鲈鱼具有生长速度快、抗病能力强、适应性强等特点，其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱，是许多国家重要的经济鱼类[1]。目前鲈鱼以鲜销为主，产品形式单一，有待进一步开发精深加工的多元化鲈鱼制品[2]。由于鲈鱼具有丰富的营养价值以及高含水量，鲈鱼制品在贮藏加工过程中易变质腐败，影响食用品质并造成经济损失。因此，延长鲈鱼制品的保鲜期，保证其质量安全显得尤为重要[3]。
在肉类食品保鲜中，化学防腐剂是最常用的方法之一，但考虑到化学防腐剂的残留安全性等问题，人们对天然生物防腐剂的需求不断增加[4]。乳酸链球菌素（nisin）是一种由食用级细菌乳酸链球菌产生的具有34个氨基酸残基的多肽[5]，对革兰氏阳性菌有抑制作用[6]，是唯一被世界卫生组织批准使用的天然抗菌肽[7-8]。然而nisin对胰蛋白酶敏感，其Lys12和Lys22是胰蛋白酶的作用位点，胰蛋白酶的水解作用可使nisin的抑菌活性降低甚至丧失[9-10]。鱼糜等肉制品中存在较丰富的内源类胰蛋白酶，因此，抑制胰蛋白酶的活性对nisin的稳定性至关重要。目前，加热、高压、调节pH值、使用酶抑制剂等是抑制或消除食品内源酶活性的常用方法。然而，多肽或蛋白质类酶抑制剂在食品中的应用却鲜有报道，寻找高效的天然来源的蛋白酶抑制剂，对于解决内源酶引起的食品品质下降问题具有重要的现实意义。荞麦胰蛋白酶抑制剂（buckwheat trypsin inhibitor，BTI） 由 69 个氨基酸残基组成，对胰蛋白酶具有很强的抑制作用[11-13]。BTI源于荞麦，且具有较好的热及酸碱稳定性，有望开发应用于食品加工。
本试验以明胶和壳聚糖为基本组分，通过添加乳酸链球菌素以及不同含量的BTI制备涂膜保鲜剂，通过菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量、pH 值、蒸煮损失率等质量指标，研究了BTI和nisin的涂膜剂对鲈鱼鱼糜的保鲜效果。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与仪器
鲈鱼：市售；壳聚糖（中黏度 200 mPa·s～400 mPa·s）：山东西亚化学股份有限公司；明胶：河南万邦实业有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、三羟甲基氨基甲烷[tris （hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris]、Ni2+-NTA亲和层析柱、NaCl、咪唑、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺：生工生物工程（上海）股份有限公司；低分子质量标准蛋白：北京索莱宝科技有限公司。工程菌E.coli M15 pQE30-BTI：山西大学生物技术研究所蛋白质工程实验室构建保存。
TU-1810紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HW.SY21-KP4恒温水浴锅：北京市长风仪器仪表公司；SW-CJ-2F超净工作台：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；THZ-C-1恒温振荡培养箱：太仓市实验设备厂；HC-2518R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；BSA224S精密电子天平：德国赛多利斯公司；FA-25高速组织匀浆机：上海弗鲁克科技发展有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 BTI的诱导表达和纯化
将E.coli M15 pQE 30-BTI接至肉汤（lysogeny broth，LB）液体培养基，当培养至对数期时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，继续培养4 h后离心收集菌体。用Tris-HCl缓冲液（20 mmol/L pH7.5）悬浮菌体，超声破碎菌体后于80℃水浴锅中加热30 min，12 000 r/min离心20 min，收集上清即为蛋白粗品。用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化BTI，所用平衡缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.5，洗脱液为 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L 咪唑，pH7.5[14]。合并收集洗脱峰，用Sephadex G-25柱脱盐，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鉴定蛋白纯度后备用[15]。
