培养箱中（温度设置25℃）储藏10 d，测定ζ-电位和过氧化值变化。
ζ-电位测定：根据1.3.2方法测定ζ-电位。
过氧化值（peroxide value，POV）测定：不饱和脂肪酸在空气中易与氧气反应而酸败，氧化过程中活性氧的含量（即过氧化值，用碘的毫克当量表示，单位为meq/kg）能够反映油脂和脂肪酸的氧化程度。按GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》[14]测定过氧化值。
1.4 数据处理
所有数据用Origin 9.0软件绘图，采用SPSS 19.0处理软件进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 多糖对乳状液粒径分布的影响
2.1.1 阿拉伯胶对乳状液粒径分布的影响
图1为灵芝孢子油乳状液加入不同浓度阿拉伯胶后的粒径分布图。
图1 不同阿拉伯胶浓度下的乳状液粒径分布
Fig.1 Size distribution of the emulsions with different gum arabic concentrations
由图1可知，所有粒径均呈现双峰分布。未加入多糖的乳状液的两个峰位于130nm和550nm附近，随着阿拉伯胶浓度（0.05%～0.20%）的提高，所有粒径分布呈现变小趋势，当阿拉伯胶浓度为0.10%时，乳状液的双峰位于80nm和320nm附近。当阿拉伯胶浓度超过0.10%后，粒径分布呈现变大趋势，并且当阿拉伯胶浓度为0.50%时，粒径出现了突跃，粒径双峰分别位于280nm和1 030 nm附近，此时多糖乳状液稳定性有所下降。
2.1.2 黄原胶浓度对乳状液粒径分布的影响
图2为黄原胶浓度对灵芝孢子油乳状液粒径分布的影响。
图2 不同黄原胶浓度下的乳状液粒径分布
Fig.2 Size distribution of the emulsions with different xanthan gum concentrations
图2趋势与图1相似，当黄原胶浓度为0.05%～0.10%时，乳状液粒径分布随黄原胶浓度增加呈现变小趋势，当黄原胶浓度超过0.10%，乳状液粒径急剧变大，粒径双峰分布位于380 nm和1 400 nm附近。当黄原胶浓度为0.50%时，在2 600 nm处出现单峰分布，说明此时的乳状液可能出现了大颗粒聚集。
由此可得，乳状液中加入一定量的阿拉伯胶和黄原胶比单独大豆分离蛋白构建的乳状液粒径分布更小且更加稳定。这可能归结于多糖与蛋白竞争性的吸附到油-水界面，多糖中亲水性的碳水化合物基团会在界面悬挂，而疏水性多肽链会吸附到油-水界面，导致界面层黏弹性下降，大颗粒最终形成。当阿拉伯胶低于一定浓度时，阿拉伯胶的数量不足以有效地吸附到油-水界面，但是增加了乳状液连续相的黏度，以及阿拉伯胶的空间效应，阻止了乳状液颗粒因重力作用所产生的沉降，提高乳状液的稳定性。并且多糖也有一定的乳化能力，加入多糖以后，乳状液的乳化性能提升，在均质的时候更有效地降低界面张力，促进液滴破裂，更好地覆盖乳状液液滴表面[15]；当加入多糖过量时，负电荷过量，失去静电平衡，导致液滴之间排斥发生聚集，没有被吸附的乳化剂会促进奥斯瓦尔德熟化和液滴絮凝，降低乳状液的稳定性[16-17]。
2.2 多糖对乳状液ζ-电位的影响
不同多糖浓度下乳状液的ζ-电位见图3。
图3 不同多糖浓度下乳状液的ζ-电位
Fig.3 ζ-Potential of emulsions with different polysaccharide concentrations
乳状液滴的电学特性常用ζ-电位来表征。对于电荷稳定的乳状液，一般ζ-电位绝对值越大，体系越稳定[17]。另外，对于大分子稳定剂，由于空间排阻效应，粒子的ζ-电位绝对值大于20 mV时也可使粒子稳定分散于溶液中。如图3所示，未加入多糖时，灵芝孢子油乳状液的ζ-电位为-50.34 mV。当加入阿拉伯胶和黄原胶后，乳状液ζ-电位的绝对值均呈现先增大后变小的趋势。当多糖浓度为0.10%时，加入黄原胶和阿拉伯胶的乳状液的ζ-电位为-68.65 mV和-77.65 mV。当多糖浓度超过0.10%，乳状液ζ-电位绝对值变小，多糖浓度为0.50%时乳状液的ζ-电位分别为-55.76 mV和-60.75 mV。大豆分离蛋白和多糖都具有一定乳化活性，能促进水包油乳状液形成，阿拉伯胶的亲水性使得复合物的表面活性得到提高，同时阿拉伯胶和黄原胶属于酸性多糖，分子上的－COO-所带的电荷可通过静电排斥作用阻止油滴间聚合，提高复合物的乳化能力，使分子之间的排斥电荷增大，增强稳定性。当多糖浓度过高时负电荷过量，失去静电平衡[18-19]。
