竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC）饮片具有温中止痛，杀虫止痒等功效，可用于治疗脘腹冷痛，呕吐泄泻，虫积腹痛和湿疹瘙痒[1-4]。研究表明，竹叶花椒果皮富含的天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗肿瘤、免疫调节等多种生理活性[5-6]，从竹叶花椒中提取天然黄酮类化合物有助于提高其药用价值。
黄酮类化合物结构丰富多样，其提取、分离、纯化工艺条件与其来源有密切关系。目前常用的提取方法主要有水煎煮法、常规有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法等[7-8]，但这些方法存在提取效率低、提取时间长、超声波衰减、设备价格高等不足的问题。微波辅助提取法是利用微波和传统溶剂萃取相结合，能够在短时间内穿透样品和样品内部，并通过偶极子旋转和离子电导率提高萃取率，广泛应用于黄酮类物质的提取[9-10]。聚酰胺和大孔吸附树脂是纯化黄酮类物质常用的吸附剂，二者吸附原理不同，实际中单独使用较多，将聚酰胺和大孔吸附树脂联用可充分发挥两者优势，提高纯化效率[11-12]。
本研究以芦丁为对照品，利用分光光度法测定样品的总黄酮含量。系统地研究了利用微波辅助法从竹叶花椒中提取总黄酮的工艺参数。在此基础上，考察洗脱液和吸附剂对总黄酮富集纯化效果的影响，以期获得便捷高效的提取纯化方法，为竹叶花椒总黄酮的深入研究和开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜竹叶花椒：采自四川省汉源藤椒种植基地，经四川中医药高等专科学校江洪波副教授鉴定为芸香科花椒属植物竹叶花椒；芦丁（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大孔吸附树脂D101：成都市科隆化学品有限公司；聚酰胺（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
XH-MC-1型实验室微波合成仪：北京祥鹄科技发展有限公司；BSA124S型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV-315型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；TG-18型离心机：四川蜀科仪器有限公司；RE52CS-2型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 竹叶花椒总黄酮提取
挑选大小均匀无损伤的新鲜竹叶花椒果皮，去除果柄，恒温40℃烘烤24 h，得干燥竹叶花椒果皮，保存待用。称取1.0 g干燥竹叶花椒果皮，以乙醇为溶剂，放入微波反应器中，设定微波辅助提取条件。粗提液抽滤，滤液在25℃下以3 500 r/min离心10 min，用提取溶剂定容。提取液用石油醚萃取以除去脂溶性杂质，取下层溶液，即得竹叶花椒总黄酮粗提液。
1.3.2 标准曲线绘制
精确称取芦丁标准品20 mg，无水乙醇溶解后转移至100 mL容量瓶中，以无水乙醇定容，配制成浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。
精确量取 0.2 mg/mL 的芦丁溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于7支干净试管中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min；加10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min，加10%氢氧化钠溶液5 mL，再加无水乙醇补齐至10 mL，摇匀，放置15 min。显色稳定后，分别测定标准溶液在510nm处的吸光度[13]。以芦丁标准溶液质量浓度（mg/mL）为横坐标，相应吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到芦丁浓度x与吸光度Y的关系曲线的回归方程为Y=0.79x+0.001 57，R2=0.999 6。
1.3.3 总黄酮含量及得率的测定
根据1.3.2得到的标准曲线计算得到总黄酮含量，并按下式计算总黄酮得率。
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 乙醇体积分数对竹叶花椒总黄酮得率的影响
以干燥竹叶花椒果皮为原料，固定料液比为1∶30（g/mL），微波功率 300 W，提取温度 70℃，提取时间20 min，分别以体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇为溶剂提取黄酮，比较不同乙醇体积分数对总黄酮得率的影响。
1.3.4.2 料液比对竹叶花椒总黄酮得率的影响
