猕猴桃果酒是以新鲜猕猴桃果实或果汁为原料，经发酵而成的一种低度酒，由于其具有猕猴桃果香、酵香和醇香，风味独特并富含多种营养物质，在众多果酒产品中独树一帜，市场前景广阔[1-3]。果酒香气成分是果酒感官质量评价的重要指标，我国猕猴桃品种繁多，生产工艺多有不同，导致市售猕猴桃果酒风格各异，如何最大限度地保持果酒原有风味是提高果酒品质，增加产品附加值的重要途径[4-6]。有学者对不同酿酒酵母发酵猕猴桃果酒的香气物质、酿造工艺和品质评价开展了研究[7-9]，而有关不同品种猕猴桃果酒的系统研究相对较少。顶空固相微萃取技术（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）集浓缩、萃取、采样和进样于一体，不需有机溶剂，分析所需样品量少，通过与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用，可快速准确地对香气物质进行定性和定量分析，弥补了单一感官评价主观性强、无法定量的缺点[10-12]，现已发展成为挥发性物质分析测定最有效的手段之一，广泛应用于葡萄酒、茶叶等食品中香气物质的研究[13-15]。本研究拟采用顶空-固相微萃取技术结合GC-MS法分析8种市售猕猴桃果酒产品的香气成分，研究不同品种猕猴桃果酒在香气物质上的差异和规律，为猕猴桃果酒评价分级和酿造工艺升级提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料
猕猴桃果酒样品：市售，包括红心、贵长、秦美、软枣、徐香等猕猴桃品种，具体来源见表1。
表1 试验材料
Table 1 Samples information
序号 试验材料 产地1 “红心”猕猴桃果酒 贵州六盘水凉都2 “红心”猕猴桃果酒 贵州六盘水六枝3 “红心”猕猴桃果酒 四川苍溪4 “贵长”猕猴桃果酒 贵州修文5 “软枣”猕猴桃果酒 辽宁桓仁6野生猕猴桃果酒 河南西峡7 “徐香”猕猴桃果酒 福建泉州8“秦美”猴桃果酒 陕西周至
1.2 仪器与设备
QP 2010型GC-MS联用仪：日本岛津公司；固相微萃取装置、SPME萃取头：美国Supelco公司；PC-420D磁力搅拌器：美国康宁公司；MA110型分析天平：上海良平仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
分别精密量取各猕猴桃果酒样品8.0 mL置于顶空瓶中，编号后用移液管分别移取2.0 mL配制好的0.2 g/mL氯化钠溶液于顶空瓶中，备用。
1.3.2 香气物质的吸附与解吸
事先将萃取头于200℃下老化40 min，开启磁力搅拌装置，萃取头穿过顶空瓶封垫悬空于液面上方，推出纤维头后吸附30 min，收回纤维头后将萃取头插入GC-MS仪进样口，之后再次推出纤维头，于250℃解吸附8 min。
1.3.3 SPME参数优化
采用单因素试验优化猕猴桃果酒香气物质顶空固相微萃取条件。分别比较了7 μm和30 μm涂层厚度键合型PDMS及85 μm涂层厚度PA固相微萃取头的萃取效果，氯化钠溶液浓度设定为 0、0.1、0.2、0.3g/mL，萃取时间设定为 20、30、40、50min，萃取温度设定为30、40、50、60℃，分析以上因素对萃取香气成分的影响。
1.3.4 GC-MS分析条件
GC 条件：Rtx-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛细管柱；He气为载气，纯度大于99.999%，色谱柱流量1.0 mL/min，进样口温度250℃，不分流进样；起始柱温为40℃，保持3 min，以5℃/min升到120℃，以8℃/min升到230℃，保持10 min。
MS条件：电子轰击离子源（EI），正离子模式，离子源温度200℃，电子能量70 eV，接口温度250℃，溶剂延迟时间6 min，质量扫描范围m/z 40～550。
1.3.5 数据分析
经GC-MS分析后得到各样品的总离子流色谱图（total ion current chromatogram，TIC），经NIST08标准谱库检索并从中挑选出匹配度≥85%的色谱峰，通过分析基峰、质核比和相对丰度等信息[12-14]，确定各色谱峰对应的物质结构，以各组分峰面积占总峰面积的百分比表示其相对含量。