2.3 多糖对乳状液离心稳定性的影响
图4为多糖浓度对乳状液离心稳定性的影响。
图4 多糖浓度对乳状液离心稳定性的影响
Fig.4 Effect of polysaccharide concentrations on the centrifugal stability of emulsions
由图4可以看出，随着多糖浓度的提升，灵芝孢子油乳状液离心稳定性呈现先上升再下降的趋势。未加入多糖的灵芝孢子油乳状液的离心稳定性为52.37%，加入多糖后乳状液的离心稳定性显著提升，其中加入阿拉伯胶的乳状液最高可达78.76%，而黄原胶乳状液最高则达到了86.32%。当黄原胶浓度超过0.10%，阿拉伯胶浓度超过0.20%时，乳状液的离心稳定性略有下降，但仍高于未加多糖的乳状液的离心稳定性。多糖乳状液稳定性的改善主要通过增稠作用及空间稳定剂的添加，多糖通过疏水性残基吸附到油-水界面，降低界面张力和形成空间位阻来阻止乳状液聚集，没有吸附到界面的多糖会增加水相的黏度，降低分层、聚集和絮凝带来的不稳定性[20]。与阿拉伯胶相比，黄原胶的增稠作用更强，可能对乳液离心稳定性的贡献更大。
2.4 乳状液储藏过程中ζ-电位的变化
表1和表2分别为阿拉伯胶和黄原胶浓度对1.0%大豆分离蛋白（灵芝孢子油浓度1.0%）的乳状液在储藏10 d内的ζ-电位影响。
表1 不同阿拉伯胶浓度下乳状液储藏过程中ζ-电位变化
Table 1 ζ-Potential of emulsions with different gum arabic concentrations during storage
注：同一列不同字母表示差异显著，P<0.05。
储藏时间/d-48.24±3.6a -70.52±2.1a -69.22±2.7a -70.12±3.2a -58.75±3.3a 2-45.34±3.3b -68.24±2.0b -66.78±1.1b -67.23±1.7b -55.87±0.2b 5-38.75±4.6c -55.18±4.3c -60.76±1.0c -56.33±5.4c -45.34±2.4c 10 -25.76±3.2d -49.76±1.4d -46.23±3.2d -38.18±2.6d -28.17±3.7d 0% 0.05% 0.10% 0.20% 0.50%1
表2 不同黄原胶浓度下乳状液储藏过程中ζ-电位变化
Table 2 ζ-Potential of emulsions with different xanthan gum concentrations during storage
注：同一列不同字母表示差异显著，P<0.05。
储藏时间/d-48.24±3.6a -60.88±1.3a -66.65±3.0a -58.29±3.3a -50.76±3.2a 2-45.34±3.3b -58.24±2.2b -59.78±2.1b -57.26±1.8b -48.82±1.2b 5-38.75±4.6c -49.00±5.3c -50.76±2.0c -46.33±2.2c -42.04±3.4c 10 -25.76±3.2d -40.77±3.4d -36.03±2.6d -28.78±2.0d -30.07±3.2d 0% 0.05% 0.10% 0.20% 0.50%1
由表1和表2可以看出，对照组在经过10 d储藏后ζ-电位的绝对值由48.24 mV减小为25.76 mV。加入多糖后的乳状液的ζ-电位绝对值也呈现逐渐变小的趋势。阿拉伯胶浓度为0.50%时，储藏10 d后，ζ-电位为-28.17 mV，黄原胶浓度为0.20%时，经过10 d储藏后ζ-电位为-28.78 mV。阿拉伯胶和黄原胶浓度为0.05%时，10 d储藏后ζ-电位的绝对值最大，分别为49.76 mV和40.77mV。相较于蛋白乳状液，多糖-蛋白复合乳状液的ζ-电位绝对值均有所增加，使分子之间的排斥电荷增大，稳定性增强。
