蜂蜜是由蜜蜂采集的植物蜜腺分泌的花蜜或蜜露，在蜜蜂分泌的消化酶作用下，在蜂巢内进行转化、脱水后由蜜蜂酿造成熟并储存在蜂巢中的天然甜味物质[1]。单花种蜂蜜是指蜜蜂采集一种蜜源植物的花蜜而酿造的蜂蜜，由于其蜜源植物单一，味道独特而纯净，营养功能强，因此深受消费者喜爱[2]。
云南省的主要蜜源植物和辅助蜜源植物多达148种，居全国各省的首位，且四季花开，享有“天然蜜库”之美誉[3]。云南省蜜源植物的种类虽然繁多，但能生产大量商品蜜的种类集中，一些蜜源植物在全省范围内分布区域也比较集中。三叶橡胶树于20世纪40年代作为战略经济作物引入，现已成为云南热区最主要的经济植物，主要集中栽培于西双版纳、红河、德宏、临沧等海拔900 m以下的热带地区[4]，橡胶蜜已成为云南省产量最大的商品蜜。2016年云南省澳洲坚果种植面积已超越世界其它国家，达13.33×104hm2，2017年达14.67×104hm2[5]，已成为云南省新的主要蜜源植物，澳洲坚果花蜜也成为云南新的重要单花种蜂蜜。苕子蜜，又名雪脂莲蜜，为云南地区传统特有的大宗商品蜜种，因其气味清香、味道甜润的特点，深受国内外消费者喜爱，主产区集中于云南东部[6]。
目前已有少量文献对苕子蜜、橡胶蜜、澳洲坚果蜜的部分理化指标进行检测与分析，检测指标主要包括水分、酸度、还原糖和蔗糖含量等[7-9]，然而，这些研究的样品来源相对单一，且样品数量较少，对这3种特色蜂蜜的酶值、羟甲基糠醛等重要理化指标尚无系统的研究与评价。蜜种鉴别方法有花粉分析、挥发性成分分析和氨基酸分析以及不同质量参数结合化学计量法分析[10]。国内外有利用理化指标对蜜种进行鉴定的研究[11-12]，但对3种特色蜂蜜鉴别尚未见报道。
本研究于2019年～2020年，在云南蜂蜜主产区采集苕子蜜、澳洲坚果蜜和橡胶蜜样品各15批，对样品的水分、酸度、羟甲基糠醛（hydroxymethyl furfural，HMF）、淀粉酶活性、糖组分含量等理化指标进行检测，对3种蜂蜜的理化特征进行了系统分析和评价，并利用主成分分析法对理化指标与蜂蜜种类之间的关系进行探讨。
1 材料与方法
1.1 样品的采集
45个蜂蜜样品均采集于云南各蜂场，所有样品均来自于一线蜂农，样品均为无底糖蜂蜜，确保样品植物来源单一性。样品采集后立即置于冰箱4℃条件下保存，直至检测。样品信息见表1。
表1 云南45批蜂蜜样品的采集信息
Table 1 Collection information of 45 batches of honey samples in Yunnan
注：澳洲坚果蜜（J）、苕子蜜（S）、橡胶蜜（X）。
编号 产地 时间 编号 产地 时间J-01 西双版纳州 2019-02 S-01 昭通市 2019-03 J-02 西双版纳州 2019-03 S-02 昭通市 2019-03 J-03 西双版纳州 2019-03 S-03 昭通市 2019-03 J-04 西双版纳州 2019-02 S-04 曲靖市 2019-04 J-05 西双版纳州 2019-01 S-05 曲靖市 2019-04 J-06 西双版纳州 2019-02 S-06 曲靖市 2019-04 J-07 德宏州 2019-03 S-07 曲靖市 2019-04 J-08 西双版纳州 2020-03 S-08 曲靖市 2019-04 J-09 西双版纳州 2020-03 S-09 曲靖市 2019-04 J-10 普洱市 2020-03 S-10 曲靖市 2020-03 J-11 普洱市 2020-04 S-11 曲靖市 2020-04 J-12 临沧市 2020-03 S-12 曲靖市 2020-04 J-13 西双版纳州 2020-04 S-13 红河州 2020-04 J-14 西双版纳州 2020-04 S-14 红河州 2020-04 J-15 西双版纳州 2020-04 S-15 昆明市 2020-04images/BZ_120_1574_1735_2264_2531.png
1.2 试剂和材料
碘（分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；碘化钾（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；乙酸钠、可溶性淀粉（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；冰乙酸（色谱纯）：美国TEDIA公司；氯化钠（分析纯；乙腈（色谱纯）：北京Dikma公司；羟甲基糠醛（分析纯）：日本Sigma公司；果糖、葡萄糖、麦芽糖（分析纯）：Aladdin公司；蔗糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.3 仪器和设备