1.2.2 涂膜保鲜剂的制备
配制1%的壳聚糖溶液（溶剂为1%醋酸）及5%的明胶溶液，将二者等体积混合后，加入甘油（2%）、nisin（0.05%）及不同质量分数的BTI（0%、0.004%、0.008%），充分混匀后，超声脱气20 min，备用。
1.2.3 肉样处理
将新鲜的鲈鱼肉制成肉末，加入1%（质量分数）的淀粉搅匀，称取20 g，做成肉糜，在不同保鲜液（BTI添加量分别为0%、0.004%、0.008%）中浸泡3 min后沥干，用保鲜膜包装，依次标记为A组、B组、C组，于4℃贮藏。以未经涂膜处理的样品为对照，记为CK组。分别在第0、2、4、6、8天取样测定样品的菌落总数、挥发性盐基氮、TBARS值、pH值、蒸煮损失率等指标。
1.2.4 菌落总数测定
称取1 g肉糜于无菌烧杯中，加入9 mL无菌生理盐水，匀浆。用无菌生理盐水以10为倍数进行系列稀释，取3个不同稀释梯度的样品液各100 μL涂布于平板计数琼脂培养基（plate count agar，PCA），在 37℃培养 48 h后统计菌落总数（total viable count，TVC），所有计数用 lg（CFU/g）表示[16]。
1.2.5 挥发性盐基氮测定
称取5g肉糜于锥形瓶中，加入50mL蒸馏水，搅匀，25℃恒温振荡30 min后过滤。取10 mL滤液与10 mL MgO（10 g/L）混悬液混合进行蒸馏，用10 mL含甲基红（2 g/L）和次甲基蓝（1 g/L）的硼酸吸收液（20 g/L）吸收蒸出物质，用10 mmol/L的标准盐酸进行滴定。用蒸馏水代替滤液作空白对照。按照公式（1）计算样品中TVB-N 的含量[17]。
式中：T和B分别为样品液和空白对照消耗标准盐酸溶液的体积，mL。
1.2.6 硫代巴比妥酸测定
称取5 g肉糜于烧杯中，加入12.5 mL 20%三氯乙酸和10 mL蒸馏水，10 000 r/min匀浆1 min后于4℃8000r/min离心10min，取2mL上清液与2mL20mmol/L硫代巴比妥酸溶液混合，沸水浴加热20 min后冷却至室温（25℃），测定532 nm处吸光度（A532nm），以蒸馏水代替滤液作空白对照[18]。TBARS值以每千克样品中丙二醛（malondialdehyde，MAD）的毫克数表示，按照公式（2）计算。
1.2.7 pH值的测定
称取2 g肉糜，加入20 mL蒸馏水，匀浆，用pH计测定混合液的pH值。
1.2.8 蒸煮损失率的测定
称取5 g样品，擦干肉样表面水分后称重并装入离心管中，盖紧盖子，置于70℃的水浴锅中加热30 min后立即用流水冷却至室温（25℃）。取出肉样，用吸水纸擦去肉样表面水分后称重，按照下式计算蒸煮损失率[19]。
式中：W0为蒸煮前样品的质量，g；W1为蒸煮后样品的质量，g。
1.2.9 数据处理
采用SPSS 17.0软件进行数据差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著；使用Microsoft Excel1 4.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 BTI的表达及纯化
经诱导表达及Ni2+-NTA柱亲和层析后，对纯化的BTI进行SDS-PAGE鉴定，结果见图1。
图1 BTI的SDS-PAGE图谱
Fig.1 SDS-PAGE pattern of BTI
M.低分子质量标准蛋白质；1.Ni2+-NTA亲和层析洗脱峰。
由图1可知，BTI（泳道1）在电泳图谱上显示单一条带，表明所得BTI纯度较高，达到了电泳纯。BTI制备方法简便易行，仅需一次亲和层析便可达到纯化目的，具有进一步开发应用的优势。
2.2 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中菌落总数的影响
