花生（Arachis hypogaea L.）又名长生果、金果等多种别名，是我国四大油料作物之一。花生营养丰富，含有8种脂肪酸[1]，约25.8%的蛋白质、49.2%的脂质、16.1%的碳水化合物、6.5%的水分和2.3%的灰分[2]。花生中具有十分丰富的生物活性成分，经常食用花生可以改善脑血管功能，增强记忆力[3]。花生芽是花生经过发芽后的一种兼具食疗功能的食品，其不需要接触外界的气候、营养以及土壤，也不需要打药施肥，能将自身所储存的养分形成营养物质，是真正的绿色食品[4]。花生芽口感香甜、鲜嫩爽脆，富含多种维生素与微量元素，以及易于被人体吸收的脂肪、植物蛋白质等有益成分[5]。研究表明，花生发芽过程中脂肪酸组成有明显的变化，不饱和脂肪酸先降低，而后又呈现增加的趋势[6]，油脂转化为热量，脂肪含量下降，微生物含量有所上升，营养更加丰富，易被人体吸收，有促进智力发育、延缓衰老等多种功效[7]。
超声波的频率大于20 kHz，是功能食品领域的新兴技术，可以有效地改变蛋白质分子结构[8]。超声波产生的机械效应和空化作用，可以使蛋白质功能特性发生改变[9]。超声波具有动能，可刺激种子提高发芽率和发芽势，促进生长和缩短作物的成熟期限[10]。超声处理使得酪蛋白的起泡性和乳化性有所改善，可能是超声波使酪蛋白分子内的螺旋结构部分展开[11]。也有研究发现超声处理后花生蛋白的表面疏水性增加，乳化性能也有所提高，其原因可能是超声诱导蛋白质暴露出更多的疏水基团[12]。
本文拟以超声作为处理手段诱导花生发芽，对超声处理前后花生芽的感官指标、理化指标、蛋白酶活及蛋白组分进行检测比较，研究超声处理对花生芽品质的影响。
1 材料与方法
1.1 原料、试剂及仪器设备
1.1.1 材料与试剂
花生（阜花23）：市售；次氯酸钠、苯酚、三氯乙酸（分析纯）：西陇科学股份有限公司；亚甲基蓝指示剂（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；丙酮（分析纯）、聚丙烯酰胺凝胶试剂盒：国药集团化学试剂有限公司；β-巯基乙醇（分析纯）、低分子量蛋白Marker：北京海利克思科技有限公司。
1.1.2 仪器设备
RDN-300G植物生长箱：宁波东南仪器设备有限公司；KQ-300VDE超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；L500离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；紫外可见分光光度计UV-5100：上海元析仪器有限公司；LGJ-25C真空冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；mini-PROTEAN垂直板电泳仪：美国Bio-Rad公司；AI600UV超灵敏多功能成像仪：GE分析仪器公司。
1.2 试验方法
1.2.1 超声诱导花生发芽工艺
花生进行筛选除杂，每次选取颗粒饱满的100颗花生种子，用体积分数为1%的次氯酸钠浸泡消毒20min，再用去离子水冲洗3次后将花生置于盛有清水的超声容器中进行处理，超声参数设置为35℃、30 min、240 W、100 kHz。以未被超声处理的种子作为对照。在27℃于黑暗条件下浸泡6 h，之后将种子放置在托盘上，底部铺上滤纸，盖上纱布在植物生长箱中进行发芽。早晚进行消毒清洗，每隔24 h取样。发芽时间共120 h，试验重复3次。鲜样用去离子水润洗数次并吸干表面水分后用于测定理化指标。另一部分样品进行冷冻干燥，磨粉备用[13]。
1.2.2 花生芽感官指标测定
邀请10名感官评定人员组成评定小组，分别对鲜花生芽进行评分，其中色泽20分、外观30分、口感及滋味30分，气味20分，计算总分。花生芽感官评分标准见表1。
表1 花生芽感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standard of peanut sprout
指标 特征 评分色泽 花生根茎洁白 16～20（20分） 花生根茎浅黄 11～15花生根茎暗黄 0～10外观 根茎粗壮、主根清晰、须根少、无腐烂、无杂质 21～30（30分） 根茎粗壮、主根清晰、有须根、部分腐烂和杂质 11～20根茎纤细、主根不清晰，须根多，有腐烂和杂质 0～10口感 口感清淡爽脆、香甜可口 21～30及滋味 口感较爽脆、香甜 11～20（30分） 口感软嫩、苦涩 0～10气味 具有花生的清香味，无异味 16～20（20分） 无有花生的清香味或有异味 11～15无花生的清香味，有异味 0～10
