氨基酸螯合钙现作为第三代补钙制剂，不仅解决了第一代补钙制剂（无机钙）难溶于水、利用率低、容易造成结石的问题，也避免了第二代补钙制剂（传统有机钙）钙含量低、毒副作用大的缺点，而且具有稳定性好、易吸收、在补充钙的同时还可以补充人体必需氨基酸等优点。相关研究[1]表明氨基酸螯合钙具有较高的生物利用性，因为作为配体的氨基酸具有保护钙离子的作用，避免了直接吸收钙离子对胃肠道造成的损伤，保持了钙离子的生理活性。
氨基酸螯合钙是氨基酸与可溶性钙离子反应生成的。当氨基酸与钙离子发生反应后，钙离子以白色晶体状吸附在氨基酸内部及表面，以配位共价键的方式结合。对于其结合方式，刘闪等[2]通过红外光谱扫描和电镜扫描观察表明，钙离子与胶原多肽发生了螯合反应，结合方式有离子结合、配位结合和吸附作用。
在功能特性方面，氨基酸螯合钙含有一定的游离氨基酸、多肽等，其生物利用度和活性功能会更强。杨贤庆等[3]测定了复合氨基酸螯合钙的总还原能力和3种自由基清除率，表明复合氨基酸螯合钙在一定浓度范围内，浓度越大，抗氧化能力越好；刘文颖等[4]通过体外胃肠道模拟消化试验表明海洋骨胶原低聚肽钙配合物具有一定的消化稳定性。
为了更深入地了解氨基酸螯合钙的结构及功能特性，本试验利用紫外光谱、红外光谱、扫描电镜对氨基酸螯合钙进行结构分析，通过DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率及总还原能力等指标测定其抗氧化活性，利用牛津杯试验法分析其抑菌性，最后通过模拟消化吸收试验考察对其胃肠道的稳定性，探究氨基酸螯合钙能否被人体更好地消化吸收。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
氨基酸螯合钙：山西农业大学畜产品加工实验室以驴骨泥为原料，通过酶解、发酵、螯合、冷冻干燥等工艺制备而成。其中未进行螯合反应的驴骨泥酶解物作为对照。
指示菌[金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）]：山西农业大学畜产品加工实验室保藏。
肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、琼脂 2.0 g、NaCl 0.5 g、水 100 mL、pH7.2、压力 0.10 MPa条件下灭菌20 min。
氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、无水乙醇（均为分析纯）：天津化学试剂一厂；胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）：广州齐云生物技术有限公司；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（tris hydrochloride，Tris-HCl）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
酸度计（PB-10）：瑞典Sartorius公司；电子恒温水浴锅（ZKW-4）：常熟市天量仪器有限责任公司；电子天平（LT-100型）：北京中兴伟业公司；离心机（ST40R）：德国Theromo Scientific公司；分析天平（CPA）：北京赛多利斯仪器系统有限公司；压力蒸汽灭菌锅（BL-50立式）：上海东亚压力容器制造有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1800）、傅里叶红外光谱仪（affinity-1）：日本岛津公司；扫描电镜（S-3400N）：日本Hitachi公司。
1.3 方法
1.3.1 氨基酸螯合钙的结构表征
1.3.1.1 红外光谱分析
参照林慧敏[5]的方法进行红外光谱分析。使用傅里叶红外光谱仪记录400 cm-1～4 000 cm-1的光谱，分辨率为4 cm-1，扫描数为32。
1.3.1.2 紫外扫描分析
参照陈孟等[6]的方法进行紫外扫描分析。分别对氨基酸螯合钙和酶解物溶液进行紫外光谱扫描，扫描范围210 nm～400 nm。
1.3.1.3 扫描电镜分析