2 结果与分析
2.1 香气物质捕集条件的优化
2.1.1 固相微萃取头的选择
固相微萃取头种类对香气物质捕集效果有显著影响[16-18]，各固相微萃取头所获得色谱如图1所示。
图1 萃取头种类对峰数目的影响
Fig.1 Effect of extraction head type on peak numbers
由图1可知，通过对7 μm、30 μm涂层厚度键合型PDMS和85 μm涂层厚度PA 3种不同类型固相微萃取头捕集猕猴桃果酒成分的比较分析，结果表明，30 μm PDMS萃取头捕集得到268个色谱峰，远高于7 μm涂层厚度键合型PDMS的133个色谱峰和85 μm涂层厚度PA固相微萃取头205个色谱峰，因此本试验选用30 μm PDMS固相微萃取头。
2.1.2 添加电解质（NaCl）对萃取效果的影响
有研究表明，向固相微萃取样品中加入氯化钠等电解质溶液有助于提高试样中有机物的逸出活度，从而促进香气物质从液态基体中挥发并被吸附到萃取头上[19-20]。本试验中氯化钠溶液浓度设定0、0.1、0.2、0.3g/mL 4个水平，氯化钠浓度对峰数目的影响见图2。
图2 氯化钠浓度对峰数目的影响
Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on peak numbers
由图2可以看出，添加氯化钠溶液可以显著增加猕猴桃果酒试样香气物质的捕集数量，并且随着氯化钠浓度的增加，萃取所得色谱峰数目显著上升，当氯化钠浓度达到0.2 g/mL时，色谱峰数目达到峰值142个，之后随着氯化钠浓度的增加色谱峰数目又呈下降趋势，综上考虑，确定添加氯化钠浓度为0.2 g/mL。
2.1.3 萃取温度的确定
采用30 μm PDMS固相微萃取头，分别于30、40、50、60℃条件下对红心猕猴桃果酒中香气成分进行捕集（以六盘水凉都红心猕猴桃果酒为例），采用色谱图归一化法所得“总峰面积”和“总峰面积与色谱峰数目比值”两个参数来评价萃取条件优化结果，从而兼顾香气成分中主要物质和含量较低成分的评价，结果见图3。
图3 萃取温度对总峰面积和总峰面积与峰数比值的影响
Fig.3 Effect of adsorption temperature on total peak area and total peak area to peak number ratio
由图3可以看出，随着萃取温度的上升，萃取所得色谱峰总峰面积和总峰面积与色谱峰数目比值两项参数均有所增加，在40℃时达到峰值，之后吸附逐渐趋于饱和，上述参数均大幅下降，最终确定萃取温度为40℃。
2.1.4 萃取时间的确定
采用30 μm PDMS固相微萃取头，在40℃萃取温度下，分别吸附红心猕猴桃果酒试样（以六盘水凉都红心猕猴桃果酒为例）20、30、40、50 min，采用色谱图归一化法所得“总峰面积”和“总峰面积与色谱峰数目比值”两个参数来评价萃取条件优化结果，具体结果见图4。
图4 萃取时间对总峰面积和总峰面积与峰数比值的影响
Fig.4 Effect of adsorption time on total peak area and total peak area to peak number ratio
由图4可以看出，随着萃取时间的延长，香气物质的吸附量逐渐增加，萃取所得色谱峰总峰面积和总峰面积与色谱峰数目比值两项参数均有所增加，在40 min时达到峰值，之后吸附逐渐趋于饱和，上述参数均有所下降，最终确定萃取时间为40 min。
2.2 香气成分的GC-MS分析
采用优化后的HS-SPME条件捕集不同品种猕猴桃果酒中的挥发性物质，图5为经GC-MS仪分析得到8个猕猴桃果酒样品总离子流图。
图5 猕猴桃果酒香气成分GC/MS总离子流图
Fig.5 Total ion current chromatogram of aromatic components extract from kiwifruit wines
TIC数据经NIST08标准谱库检索，人工图谱解析，并查阅相关参考文献，筛选出匹配度不小于82%的色谱峰，以各组分峰面积占总峰面积的百分比表示其相对含量。不同品种市售猕猴桃果酒中检出挥发性物质均在80种以上，通过文献比对确定其中主要香气物质，表2中所列为各种猕猴桃果酒中相对含量较高的6种共有香气物质含量。