1.2.3 花生芽理化指标测定
发芽率以根部突破种皮3 mm以上为标准；芽长采用游标卡尺测定；参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定含水率；参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》测定灰分含量；参照GB/T 5009.10—2003《食品安全国家标准植物类食品中粗纤维的测定》测定粗纤维含量；参照苯酚-硫酸法测定总糖含量；参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定粗脂肪含量；参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》检测粗蛋白含量。
1.2.4 蛋白酶活性检测
鲜花生样品与50 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH7.4，含 1%聚乙烯吡咯烷酮、10 mmol/L β-巯基乙醇、1 mmol/L 乙二胺四乙酸）按照 1∶8（g/mL）的料液比在0℃下充分研磨混匀，4℃离心30 min，用上清液检测酶活力。取1 mL浓度为2%的酪蛋白溶液和1 mL的样品提取物在40℃条件下静置30 min，在沸腾的水浴下静置5 min，冷却后加入3 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）溶液充分反应15 min，离心测定上清液在275 nm处的光密度（optical density，OD）值，未加入TCA溶液的样品为空白。增加的OD值即为酶活值，数值每提高0.01即为增加为一个酶活力单位[13]。
1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析空白组和超声组花生芽蛋白组分的变化。将花生粉末与丙酮以1∶10（g/mL）的料液比进行混合，在4℃磁力搅拌脱脂2 h，之后在4℃条件下以8 000 r/min离心30 min，得沉淀。所得沉淀再重复脱脂3次～4次。脱脂的花生粉与蛋白上样缓冲液混合，上样量为10 μL，低分子量蛋白Marker的上样5 μL，选用12%的分离胶和5%的浓缩胶。设定电泳条件为80、120 V，时间分别为40 min和3 h。电泳结束后，进行染色和脱色，最后用凝胶成像系统进行拍照，对蛋白电泳凝胶图像进行分析。
2 结果与分析
2.1 花生芽感官评价结果
花生芽感官评价结果见表2。
表2 花生芽感官评价结果
Table 2 Sensory evaluation results of peanut sprout
组别 色泽 外观 口感 气味 总分空白组 16.25 25.05 28.00 18.47 87.77超声组 19.06 27.37 27.35 18.54 92.32
由表2所示，发芽5 d的两组花生芽在感官方面无显著差异。花生芽口感爽脆、香甜可口，具有花生的清香味。超声组的根茎较为粗壮，无感染杂菌情况。有研究表明，超声处理具有灭菌的作用，且不会改变食品的风味、质地、颜色、味道和营养成分[8]。
2.2 超声处理对花生芽理化指标的影响
2.2.1 花生发芽过程发芽率和芽长的变化
空白组与超声组发芽过程中发芽率变化见图1，空白组与超声组发芽过程中芽长变化见图2。
图1 空白组与超声组发芽过程中发芽率变化
Fig.1 Changes of germination rate during germination in blank group and ultrasonic group
图2 空白组与超声组发芽过程中芽长变化
Fig.2 Changes of sprout length during germination in blank group and ultrasonic group
不同字母表示显著差异（p<0.05）。
由图1、图2可知，两组花生在发芽过程中发芽率及芽长均显著增加。发芽5 d时空白组的发芽率为（88.81±3.49）%，超声组则达到了（96.59±0.96）%。芽长在发芽第1天缓慢增长，空白组为（2.55±0.39）mm，超声组为（4.21±0.60）mm。2 d～4 d芽长增加显著，在第5天空白组增长到（27.26±1.92）mm，超声组增长到（32.25±2.49）mm，超声组明显高于空白组，且超声组第4天的芽长已高于空白组第5天的芽长。表明适当的超声处理明显促进了花生种子的萌发，其原因是超声波使得细胞膜发生振动，打破种子的休眠，能量传递到种子中，细胞膜和细胞壁的通透性增强，种子内淀粉酶和其他关键的酶活性增强，从而促进种子的新陈代谢和萌发[13]。