2.5 乳状液储藏过程中过氧化值的变化
图5为1.0%大豆分离蛋白（灵芝孢子油浓度1.0%）加入不同浓度阿拉伯胶后，乳状液中POV的变化情况。
图5 不同阿拉伯胶浓度下乳状液过氧化值的变化
Fig.5 Peroxide values of emulsions with different gum arabic concentrations
由图5可知，未加入阿拉伯胶时，乳状液在25℃条件下储藏10 d，POV由第1天的0.45 meq/kg变为第10天的12.77meq/kg。加入阿拉伯胶的乳状液，在第1天与对照组的POV相近，在第2天时，对照组的POV明显高于蛋白-多糖复合乳状液，第2天后差距不断变大。0.50%浓度的阿拉伯胶乳状液在第2天的POV为0.98 meq/kg，高于其它浓度阿拉伯胶乳状液的POV，在第10天的POV为6.68 meq/kg，明显低于对照组的POV，但是高于其它浓度阿拉伯胶的乳状液。在第5天，0.05%、0.10%和0.20%阿拉伯胶乳状液的POV相近，在第10天时，0.05%和0.10%浓度的乳状液的POV相近，分别为4.22、4.09 meq/kg，0.20%阿拉伯胶乳状液的POV最低，为2.35 meq/kg。
图6为1.0%大豆分离蛋白（灵芝孢子油浓度1.0%）加入不同浓度黄原胶后，乳状液中过氧化值的变化情况。
图6 不同黄原胶浓度的乳状液过氧化值的变化
Fig.6 Peroxide values of emulsions with different xanthan gum concentrations
由图6可知，在第2天时，0.50%黄原胶乳状液的POV与对照组接近，分别为2.25 meq/kg和1.98 meq/kg。而0.05%、0.10%和0.20%浓度的黄原胶乳状液POV接近。在第5天时黄原胶乳状液的抗氧化作用显现。第10天0.50%黄原胶乳状液的POV为8.68 meq/kg。0.20%黄原胶乳状液的POV增大到6.76 meq/kg，0.10%黄原胶乳状液的POV最小，为5.22 meq/kg。
阿拉伯胶与黄原胶制备的乳状液相比，可以发现在相同浓度下，阿拉伯胶乳状液的POV低于黄原胶乳状液。阿拉伯胶乳状液的抗氧化性更强。0.10%黄原胶对乳状液的抗氧化性最佳，POV为5.22 meq/kg，而阿拉伯胶浓度为0.20%时，经过10 d储藏的乳状液的POV仅为2.35 meq/kg。黄原胶的增稠能力虽然高于阿拉伯胶，但是阿拉伯胶具有更优良的乳化效果，阿拉伯胶的乳化能力被归结于其中的半聚乳糖蛋白，疏水性蛋白残基嵌入油相，亲水性碳水化合物基团扩展到水相[21]。阿拉伯胶具有非常好的乳化特性，可以增强乳状液的黏度和稳定性，经常被用来作为乳状液的稳定剂。并且在比较宽的pH值范围内具有良好的稳定性[22]。加入多糖以后，乳状液的过氧化值均下降，说明蛋白-多糖复合乳状液的抗氧化效果优于单一蛋白为乳化剂制备的乳状液。
3 结论
本文利用大豆分离蛋白与多糖的相互作用，通过制备蛋白-多糖复合乳状液将灵芝孢子油包埋。通过研究阿拉伯胶和黄原胶的浓度对乳状液体系稳定性的影响，构建最佳的乳状液包埋体系。研究发现乳状液中加入一定量的多糖比单独的大豆分离蛋白制备的乳状液粒径分布更小且更加稳定。当加入阿拉伯胶和黄原胶后，乳状液ζ-电位的绝对值均呈现先增大后变小的趋势。随着多糖浓度的提升，灵芝孢子油乳状液离心稳定性呈现先上升再下降的趋势。与阿拉伯胶相比，黄原胶的增稠作用更强，对乳液离心稳定性的贡献更大。相较于蛋白乳状液，多糖-蛋白复合乳状液在储藏过程中的ζ-电位绝对值均有所增加，使分子之间的排斥电荷增大，稳定性增强。加入多糖后，乳状液的过氧化值均下降，并且加入阿拉伯胶后的乳状液的抗氧化效果优于黄原胶。当阿拉伯胶浓度为0.20%时，经过10 d储藏后，POV最低，为2.35 meq/kg；0.10%黄原胶的抗氧化效果最好，POV最小，为5.22 meq/kg。表明大豆分离蛋白-阿拉伯胶和大豆分离蛋白-黄原胶复合体制备的乳状液可以用于不饱和脂肪酸的包埋和保护。
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