以干燥竹叶花椒果皮为原料，固定乙醇体积分数60%，微波功率300W，提取温度70℃，提取时间20min，分别设定料液比为 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），比较不同料液比对总黄酮得率的影响。
1.3.4.3 微波功率对竹叶花椒总黄酮得率的影响
以干燥竹叶花椒果皮为原料，固定乙醇体积分数60%，料液比 1∶30（g/mL），提取温度 70 ℃，提取时间20 min，分别以 200、300、400、500、600 W 的微波功率进行提取，比较不同微波功率对得率的影响。
1.3.4.4 提取温度对竹叶花椒总黄酮得率的影响
以干燥竹叶花椒果皮为原料，固定乙醇体积分数为 60%，料液比 1∶30（g/mL），微波功率 300 W，提取时间 20 min，分别以 50、60、70、80、90 ℃的提取温度进行提取，比较不同提取温度对总黄酮得率的影响。
1.3.4.5 提取时间对竹叶花椒总黄酮得率的影响
以干燥竹叶花椒果皮为原料，固定乙醇体积分数60%，料液比 1∶30（g/mL），微波功率 300 W，提取温度70 ℃，分别设定提取时间为 15、20、25、30、35 min 进行提取，比较不同提取时间对总黄酮得率的影响。
1.3.5 正交优化试验
在单因素试验研究基础上，进行五因素四水平正交试验，以竹叶花椒总黄酮得率为考察指标，试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平设计
Table 1 The experimental factors and levels of orthogonal test
水平 A乙醇体积分数/%E提取时间/min 1 40 1∶20 300 60 15 2 50 1∶25 400 70 20 3 60 1∶30 500 80 25 4 70 1∶35 600 90 30 B料液比/（g/mL）C微波功率/W D提取温度/℃
1.3.6 黄酮富集纯化试验
1.3.6.1 聚酰胺纯化
取适量聚酰胺，按参考文献[14]中的方法对聚酰胺进行预处理，备用。精确量取10 mL粗提液，拌入2.0 g干燥聚酰胺，挥去溶剂后，依次用水及体积分数为20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液5 BV，将洗脱液干燥后称重，得到洗脱液中含有的固体量。同时，通过测定洗脱液中总黄酮含量，按下式计算总黄酮的纯度和收率。
1.3.6.2 大孔吸附树脂纯化
取适量大孔吸附树脂，按参考文献[14]中的方法对大孔吸附树脂进行预处理，备用。精确量取10 mL粗提液，置于预先以水为溶剂填充的D-101大孔树脂层析柱上部，先以水洗至流出液近无色，后依次用体积分数为20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液5 BV，测定洗脱液中固体含量和总黄酮含量，按1.3.6.1中方法计算总黄酮的纯度和收率。
1.3.6.3 聚酰胺-大孔吸附树脂纯化
精确量取10 mL粗提液与2.0 g聚酰胺混合，挥去溶剂后置于预先以水为溶剂填充的D-101大孔树脂层析柱上部，先以水洗至流出液近无色，后依次用体积分数为20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液5 BV，测定洗脱液中所含的固体量和总黄酮的量，按1.3.6.1中方法计算总黄酮的纯度和收率。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
各因素对总黄酮得率的影响见表2。
表2 单因素试验结果
Table 2 The results of single-factor experiment
因素A 因素B 因素C 因素D 因素E乙醇体积分数/%总黄酮得率/%images/BZ_80_690_1648_708_1678.png料液比/（g/mL）总黄酮得率/%images/BZ_80_1109_1648_1127_1678.png微波功率/W总黄酮得率/%images/BZ_80_1485_1648_1503_1678.png提取温度/℃总黄酮得率/%images/BZ_80_1864_1648_1882_1678.png提取时间/min总黄酮得率/%40 8.499 2 1∶20 7.241 0 200 7.141 4 50 7.177 1 15 7.290 4 50 8.791 3 1∶25 8.119 6 300 8.422 3 60 7.806 4 20 8.010 4 60 8.277 0 1∶30 8.804 4 400 8.983 8 70 8.594 4 25 8.941 3 70 7.852 5 1∶35 8.737 4 500 8.898 5 80 9.051 9 30 8.864 5 80 7.319 4 1∶40 8.665 0 600 8.812 9 90 8.898 8 35 8.769 6