菌落总数是衡量肉类腐败变质的一项重要参数，Al-Dagal等[20]提出水产品可食用的菌落总数上限是6 lg（CFU/g）。各组鲈鱼鱼糜贮藏期间的菌落总数变化如图2所示。
图2 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中菌落总数的影响
Fig.2 Effect of BTI content in coating preservative on total viable count of Lateolabrax japonicus surimi during storage
不同小写字母（a～c）表示组间显著性差异，P<0.05。
由图2可知，未经涂膜液处理的对照（CK）组的菌落总数在贮藏第4天时为5.45 lg（CFU/g），已接近可食用上限；只添加0.05%nisin的A组在第4天时菌落总数不到5.0 lg（CFU/g），在第6天时接近可食用上限，表明添加nisin可显著抑制细菌的生长（P＜0.05）；B组、C组的菌落总数在第7天～8天时才达上限。在贮藏第6天时，B组（BTI添加量为0.004%）和C组（BTI添加量为0.008%）的菌落总数均显著低于A组（未添加BTI组）；在第8天时，C组TAC值仍显著低于A组（P＜0.05）。以上结果表明BTI和nisin的联合使用较单独使用nisin涂膜液的抑菌效果加强，显著降低了鱼糜中细菌的生长速率。
2.3 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中TVB-N含量的影响
TVB-N指肉类在酶和细菌的作用下，由蛋白质或氨基酸分解产生的氨以及二甲胺、三甲胺等碱性含氮物质，是判断鲜肉新鲜性的重要指标。根据GB 2733—2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》规定，淡水鱼虾的TVB-N值不大于20 mg/100 g[21]。各组鲈鱼鱼糜贮藏期间的TVB-N含量变化如图3所示。
图3 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中TVB-N含量的影响
Fig.3 Effect of BTI content in coating preservative on TVB-N of Lateolabrax japonicus surimi during storage
不同小写字母（a～c）表示组间显著性差异，P<0.05。
由图3可知，CK组在贮藏第4天时，肉样中TVBN含量为15.17 mg/100 g，在第6天时，TVB-N含量就达到19.21 mg/100 g，已接近上限。而在相同贮藏时间时，A组、B组、C组中TVB-N含量均显著低于CK组（P＜0.05），3组在贮藏第8天时的TVB-N含量仍低于20 mg/100 g。以上结果与菌落总数结果一致，由于nisin的使用抑制了菌的生长，显著减缓蛋白质等的分解。第6天和第8天时样品组TVB-N含量呈现C组<B组<A组，表明随着BTI使用量增加，肉样中蛋白分解减缓。BTI减缓肉样蛋白分解的原因可能是BTI直接抑制了内源蛋白酶，或通过抑制蛋白酶对nisin的降解，增强了nisin的抑菌作用，间接降低了菌对蛋白质的降解作用。
2.4 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼贮藏过程中TBARS值的影响
TBARS值是指示肉类脂质氧化程度的重要指标之一[22]。各组鲈鱼鱼糜贮藏期间的TBARS值变化如图4所示。
图4 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中TBARS值的影响
Fig.4 Effect of BTI content in coating preservative on TBARS of Lateolabrax japonicus surimi during storage
不同小写字母（a～d）表示组间显著性差异，P<0.05。