表2 不同品种猕猴桃果酒主要共有香气成分差异
Table 2 Difference of main aromatic components of kiwifruit wines
丁二酸二乙酯/%苍溪红心 15.62 2.72 1.93 1.08 3.85 6.73六枝红心 4.64 4.35 0.87 4.22 1.82 0.83凉都红心 9.35 4.98 0.88 3.37 6.84 3.61修文贵长 16.49 1.86 4.38 4.98 6.73 1.54桓仁软枣 1.51 2.20 0.59 1.05 1.10 0.99西峡野生 5.89 1.15 0.90 4.22 3.36 6.21泉州徐香 28.34 16.58 11.86 3.05 6.73 2.54周至秦美 10.02 4.21 2.03 2.01 4.65 1.77猕猴桃果酒辛酸乙酯/% 乙酸/% 癸酸乙酯/%苯乙醇/%正己酸乙酯/%
由表2可知，香气物质主要有酯类、醇类和酸类物质等。不同品种猕猴桃果酒中相对含量较高的共有香气物质主要有辛酸乙酯、癸酸乙酯、正己酸乙酯和丁二酸二乙酯等，但不同品种猕猴桃果酒中上述香气物质含量差异很大，其中辛酸乙酯和癸酸乙酯的高低含量相差均在20倍以上，正己酸乙酯和丁二酸二乙酯差距8倍左右，而苯乙醇含量差距最小。此外，四川苍溪“红心”猕猴桃果酒中2-氨基-5-甲基苯甲酸（4.3%），贵州六盘水凉都“红心”猕猴桃果酒中糠醛（4.1%），贵州修文“贵长”猕猴桃果酒中5-羟甲基糠醛（3.1%），辽宁桓仁“软枣”猕猴桃果酒中山梨酸乙酯（5.2%），河南西峡野生猕猴桃果酒邻苯二甲酸二异丁酯（3.8%），福建泉州“徐香”猕猴桃果酒中3-甲基-1-丁醇（8.7%）等香气物质在其它品种果酒中未检出或含量极低。表3所列为凉都红心猕猴桃果酒中香气物质示例，共检出70种香气物质，其中含量高于0.1%的物质有49种。
表3 凉都红心猕猴桃果酒主要香气成分GC-MS分析结果
Table 3 GC-MS analytical results of main aromatic components of Liangdu kiwifruit wine
序号 化合物名称 匹配度/% 保留时间/min相对含量/%1 乙酸异戊酯 98 7.661 3.04 2 桉叶油醇 96 9.629 2.32 3 正己酸乙酯 95 10.536 6.48 4 3-羟基-2-丁酮 97 12.650 0.33 5 乳酸乙酯 99 14.052 7.87 6正己醇 97 14.298 4.19 7 辛酸甲酯 87 14.945 0.20
续表3 凉都红心猕猴桃果酒主要香气成分GC-MS分析结果
Continue table 3 GC-MS analytical results of main aromatic components of Liangdu kiwifruit wine
序号 化合物名称 匹配度/% 保留时间/min相对含量/%8 3-乙基-1-环戊烯 83 15.968 0.30 9 辛酸乙酯 97 16.182 9.35 10 乙酸 99 16.572 4.98 11 糠醛 98 16.956 4.09 12 （3E，5E）-3，5-庚二烯-2-酮91 17.239 0.16 13 反式-2-癸烯醇 88 17.775 0.16 14 山梨酸乙酯 97 18.061 2.82 15 丙酸香叶酯 82 18.194 0.13 16 2-甲基四氢噻吩-3-酮 84 18.490 0.10 17 (2R，3R）-(-）-2，3-丁二醇98 18.945 1.40 18 DL-2-羟基己酸乙酯 94 19.069 0.80 19 芳樟醇 96 19.193 0.86 20 1-辛醇 92 19.434 0.29 21 乳酸异戊酯 92 19.668 0.45 22 （2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇98 19.799 0.41 23 4-萜烯醇 95 20.343 0.23 24 苯甲酸甲酯 97 20.698 0.13 25 2-糠酸乙酯 97 20.772 0.25 26 癸酸乙酯 96 21.176 0.88 27 硅烷二醇二甲酯 94 