电子天平（XP105）：美国梅特勒-托利多公司；超纯水系统（Milli-Q Gradient）：美国MILLIPORE公司；液相色谱仪（WSTERS2690）、超高压液相色谱仪（ACQUITY）：沃特世公司；紫外可见分光光度计（UV-2600）：苏州岛津仪器有限公司；阿贝折光仪（ARIAS500）：美国REICHERT公司。
1.4 理化指标检测方法
水分和酸度采用SN/T 0852—2012《进出口蜂蜜检验规程》规定的方法测定；羟甲基糠醛采用GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法液相色谱-紫外检测法》规定的方法检测。
1.5 淀粉酶活性检测
淀粉酶活性检测采用GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》规定的方法检测。将配制好的淀粉溶液与处理过的样品溶液充分混匀，在40℃水浴条件下，部分淀粉被蜂蜜溶液中的淀粉酶水解后，剩余淀粉与碘反应产生蓝紫色，随着淀粉酶水解作用，蓝紫色反应逐渐消失，用分光光度计于660 nm波长处测定吸光度达到0.235时所需时间，换算出样品中淀粉酶值。
1.6 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量检测
采用GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》规定的方法检测。称取2 g样品用水定容至50 mL，用0.45 μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪-示差折光检测器（high performance liquid chromatography by means of a refractive index，HPLC-RI）测定。
1.7 数据处理
采用SPSS 19.0软件对试验所得数据进行主成分分析。
2 结果与分析
2.1 理化指标检测
2.1.1 水分含量
蜂蜜的水分含量与天气、季节等因素有关，蜂蜜在水分含量低的情况下更易保存。澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜水分含量检测结果见图1。
图1 澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜水分检测结果箱线图
Fig.1 Box plot of moisture test results of Macadamia integrifolia honey，Vicia villosa Roth honey and Hevea brasiliensis honey
如图1所示，所有样品水分含量都符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》标准的要求（≤24%），其中澳洲坚果蜜的水分含量较低。澳洲坚果蜜有13个样品水分含量均低于20%，能够达到一级品标准。由于澳洲坚果开花时间大多为1月～3月，为西双版纳旱季，有利于蜂蜜中水分的挥发，故澳洲坚果蜜较为容易达到成熟蜂蜜的生产标准，可以打造成为云南新的特色高品质蜂蜜。
2.1.2 淀粉酶活性
淀粉酶活性常被用作衡量蜂蜜的新鲜度，能够作为蜂蜜储藏时间的指标，酶值越高代表蜂蜜品质越好[13]。淀粉酶活性检测结果见图2。
图2 澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜淀粉酶值检测结果箱线图
Fig.2 Box plot of amylase values of Macadamia integrifolia honey，Vicia villosa Roth honey and Hevea brasiliensis honey amylase value
如图2所示，澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜的平均酶值分别为12.41、25.74、15.98 mL/（g·h），所有样品的酶值都符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》中的标准[≥4mL/（g·h）]，其中苕子蜜的酶值最高，坚果蜜的酶值相对较低。酶值不仅与植物来源、流蜜的丰度、花蜜的糖含量、温度等有关，还与蜜蜂的生理阶段以及蜂群的强度等有关。采集的澳洲坚果蜜有一部分是由中蜂酿造的，由于2月～4月中蜂处于增殖和分蜂阶段，在4月才能演变为一个稳定的种群[14]，这可能是本研究中澳洲坚果蜜样品酶值较低的原因之一。