参照付文雯[7]的方法进行电镜扫描。将样品用导电双面带固定在金属样品平台上，将其置于离子溅射仪器的样品室中，在15mA的电流下喷金90s后进行观察。
1.3.2 氨基酸螯合钙抗氧化活性测定
用蒸馏水将得到的氨基酸螯合钙和酶解物分别配制成 2、4、6、8、10 mg/mL 的溶液，测定 DPPH 自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率及总还原能力。
1.3.2.1 DPPH自由基清除率的测定
参照GARCÍA-MORENO等[8]的方法并稍作改进。用无水乙醇配制1×10-4mol/L DPPH溶液，避光冷藏，将待测样品稀释10倍～100倍；将2 mL测试样品溶液与2 mL DPPH溶液加入到同一试管中，摇匀，避光反应30 min后，测定波长517 nm处吸光度Ai；同时测定2 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度A0，以及2 mL测试样品溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度Aj。DPPH自由基清除率计算公式如下。
1.3.2.2 羟基自由基清除率的测定
采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[9-10]。依次准确移取等体积（1 mL）的 2 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L 水杨酸溶液、6 mmol/L H2O2溶液，混合摇匀后快速在510 nm处测定吸光度A0值。在反应体系中加入1 mL样品溶液，摇匀后立即测定吸光度Ai值。计算公式如下。
1.3.2.3 超氧阴离子自由基清除率
采用邻苯三酚自氧化法[11-12]，稍作改进。依次准确移取 5.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.2），置于 25℃水浴20min后，分别加入0.5 mL蒸馏水和0.5 mL 2.5 mmol/L邻苯三酚溶液，混合均匀后在25℃水浴反应5 min。立即用1 mL 8 mmol/L HCl溶液终止反应，在299 nm处测吸光度A0，在反应体系中加入不同浓度待测样品溶液0.5 mL，摇匀后立即测定吸光度Ai值。计算公式如下。
1.3.2.4 总还原能力的测定
参照陈英等[13]的方法并稍作改进。取2 mL待测样品溶液，依次加入2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）、2 mL 1.0%K3[Fe（CN）6]，空白用蒸馏水代替样液，置于具塞试管中，迅速混匀，置于50℃水浴中反应20 min，冰水冷却，再加2 mL 10%三氯乙酸，混匀后，取2 mL上清液，加2 mL蒸馏水和0.4 mL 0.1%FeCl3，混匀，测定各样品在700 nm下的吸光度Ai值。
1.3.3 抑菌性测定
抑菌性能利用牛津杯法进行。牛津杯试验法按照参考文献[14-15]的方法并稍作改进。
1）样品的制备：取氨基酸螯合钙用蒸馏水溶解，配制成浓度为 5、10、30、50 mg/mL 的溶液。
2）供试菌悬液制备：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌接种到肉膏蛋白胨培养基中活化两次，使菌悬液浓度达到 6 lg（CFU/mL）～7 lg（CFU/mL）备用。
3）平皿的制备：将配制好的肉膏蛋白胨培养基冷却至50℃～60℃，倾注于经干热灭菌的培养皿内，待培养基凝固后备用。
4）涂平皿：用灭菌移液枪头分别吸取0.20 mL供试菌悬液于平皿内，用无菌涂布器将菌液涂布均匀，放置片刻。
5）用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯在酒精灯上迅速灼烧后放到含菌平板上，轻轻按压使每个牛津杯杯底与培养基连接紧凑，每个平板等距放入3个牛津杯，其中两个牛津杯用移液枪加入0.20 mL的氨基酸螯合钙溶液，另一个牛津杯加入0.20 mL无菌生理盐水作对照，每种抑菌液做3个重复。然后将平皿正置放入4℃冰箱10 h使其扩散，再于37℃恒温箱培养，培养24 h后观察并测量抑菌圈大小。