21.382 2.67 28 苯甲酸乙酯 92 21.618 0.74 29 丁二酸二乙酯 98 21.905 3.61 30 萜品醇 95 22.256 0.57 31 2-氨基-5-甲基苯甲酸 81 23.437 3.55 32 六甲基环三硅氧烷 89 24.229 1.17 33 大马士酮 88 24.350 0.19 34 己酸 98 24.686 0.43 35 苄醇 91 25.179 0.20 36 苯乙醇 98 25.701 3.37 37N-[（五氟苯基）亚甲基]85 26.290 0.13-，4-二[（三甲基硅基）氧基]苯乙胺38 辛酸 96 27.699 0.65 39 2-氨基-3-甲基-1-丁醇82 27.954 0.13 40 山梨酸 97 28.727 1.24 41 2-乙基苯酚 92 29.151 0.14 42 乳酸甲酯 83 29.282 0.16 43 2，3-二氢-3，5 二羟91 30.239 0.16基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮44 癸酸 91 30.307 0.16 45 甘油 98 30.662 1.20 46 2，4-二叔丁基苯酚 89 30.794 0.15 47 丁二酸单乙酯 93 31.462 0.09 48 5-羟甲基糠醛 94 32.743 0.39 49 三（羟甲基）硝基甲烷 83 37.280 0.30
3 讨论与结论
果酒香气物质常规评价方法是感官评价法，近年来电子鼻和顶空固相微萃取等方法应用日益广泛，通过将顶空固相微萃取（HS-SPME）技术与GC-MS联用，可快速准确地对果酒中为数众多的微量香气物质进行定性和定量分析。本研究中，优化后选用30 μm PDMS微萃取头，萃取时间40 min、萃取温度40℃和0.2 g/mL氯化钠浓度为萃取条件，可用于8种猕猴桃果酒中香气成分的提取。
GC-MS分析结果表明，不同品种猕猴桃果酒的挥发性成分均在80种以上，通过文献比对确定其主要香气物质，发现酯类物质为构成猕猴桃果酒中香气物质的主力，此外醇类和酸类较多，醛酮类和酚类物质较少，其中修文贵长猕猴桃果酒和西峡野生猕猴桃果酒中未检出酚类香气物质。不同品种猕猴桃果酒中各主要香气成分相对含量有明显差异，以凉都红心猕猴桃果酒为例，共检出含量高于0.1%的香气物质49种，酯类成分相对含量较高，主要有辛酸乙酯（9.35%）、乳酸乙酯（7.87%）和正己酸乙酯（6.48%）3种，醇类成分种类多达14种，占总峰面积的29.62%，含量较高的有顺-3-己烯醇（10.31%）、苯乙醇（4.93%）、苯甲醇（4.39%）和1-戊醇（4.25%）等，醛类9种，占22.53%，烷烃类14种，占11.07%，酮类物质9种，占4.52%，此外还含有烯烃5种，其它类3种。苍溪红心、周至秦美、泉州徐香和西峡野生猕猴桃果酒相对含量最高的香气物质分别为山梨酸乙酯（34.73%）、癸酸乙酯（13.86%）、辛酸乙酯（28.34%）和苯甲酸乙酯（11.58%），六枝红心和修文贵长猕猴桃果酒相对含量最高的香气物质均为3-甲基-1-丁醇，而软枣猕猴桃果酒相对含量最高的香气物质为糠醛。有学者研究表明[19]，大多数酯类具有花、果香气，如正己酸乙酯具有水果香味，而苯乙醇具有玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等多种风味，可能是构成猕猴桃酒香气的主要成分之一[21]。上述结果表明，不同品种猕猴桃果酒中香气物质的主体均为酯类、醇类和酸类物质，醛酮类和酚类物质相对较少，但不同来源猕猴桃果酒所含有风味物质差异较大从而体现出各自独特的风味，本研究旨在为猕猴桃果酒感官质量评价体系的完善和猕猴桃果酒产品的开发提供参考，从而进一步拓展猕猴桃资源的利用领域。
[1]陈桂飞,刘艳秋.猕猴桃苹果梨复合果酒发酵特性的研究[J].中国酿造,2020,39(3):198-201.CHEN Guifei,LIU Yanqiu.Fermentation characteristics of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine[J].China Brewing,2020,39(3):198-201.