2.1.3 羟甲基糠醛含量
羟甲基糠醛含量不仅能判断蜂蜜的新鲜程度和加热情况，还能作为蜂蜜是否掺入转化糖的标准之一[15]。澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜羟甲基糠醛检测结果如表2。
表2 澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜羟甲基糠醛检测结果
Table 2 Test results of HMF in Macadamia integrifolia honey，Vicia villosa Roth honey and Hevea brasiliensis honey
项目平均含量/（mg/kg）标准差含量范围/（mg/kg）坚果蜜 3.5 2.5 0～8.8苕子蜜 3.2 5.0 0～14.9橡胶蜜 1.9 4.3 0～17.3
由表2可知，澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜中羟甲基糠醛平均含量分别为3.5、3.2、1.9 mg/kg。所有样品的羟甲基糠醛含量都符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》中的要求（≤40 mg/kg）。
2.1.4 酸度
蜂蜜的酸度会在储存过程中逐渐升高，蜂蜜酸度的高低可以作为蜂蜜掺假情况和新鲜程度的标准之一，蜂蜜的酸度越低口感越好[16]。3种蜂蜜酸度检测结果见图3。
图3 澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜酸度检测结果箱线图
Fig.3 Box plot of acidity test results of Macadamia integrifolia honey，Vicia villosa Roth honey and Hevea brasiliensis honey
如图3所示，澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜的平均酸度分别为14.80、13.70、18.80 mL/kg，所有检测样品都呈酸性符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》中的标准（≤40mL/kg），说明样品都为未发酵新鲜蜂蜜。
2.1.5 糖组分
蜂蜜中糖组分一般占总质量的75%左右，其中果糖和葡萄糖约占总糖的85%，果糖和葡萄糖含量是评价蜂蜜质量的主要参数[17]。利用HPLC-RI对3种蜂蜜的果糖、葡萄糖、蔗糖的含量进行检测结果见表3。
表3 澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜糖组分检测结果
Table 3 Test results of components of Macadamia integrifolia honey，Vicia villosa Roth honey and Hevea brasiliensis honey
项目 果糖/% 葡萄糖/% 蔗糖/% （果糖+葡萄糖）/% 果糖/葡萄糖 麦芽糖/%澳洲坚果蜜 36.41±1.33 30.78±1.51 1.76±1.19 67.19±2.73 1.18±0.03 1.57±0.51苕子蜜 37.34±1.61 32.08±2.32 1.81±2.17 69.42±2.19 1.17±0.11 1.05±0.31橡胶蜜 37.84±1.49 32.69±3.42 0.94±0.81 70.53±2.54 1.18±0.20 1.11±0.16
如表3所示，GH/T 18796—20122《蜂蜜》中要求葡萄糖和果糖总含量应≥60%，蔗糖的含量应≤5%。所有样品葡萄糖与果糖总含量符合标准，蔗糖含量均低于5%，橡胶蜜的果糖+葡萄糖含量为70.53%，坚果蜜和苕子蜜为67.19%和69.42%，与文献报道的洋槐蜜、枣花蜜、荆条蜜的平均含量相当[18]。
果糖与葡萄糖含量的比值称为果葡比，其高低会对蜂蜜结晶有影响[19]。果葡比值越低，蜂蜜越易产生结晶，虽然结晶是正常现象，蜂蜜品质不会改变[20]，但蜂蜜结晶会影响品相，难吸引消费者。本研究中澳洲坚果蜜平均果葡比为1.18、苕子蜜为1.17、橡胶蜜为1.18，与文献报道的枣花蜜结果相近，低于洋槐蜜的果葡比[18]。