1.3.4 氨基酸螯合物体外模拟消化吸收试验
体外胃肠模拟消化方法参照汪婧瑜[16]的方法并稍作修改。
1.3.4.1 胃模拟消化试验
称取制备好的螯合物，用蒸馏水溶解，配制浓度为1.0 mg/mL溶液。再用1 mol/L的盐酸调pH值至2.0，37℃预热5 min后加入4%（酶/底物）胃蛋白酶，37℃水浴模拟胃消化过程，振荡2.0 h后取出反应液，沸水浴灭酶5 min，冷却至室温25℃后，5 000 r/min离心10 min，取上清液利用EDTA络合滴定法分别测定上清液中钙离子含量和溶液中总钙含量。
1.3.4.2 肠模拟消化试验
将胃消化2.0 h的消化液，用1.0 mol/L NaOH调至pH7.4，按4%（酶/底物）的比例加入胰蛋白酶。37℃水浴模拟肠消化过程，2.0 h后沸水浴灭酶5 min，冷却至25℃后，8 000r/min离心10min，取上清液按照EDTA络合滴定法分别测定上清液中钙离子含量和溶液中总钙含量。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2007软件对试验数据进行统计分析，并应用Origin Pro 8.0绘图软件制图。
2 结果与分析
2.1 氨基酸螯合钙的结构表征试验结果分析
2.1.1 氨基酸螯合钙与酶解物的红外光谱分析
图1为氨基酸螯合钙与酶解物的红外光谱对比图。
图1 氨基酸螯合钙与酶解物的红外光谱分析
Fig.1 Infrared spectrum analysis of amino acid chelate calcium and enzymatic lysates
红外光谱整个范围可分为两个区域，波数为1 300 cm-1～4 000 cm-1的区域称为官能团区，在这个区域内可以区别不同官能团的特征吸收峰。波数为600 cm-1～1 300 cm-1的区域称为指纹区，此区的吸收峰多而密，且比较复杂，能反映整个分子的特征，因此可作为判断分子结构的佐证[17]。从图1可以看出，氨基酸螯合钙的红外光谱较酶解物的红外光谱发生了明显变化。由酶解物的红外光谱可知，在特征区，-NH2的吸收峰在3 276.55 cm-1，C=O吸收峰在1 652.44 cm-1，-COO-的吸收峰在1 462.32 cm-1；对比酶解物的红外光谱图，可以发现氨基酸与钙进行螯合后，整个波形发生了移动。在特征区，氨基的伸缩振动吸收峰（N—H）红移到了3 263.55 cm-1，说明氨基酸中的N—H键发生了化学变化；1 652.44 cm-1附近是酰胺Ⅰ带的C=O伸缩振动，螯合后蓝移到1 653.29 cm-1，-COO-发生了伸缩，移动到1 404.65 cm-1，说明氨基酸的羧基和氨基均参与了螯合反应。同时官能团的特征吸收峰强度的改变与位置的移动证明了螯合反应后有新物质的生成。指纹区922.16 cm-1的吸收峰是O-H面内变形振动和磷酸基团的变化引起的，说明含有游离的-COOH。氨基酸螯合钙图谱中此吸收峰消失，表明不存在游离的-COOH，推测其与钙离子以共价键的方式结合，由此进一步证实反应产物确实为氨基酸螯合钙。
2.1.2 氨基酸螯合钙与酶解物的紫外光谱分析
图2为氨基酸螯合钙与酶解物的紫外光谱分析。
图2 氨基酸螯合钙与酶解物的紫外光谱分析
Fig.2 Ultraviolet spectrum analysis of amino acid chelate calcium and enzymatic lysates
物质结构的改变导致紫外扫描光谱图中官能团的特征吸收峰的波长与吸收强度发生变化，所以采用紫外光谱分析能初步判断是否有新物质的生成[18-19]。由图2所示，氨基酸螯合钙与酶解物的紫外吸收光谱发生了明显的改变。氨基酸螯合钙较酶解物而言，其最大吸收峰从205.0 nm移到了213.5 nm，吸收峰尖而窄，且吸光度值显著增强，由2.88增强到4.69。研究表明氨基酸和钙发生螯合时，螯合物的生成会使其配位体对光吸收性能发生改变，相应原子的价电子发生跃迁，所需要的跃迁能量高于原反应物，因此，伴随着新物质即氨基酸螯合钙的生成，物质结构发生改变，官能团的特征吸收峰的波长增加，吸收强度增强。
2.1.3 氨基酸螯合钙的电镜扫描分析
图3为氨基酸螯合钙电镜扫描图。