2.2.2 花生发芽过程中水分含量的变化
空白组与超声组发芽过程中水分含量变化见图3。
图3 空白组与超声组发芽过程中水分含量变化
Fig.3 Changes of water content during germination in blank group and ultrasonic group
由图3可知，种子中的水分含量在4%左右。发芽第1天种子快速吸水，空白组达到（34.59±3.44）%，超声组达到（40.55±2.17）%。发芽2 d～5 d水分增加趋于平缓，5 d后空白组为（63.68±1.41）%，超声组为（81.32±3.54）%。两组差异的原因是种子在发芽过程中不断吸水，使得水分含量上升，而超声波的空化、振动作用也使得种子的种皮更加软化，膜通透性增加，从而更利于吸水[15]。
2.2.3 花生发芽过程中灰分和粗纤维含量的变化
空白组与超声组发芽过程中灰分含量变化见图4，空白组与超声组发芽过程中粗纤维含量变化见图5。
图4 空白组与超声组发芽过程中灰分含量变化
Fig.4 Changes of ash content during germination in blank group and ultrasonic group
图5 空白组与超声组发芽过程中粗纤维含量变化
Fig.5 Changes of crude fiber content during germination in blank group and ultrasonic group
由图4、图5可知，空白组与超声组的灰分和粗纤维含量均呈现逐渐增加的趋势且超声组略高于空白组。空白组的灰分由（2.31±0.08）%增长到（2.51±0.03）%，超声组增长到（2.75±0.05）%；空白组的粗纤维由（3.45±0.28）%增长到（11.14±0.24）%，超声组增长到（12.54±0.29）%。相关研究表明花生在发芽过程中，维生素、钾、钙、铁、锌等微量元素的含量都逐渐增加[7]，一定程度的超声处理，可以改善花生芽的品质，增加营养成分的含量[16]。其原因是超声处理使温度升高，膜的通透性改变，促使某些关键酶活性增加，种子内部储存的营养成分分解，快速合成新的营养物质[17]。在发芽过程中，长出的根部也提高了纤维含量[13，18]。
2.2.4 花生发芽过程中总糖含量的变化
空白组与超声组发芽过程中总糖含量变化见图6。
图6 空白组与超声组发芽过程中总糖含量变化
Fig.6 Changes of total sugar content during germination in blank group and ultrasonic group
由图6所示，总糖含量呈现波动趋势。空白组由（12.26±0.55）%降低至 （10.60±0.54）%后又增加到（13.99±0.42）%，而超声组则缓慢增加至（15.92±0.76）%。糖为发芽提供能量[18]，也是容易被利用的一类碳水化合物，有研究表明可溶性糖的增加是由于淀粉的水解[19]。林海的研究表明在超声处理国槐种子后，作物根系中的可溶性糖和可溶性蛋白质均增加[20]，本研究结果与之相似。
2.2.5 花生发芽过程中脂肪含量的变化
空白组与超声组发芽过程中脂肪含量变化见图7。
图7 空白组与超声组发芽过程中脂肪含量变化
Fig.7 Changes of fat content during germination in blank group and ultrasonic group
脂肪是花生中含量最丰富的营养物质，同时也是花生发芽的营养指标之一。如图7可知，花生发芽过程中脂肪含量大幅度降低，空白组由（54.13±0.76）%降低至（40.16±2.11）%，而超声组则下降至（35.61±1.34）%，这与王小燕的研究结果相似[21]。脂肪降低原因是发芽过程中油脂通过转化为热量，而适宜的超声波促进了细胞内产生微流，加强细胞膜和细胞壁的透性，从而加强细胞的新陈代谢能力[13，22]。
2.2.6 花生发芽过程中粗蛋白含量的变化
空白组与超声组发芽过程中粗蛋白含量变化见图8。
图8 空白组与超声组发芽过程中粗蛋白含量变化