2.2 蜂蜜主成分分析得分图的分析及比较
2.2.1 方差贡献率分析
KMO检验统计量及巴特利球形检验（Bartlett）的检验结果见表4。
表4 KMO检验统计量及巴特利球形检验
Table 4 KMO and Bartlett′s test
KMO取样适切性量数巴特利球形检验近似卡方 自由度 显著性0.366 263.939 36 0.000
由表4可知，KMO（P=0.366）和Bartlet（tP=0.000），虽然KMO的值小于0.5，不能确定变量之间存在联系，但由于P值小于0.001，所以说明变量之间有一定的交互关系，可以通过数据矩阵对试验测定结果进行因子分析。
各因子分析中方差贡献率的结果见表5。
表5 方差贡献率
Table 5 Total variance explained
成分 images/BZ_123_320_448_2220_483.png初始特征值 提取载荷平方和 旋转载荷平方和总计 方差百分比 累积/% 总计 方差百分比 累积/% 总计 方差百分比 累积/%1 2.656 29.509 29.509 2.656 29.509 29.509 2.041 22.680 22.680 2 2.181 24.230 53.738 2.181 24.230 53.738 1.816 20.181 42.861 3 1.235 13.724 67.462 1.235 13.724 67.462 1.796 19.958 62.819 4 1.078 11.980 79.442 1.078 11.98 79.442 1.496 16.623 79.442 5 0.703 7.816 87.258 6 0.535 5.945 93.204 7 0.321 3.570 96.773 8 0.285 3.168 99.941 9 0.005 0.059 100
由表5可以看出，变量相关阵有4个特征值大于1 的主成分，即 2.656、2.181、1.235、1.078，分别解释了总方差的29.509%、24.230%、13.724%、11.980%，累积贡献率为79.442%，可以确认这4个因子能够概括3种蜂蜜的理化指标的大部分信息。
2.2.2 因子载荷矩阵分析
因子载荷矩阵见表6。
表6 因子载荷矩阵
Table 6 Component matrix
主成分 酶值 HMF 果糖 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 酸度 水分 果葡比1 0.425 0.014 0.688 -0.337 -0.684 -0.514 0.524 0.702 0.623 2 0.002 -0.634 0.325 -0.750 0.457 0.467 -0.26 -0.321 0.717 3 0.612 -0.548 0.152 0.339 0.261 -0.24 -0.413 0.258 -0.245 4 0.230 -0.227 0.341 0.353 -0.234 0.555 0.482 -0.329 -0.171
从表6中可以得出与4个主成分相关系数绝对值最大的原变量值为水分、葡萄糖、酶值和麦芽糖，其相关系数绝对值分别为0.702、0.750、0.612和0.555。
图4 主成分得分图
Fig.4 Figure of principal component scores
图4为3种蜂蜜的主成分得分图，x轴为主成分1（PC1），y轴为主成分 2（PC2），z轴为主成分 3（PC3）。
从图4中可以看出3种蜂蜜有一定程度的交叉，其中橡胶蜜的聚集效果最好，其次为苕子蜜，澳洲坚果蜜样品间离散程度较大，不能通过该主成分得分图有效区分。
3 结论
本研究采集了来自云南各蜂蜜主产区的苕子蜜、橡胶蜜和澳洲坚果蜜各15批，对其各项理化指标（水分、酶值、羟甲基糠醛、酸度、还原糖、蔗糖）进行检测和分析。结果表明，澳洲坚果蜜作为云南新兴发展蜜种，其水分含量最低，有望发展为高品质成熟蜂蜜；澳洲坚果蜜、苕子蜜、橡胶蜜的平均酶值分别为12.41、25.74、15.98 mL/（g·h），羟甲基糠醛含量、还原糖和蔗糖等含量均符合国家相关标准的要求，表明这3种蜂蜜均有较好的品质，经过主成分分析提取出4个主成分，可以区分出橡胶蜜和苕子蜜。本研究系统地分析3种云南特色蜂蜜的理化性质，为其品质评价和植物来源鉴定提供技术和数据支撑，为云南特色蜂蜜的进一步研究、高品质生产和云南蜜种鉴别奠定良好的基础。
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