图3 氨基酸螯合钙电镜扫描图
Fig.3 Scanning electron microscopy of amino acid chelate calcium
a.100倍；b.100倍；c.50倍。
研究显示氨基酸与钙之间通过离子结合、配位结合及一定的吸附作用发生螯合，钙离子以白色晶体状吸附在氨基酸内部及表面[2]。由图3可以看到，钙离子以白色颗粒的形式镶嵌在氨基酸中，还有一部分吸附在氨基酸表面，因此通过扫描电镜从物质微观结构层面，再次证明了氨基酸螯合钙的形成。付文雯[7]对牛骨胶原多肽螯合钙的电镜扫描图也显示由于多肽与钙之间的吸附作用，多肽表面“镶嵌”着白色晶体。
2.2 氨基酸螯合钙抗氧化试验结果
2.2.1 氨基酸螯合钙DPPH自由基清除率
图4为氨基酸螯合钙与酶解物对DPPH自由基的清除率。
图4 氨基酸螯合钙与酶解物对DPPH自由基的清除率
Fig.4 DPPH radical clearance rate of amino acid chelate calcium and enzymatic lysates
由图4可知，氨基酸螯合钙对DPPH自由基具有一定的清除作用，且相同浓度下，氨基酸螯合钙对DPPH自由基清除能力高于酶解物。特别是在较低浓度表现明显：当浓度为2 mg/mL时，氨基酸螯合钙对DPPH自由基清除率是酶解物的2.2倍。氨基酸螯合钙和酶解物DPPH自由基清除率的IC50值分别为0.13、6.21 mg/mL。可见氨基酸螯合钙抗氧化能力高于酶解物。表明钙离子螯合活性与其抗氧化特性存在关联，这与杨贤庆等[3]的研究结果一致。
2.2.2 氨基酸螯合钙羟基自由基清除率
图5为氨基酸螯合钙与酶解物对羟基自由基的清除率。
图5 氨基酸螯合钙与酶解物对羟基自由基的清除率
Fig.5 The scavenging rate of hydroxyl radical by amino acid chelate calcium and enzymatic lysates
由图5可知，氨基酸螯合钙对羟基自由基具有一定的清除作用，且清除能力与浓度呈明显的量效关系。氨基酸螯合钙与酶解物的IC50值分别为2.40、15.22 mg/mL，可见，氨基酸螯合钙对羟基自由基的清除效果优于酶解物，并且当浓度为10 mg/mL时，其清除率分别为95.05%、44.40%，这表明经过螯合之后，产物对羟基自由基的清除率比之前提高了114%倍。
2.2.3 氨基酸螯合钙超氧阴离子自由基清除率
图6为氨基酸螯合钙与酶解物对超氧阴离子自由基的清除率。
图6 氨基酸螯合钙与酶解物对超氧阴离子自由基的清除率
Fig.6 The scavenging rate of superoxide anion radical by amino acid chelate calcium and enzymatic lysates
由图6可知，随着浓度的增大，氨基酸螯合钙对超氧阴离子自由基的抑制效果也不断增强。相同浓度下，氨基酸螯合钙对超氧阴离子自由基的清除率均高于酶解物。酶解物IC50值为13.95 mg/mL，氨基酸螯合钙IC50值为2.77 mg/mL，但较其对羟基自由基的清除效果（IC50为2.40 mg/mL）则略差一些，可能是因为具有超氧阴离子自由基清除活性的氨基酸残基还没有暴露出来。而氨基酸螯合钙对DPPH自由基的清除效果最好，其IC50值为0.13 mg/mL。
2.2.4 氨基酸螯合钙总还原能力
图7为氨基酸螯合钙与酶解物的总还原能力。
图7 氨基酸螯合钙与酶解物总还原能力
Fig.7 The total reducing capacity of amino acid chelate calcium and enzymatic lysates
从图7中可以看出，氨基酸螯合钙和酶解物的总还原能力与其浓度呈正相关，均随着浓度的增加呈上升趋势，且氨基酸螯合钙的总还原能力较酶解物高，当浓度为10 mg/mL时，氨基酸螯合钙的总还原能力是酶解物的1.31倍。
2.3 氨基酸螯合钙抑菌性
通过测定氨基酸螯合钙对3种供试菌的抑菌活性来研究其对细菌的抑菌效果。图8为抑制效果图，表1为氨基酸螯合钙对3种供试菌的抑菌圈直径测定结果。
图8 3种供试菌的抑菌活性