由图4可知，涂膜保鲜剂的使用有效地降低了鲈鱼中TBARS值的增长速率，即延缓了鲜肉中脂质的氧化进程。虽然在储藏初期（第2天时）只有高剂量BTI添加组（C组）的TBARS值显著低于CK组，A组和B组的TBARS值与CK组无明显差别，但随着贮藏时间延长，在第4天、第6天及第8天时A组、B组、C组的TBARS值显著低于CK组（P＜0.05），而且添加了BTI的B组、C组的TBARS值均显著低于A组（P＜0.05）。据报道，壳聚糖中的羟基和氨基具有清除羟基自由基的能力[23]。Fan等[24]的研究发现，nisin修饰的一种纤维素（氨乙基羟丙基甲基纤维素）具有清除DPPH自由基的活性，而且清除活性随着nisin含量增加而增强。在本试验中，BTI与nisin的涂膜剂增强了鲈鱼鱼糜的抗氧化能力，但其作用机理需要进一步研究。
2.5 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中pH值的影响
肉样pH值的变化与贮藏过程中微生物生长繁殖产生的代谢物质有关，因此，pH值与肉糜新鲜度有密切关系[25]。各组鲈鱼鱼糜贮藏期间的pH值变化如图5所示。
图5 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中pH值的影响
Fig.5 Effect of BTI content in coating preservative on pH of Lateolabrax japonicus surimi during storage
不同小写字母（a～c）表示组间显著性差异，P<0.05。
与文献报道一致[3，26]，随贮藏时间的延长，各组鲈鱼鱼糜的pH值均呈现先下降后上升的趋势（图5）。这可能是由于鱼死后糖酵解作用使鱼体内剩余糖原分解为丙酮酸，导致样品最初pH值下降。然而随着贮藏时间的延长，鱼肉中滋生的微生物分解蛋白质产生碱性化合物，随着碱性物质含量不断积累，导致后期肉糜pH值升高[27]。在贮藏期间，A组、B组、C组的pH值均显著低于CK组（P＜0.05），且C组pH值显著低于A组，进一步表明BTI和nisin的联合使用可以有效抑制肉样中微生物的生长。
2.6 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中蒸煮损失率的影响
蒸煮损失率与肉的持水能力有关，是肌肉持水性的重要指标之一，通常蒸煮损失率较低的样品会获得更好的食用品质[28]。涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中蒸煮损失率的影响如图6所示。
图6 涂膜剂中BTI添加量对鲈鱼鱼糜贮藏过程中蒸煮损失率的影响
Fig.6 Effect of BTI content in coating preservative on cooking loss rate of Lateolabrax japonicus surimi during storage
不同小写字母（a～c）表示组间显著性差异，P<0.05。
由图6可知，随着贮藏时间延长，CK组的蒸煮损失率迅速增加，使用涂膜剂有利于降低鲈鱼的蒸煮损失率。在贮藏第2、4、8天时，添加nisin的A组蒸煮损失率显著低于CK组（P＜0.05），表明nisin的使用可有效降低肉样的蒸煮损失率，另外，添加0.008%BTI的C组蒸煮损失率显著低于A组（P＜0.05），进一步表明BTI与nisin结合使用更有利于持水能力的保持。持水能力的降低与肌肉细胞结构的破坏和蛋白质的降解有关[29]。BTI可以抑制内源蛋白酶并提高nisin的抑菌活性，因此，添加BTI有利于降低样品的蒸煮损失率。
3 结论与讨论
本试验以明胶和壳聚糖为基本组分，制备了添加乳酸链球菌素（nisin）和BTI的复合涂膜剂，并将其用于鲈鱼鱼糜保鲜研究。结果表明，仅添加nisin的涂膜保鲜剂可有效抑制样品中微生物的生长，并降低鱼糜贮藏期间的TVB-N含量、TBARS值和pH值，减少蒸煮损失，使鲈鱼鱼糜在4℃的保质期从4 d延长至6 d。而同时添加BTI和nisin的涂膜保鲜剂可以将鲈鱼鱼糜的保质期由6 d延长至7 d，抑菌效果更加明显，TVB-N含量等各项指标更优，具有更好的保鲜效果。nisin因安全性高、抑菌作用强被广泛应用于食品保鲜，然而鱼虾等水产品中的内源酶却使nisin的抑菌效果大打折扣。BTI可有效抑制鲈鱼内源胰蛋白酶活性，降低内源胰蛋白酶对nisin的分解作用，进而保护nisin的抑菌活性。BTI与nisin结合使用解决了nisin在应用中对蛋白酶敏感的问题，可有效抑制鲈鱼腐败变质，保持肉样新鲜度，延长鲈鱼冷藏货架期。
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