[2]魏丽娜,赵静,余偲,等.猕猴桃枸杞复合果酒的研制[J].现代食品科技,2019,35(8):190-197,316.WEI Lina,ZHAO Jing,YU Si,et al.Development of kiwi&medlar fruit wine[J].Modern Food Science and Technology,2019,35(8):190-197,316.
[3]葛东颖,李华佳,刘雪婷,等.植物乳杆菌对猕猴桃果酒品质影响的评价[J].食品研究与开发,2019,40(11):71-75.GE Dongying,LI Huajia,LIU Xueting,et al.Effect of Lactobacillus plantarum on the product quality of kiwifruit wine[J].Food Research and Development,2019,40(11):71-75.
[4]马佳佳,李华佳,魏冰倩,等.徐香猕猴桃果酒发酵过程中品质动态变化的研究[J].中国酿造,2020,39(4):86-90.MA Jiajia,LI Huajia,WEI Bingqian,et al.Dynamic changes of Xuxiang kiwifruit wine quality during fermentation process[J].China Brewing,2020,39(4):86-90.
[5]雷昌贵,孟宇竹,陈锦屏,等.响应面法优化伏牛山野生猕猴桃果酒酿造工艺[J].饮料工业,2019,22(5):40-45.LEI Changgui,MENG Yuzhu,CHEN Jinping,et al.Optimization of fermentation process for wild kiwifruit wine in funiu mountain by response surface methodology[J].Beverage Industry,2019,22(5):40-45.
[6]朱克永.猕猴桃发酵果酒的酿造和营养成分分析[J].食品研究与开发,2017,38(8):92-95.ZHU Keyong.Brewing and nutritional composition analysis of kiwifruit fermented wine[J].Food Research and Development,2017,38(8):92-95.
[7]张琛,郗笃隽,刘辉,等.我国猕猴桃果酒酿造工艺及其品质评价研究进展[J].中国酿造,2020,39(10):26-29.ZHANG Chen,XI Dujun,LIU Hui,et al.Research progress of the brewing technology and its quality evaluation of kiwifruit wine in China[J].China Brewing,2020,39(10):26-29.
[8]陈红梅,王沙沙,尹何南,等.不同工艺处理对野生猕猴桃酒品质的影响[J].食品科学,2018,39(4):233-240.CHEN Hongmei,WANG Shasha,YIN Henan,et al.Effects of different fermentation methods on the quality of wines made from wild kiwifruit[J].Food Science,2018,39(4):233-240.
[9]李昕沂,刘丹丹,罗晶晶,等.不同酵母菌发酵对猕猴桃果酒品质的影响[J].中国酿造,2021,40(2):107-110.LI Xinyi,LIU Dandan,LUO Jingjing,et al.Effect of different yeasts on the quality of kiwifruit wine[J].China Brewing,2021,40(2):107-110.