Fig.8 The antibacterial activity of three tested strains
A～C分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌，1～4分别为5、10、30、50 mg/mL的氨基酸螯合钙，5为阴性对照。
表1 3种供试菌的抑菌活性
Table 1 The antibacterial activity of three tested strains
注：－表示抑菌效果不明显。牛津杯直径为6.00 mm，抑菌圈直径为6.00 mm时表示该菌在牛津杯内无菌生长。
氨基酸螯合钙浓度/（mg/mL）抑菌圈直径/mm 空白对照金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 沙门氏菌5----10 8.09±0.06 7.11±0.20 - -30 11.16±0.20 10.09±0.04 8.02±0.01 -50 13.53±0.08 11.72±0.03 9.48±0.11 -
由表1可知，氨基酸螯合钙对3种供试菌均有抑制作用。当氨基酸螯合钙浓度为50 mg/mL时，抑菌圈（9.48 mm～13.53 mm）均很明显；浓度为30 mg/mL时，抑菌圈直径在8.02mm～11.16mm；当浓度为10mg/mL时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌圈直径在7.11 mm～8.09 mm，当浓度为5 mg/mL时，抑菌圈直径均小于7 mm，认为其抑菌效果不明显。3种供试菌比较，氨基酸螯合钙对金黄色葡萄球菌的抑制效果强于对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制效果。夏松养等[20]发现，螯合作用增加了反应产物的电子受体和电子供体数量，改善了螯合物环状结构的电子分布，显著增强了电子缓冲能力，进而使抑菌作用得以加强。
2.4 模拟胃肠道消化试验结果
钙离子主要在人体肠道内（十二指肠和空肠上端黏膜）被吸收利用[21]，游离态的钙离子易与OH-形成沉淀，降低生物利用率，而以螯合形式存在的钙离子具有较好的吸收性[22]。图9为氨基酸螯合钙在消化过程中钙离子溶解率的变化。
图9 氨基酸螯合钙在消化过程中钙离子溶解率的变化
Fig.9 The change of the dissolution rate of calcium ions in the process of digestion
由图9可知，消化前，游离钙离子含量为12.67%，经过胃蛋白酶2 h消化后，氨基酸螯合钙的钙溶解率达到90.38%。只有极小部分存在于氨基酸螯合钙中未溶出，表明在模拟胃环境中钙释放性能良好且具有一定的耐受性。而经肠消化后，钙离子溶解率为42.50%。刘文颖等[4]也有相似的报道。钙离子溶解率下降的可能原因：1）肠道的碱性环境使钙离子与OH-结合生成氢氧化钙，沉淀于肠道壁，降低了溶解率；2）H+浓度下降和pH值的升高增强了钙离子与肠道中氨基酸中羧基和氨基的螯合能力，使得游离态的钙离子再次被螯合形成配位键较为稳定的氨基酸螯合物[23]。
3 结论
本试验对氨基酸螯合钙的结构与功能特性进行研究，结论如下：1）对螯合产物进行紫外光谱、红外光谱及扫描电镜分析，确证了氨基酸螯合钙的形成。2）氨基酸螯合钙对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基均具有较好的清除率，且对DPPH自由基的清除能力最强。总还原能力随浓度的增加而增大，与未发生螯合反应的酶解物比较，氨基酸与钙螯合后抗氧化性显著增强。3）氨基酸螯合钙对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均具有抑菌作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳。4）体外模拟胃肠道消化结果发现经胃消化后钙溶解率达到90.38%，后经肠道消化后，钙溶解率维持在42.50%。
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