Fig.8 Changes of crude protein content during germination in blank group and ultrasonic group
由图8可知，两组粗蛋白含量均呈现波动趋势。在4 d时两组都到达最大值，空白组为（27.32±0.34）%，超声组为（28.71±0.76）%。花生发芽过程中蛋白质在蛋白酶的作用下分解为氨基酸[17]，氨基酸又参与组成新细胞[21]，所以花生发芽过程是一个波动的动态过程。
2.3 花生蛋白酶活性分析
花生发芽过程中总蛋白酶活力的变化见表3。
表3 花生发芽过程中总蛋白酶活力的变化
Table 3 Changes of total protease activity during peanut germination
发芽时间/d蛋白酶活力/（U/g）空白组 超声组0 75.74±0.17 89.15±0.08 1 94.40±0.18 98.83±0.10 2 112.64±0.05 159.99±1.14 3 143.19±0.05 168.56±0.07 4 208.69±0.04 229.34±0.06 5 262.39±0.10 290.10±0.25
如表3所示，两组样品在发芽过程中的酶活均显著增加，空白组由（75.74±0.17）U/g增加至（262.39±0.10）U/g，超声组由（89.15±0.08）U/g增加至（290.10±0.25）U/g。花生种子中的蛋白酶活力较低，经超声处理后虽未经发芽，酶活力却明显增高，其原因是超声波的空化作用使能量聚集，使得热效应和化学效应加强，导致蛋白质结构改变，种子细胞内部的物质发生氧化还原等活动，使得大分子蛋白质水解加剧。酶活性增强促进花生芽新陈代谢，使得花生芽加速生长，营养物质分解合成速率加快[13]。
2.4 花生发芽过程中蛋白组分的变化
发芽0～3 d的空白组与超声组花生芽SDS-PAGE电泳图见图9，发芽4 d～5 d的空白组与超声组花生芽SDS-PAGE电泳图见图10。
图9 发芽0～3 d空白组与超声组花生芽SDS-PAGE电泳图
Fig.9 SDS-PAGE electrophoretogram of peanut sprouts in 0-3 d after germination
M.低分子量蛋白 Marker；1.花生种子；2.超声处理花生种子；3.空白组发芽 1 d；4.超声组发芽 1 d；5.空白组发芽 2 d；6.超声组发芽 2 d；7.空白组发芽3 d；8.超声组发芽3 d。
图10 发芽4 d～5 d空白组与超声组花生芽SDS-PAGE电泳图Fig.10 SDS-PAGE electrophoretogram of peanut sprouts in 4 d-5 d after germination
M.低分子量蛋白 Marker；1.空白组发芽 4 d；2.超声组发芽 4 d；3.空白组发芽5 d；4.超声组发芽5 d。
如图9、图10所示，随着发芽时间的增长，空白组35 kDa～70 kDa之间的条带在1 d～3 d之间条带颜色变化不是很明显，而超声组条带颜色逐渐变浅，两组花生到第5天的时候条带颜色几乎消失。其原因主要是蛋白质在发芽过程中水解成为小分子蛋白，而超声波的空化作用使得水解速度加剧，因此这个区间内的蛋白含量骤减。
3 结论
试验研究了超声诱导阜花23花生发芽，探究自然发芽的花生芽和超声诱导花生芽的感官指标、理化指标、蛋白酶活性及蛋白组分的变化。结果表明两组花生芽均呈洁白芽状，口感清淡爽脆、香甜可口，具有花生的清香味。超声组花生芽发芽率、芽长、水分含量、灰分含量、粗纤维含量、总糖含量、粗蛋白含量均高于空白组花生芽；粗脂肪含量低于空白组。总蛋白酶活也有所提高，促进花生芽新陈代谢，加速生长，营养物质分解合成速率加快。电泳结果表明花生发芽之后大分子蛋白逐渐水解为小分子蛋白，超声处理使水解速度加快。
综上可知，超声处理可以在保障花生芽产量和质量的前提下，缩短发芽时间且提高花生芽品质。然而，本试验只讨论了超声对花生芽营养因子的影响，并未对抗营养因子例如花生中的致敏蛋白进行深入研究，花生营养丰富的同时也具有很强的致敏性，这是花生加工利用方面的一个关键阻碍点，之前有研究表明超声可以加快花生芽中致敏蛋白下降的速率，本课题组将针对此部分内容开展进一步的深入研究。
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