[10]何嘉敏,于兰,于新,等.顶空固相微萃取-气质联用法分析益生菌发酵复合果蔬汁挥发性成分[J].食品与发酵工业,2019,45(16):275-280.HE Jiamin,YU Lan,YU Xin,et al.Headspace solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry analysis of the volatile components in probiotics fermented fruit and vegetable juice[J].Food and Fermentation Industries,2019,45(16):275-280.
[11]苗榕芯,孙莹,石长波,等.顶空固相微萃取气质联用技术在谷物食品中的应用研究进展[J].食品研究与开发,2020,41(4):219-224.MIAO Rongxin,SUN Ying,SHI Changbo,et al.Application research progress of HS-SPME-GC-MS technology in cereal food[J].Food Research and Development,2020,41(4):219-224.
[12]冒德寿,牛云蔚,姚征民,等.顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用和气相色谱嗅闻技术鉴定清香型白酒特征香气物质[J].中国食品学报,2019,19(7):251-261.MAO Deshou,NIU Yunwei,YAO Zhengmin,et al.Characterization of the key aroma compounds in Chinese light aroma-type liquors by headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,gas chromatography-olfactometry[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2019,19(7):251-261.
[13]王颖,张文君,李慧冬,等.金川雪梨和秦酥挥发性芳香物质的SPME-GC-MS分析[J].食品研究与开发,2020,41(1):160-166.WANG Ying,ZHANG Wenjun,LI Huidong,et al.Analysis of SPME-GC-MS on volatile aromatic compounds of Jinchuanxue pear and qinsu[J].Food Research and Development,2020,41(1):160-166.
[14]刘婷,温慧,丁鹏泽,等.玫瑰香型格瓦斯工艺优化及香气成分分析[J].食品研究与开发,2020,41(4):185-191.LIU Ting,WEN Hui,DING Pengze,et al.Optimization of fermentation process for rose-like aroma kvass and analysis of aroma component[J].Food Research and Development,2020,41(4):185-191.
[15]FIORI J,TURRONI S,CANDELA M,et al.Simultaneous HS-SPME GC-MS determination of short chain fatty acids,trimethylamine and trimethylamine N-oxide for gut microbiota metabolic profile[J].Talanta,2018,189:573-578.
[16]李晓颍,王海静,徐宁伟,等.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析欧李果实挥发性成分[J].中国农业科学,2019,52(19):3448-3459.LI Xiaoying,WANG Haijing,XU Ningwei,et al.Analysis of volatile components in Cerasus humilis(bge.)sok by headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry[J].Scientia Agricultura Sinica,2019,52(19):3448-3459.
[17]AISALA H,SOLA J,HOPIA A,et al.Odor-contributing volatile compounds of wild edible Nordic mushrooms analyzed with HSSPME-GC-MS and HS-SPME-GC-O/FID[J].Food Chemistry,2019,283:566-578.
[18]涂正顺.猕猴桃(Actinidia chinensis)采后果实、发酵果酒香气成分变化规律的研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2001.TU Zhengshun.Changes of aroma components in postharvest fruits and fermented fruit wine of Actinidia chinensis[D].Yangling:Northwest A&F University,2001.
[19]郭静,岳田利,袁亚宏,等.基于SPME-GC/MS的猕猴桃酒香气成分研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2007,35(6):89-93.GUO Jing,YUE Tianli,YUAN Yahong,et al.Analysis of aromatic components in kiwifruit wine by gas chromatography-mass spectrometry with solid phase microextraction[J].Journal of Northwest A&F University(Natural Science Edition),2007,35(6):89-93.
[20]WANG L F,LEE J Y,CHUNG J O,et al.Discrimination of teas with different degrees of fermentation by SPME-GC analysis of the characteristic volatile flavour compounds[J].Food Chemistry,2008,109(1):196-206.
[21]马越,谢国莉,韩玛莉娜,等.皇冠梨香气成分气相色谱-质谱联用分析[J].食品研究与开发,2019,40(14):206-212.MA Yue,XIE Guoli,HAN Malina,et al.Analysis of Huangguan pear aroma components by gas chromatography-mass spectrometer[J].Food Research and Development,2019,40(14):206-212.