由表2可知，乙醇体积分数为50%、料液比为1∶30（g/mL）、微波功率 400 W、提取温度 80℃、提取时间25 min时，总黄酮得率均为不同水平中的最大值，分别为8.791 3%、8.804 4%、8.983 8%、9.051 9%、8.941 3%。故单因素试验确定的最优试验条件为乙醇体积分数50%、料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 400 W、提取温度80℃、提取时间25 min。
2.2 正交试验结果
通过试验得出正交试验结果及极差分析见表3，正交试验方差分析见表4。
表3 正交试验结果及极差分析
Table 3 The results of orthogonal experiment
试验号 A B C D E 总黄酮得率/%1 1 1 1 1 1 7.115 8 2 1 2 2 2 2 8.691 8 3 1 3 3 3 3 9.155 7 4 1 4 4 4 4 8.485 9 5 2 1 2 3 4 9.186 1 6 2 2 1 4 3 8.838 7
续表3 正交试验结果及极差分析
Continue table 3 The results of orthogonal experiment
试验号 A B C D E 总黄酮得率/%7 2 3 4 1 2 7.590 0 8 2 4 3 2 1 7.806 0 9 3 1 3 4 2 8.359 8 10 3 2 4 3 1 7.934 2 11 3 3 1 2 4 8.257 4 12 3 4 2 1 3 9.000 4 13 4 1 4 2 3 7.411 4 14 4 2 3 1 4 7.333 8 15 4 3 2 4 1 8.427 9 16 4 4 1 3 2 8.116 8 k1 8.362 8.018 8.082 7.760 7.821 k2 8.355 8.200 8.827 8.042 8.190 k3 8.388 8.358 8.164 8.598 8.602 k4 7.822 8.352 7.855 8.528 8.316 R 0.566 0 0.340 0 0.972 0 0.838 0 0.781 0
表4 正交试验方差分析
Table 4 The variance analysis of orthogonal experiment
注：P＜0.05表示差异显著。
因素 偏差平方和 自由度 F值 P值A乙醇体积分数 0.520 3 1.133 ＞0.05 B料液比 0.481 3 1.046 ＞0.05 C微波功率 4.070 3 8.858 ＜0.05 D提取温度 2.967 3 6.457 ＜0.05 E提取时间 2.255 3 4.907 ＜0.05
由表3的极差分析可知，微波功率对得率的影响最大，各因素对竹叶花椒总黄酮提取效果的影响的主次顺序为微波功率＞提取温度＞提取时间＞乙醇体积分数＞料液比。表4方差分析表明，C（微波功率）、D（提取温度）和E（提取时间）对总黄酮得率有显著影响（P＜0.05），根据k值确定微波辅助提取竹叶花椒总黄酮的最优提取条件为A3B3C2D3E3，即乙醇体积分数60%，料液比 1∶30（g/mL），微波功率 400 W，提取温度 80℃，提取时间25 min。进行3次验证试验，得到总黄酮平均得率为9.20%，结果高于正交试验各组的总黄酮得率。
2.3 总黄酮的分离和纯化
2.3.1 聚酰胺树脂洗脱分析
以干燥聚酰胺为吸附剂，对总黄酮的收率和纯度进行测定，结果见图1。
图1 乙醇体积分数对聚酰胺树脂洗脱的影响
Fig.1 The effect of ethanol volume fraction on the elution of polyamide resin
由图1可知，在水洗液和乙醇体积分数为20%的洗脱液中，总黄酮收率相对较低，而乙醇体积分数为40%～80%的洗脱液中的总黄酮收率和纯度均较高，其中经60%乙醇洗脱纯化后，收率为35.13%，纯度为37.14%，具有较好的富集纯化作用，故选择体积分数为60%的乙醇为聚酰胺树脂纯化的洗脱溶剂。
2.3.2 大孔吸附树脂洗脱分析
以D-101大孔树脂层析柱为吸附剂，对总黄酮的收率和纯度进行测定，结果见图2。
图2 乙醇体积分数对大孔吸附树脂洗脱的影响
Fig.2 The effect of ethanol volume fraction on the elution of macroporous resin
由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，洗脱液中的总黄酮收率和纯度均增高，其中经60%乙醇洗脱纯化后，收率为31.46%，纯度为32.55%，乙醇体积分数再增加洗脱液中总黄酮收率和纯度反而有所降低，可能是因为乙醇体积分数越高，洗脱下来的杂质也随之增多，故选择体积分数为60%乙醇为大孔吸附树脂纯化的洗脱溶剂。
2.3.3 聚酰胺-大孔吸附树脂洗脱分析
将两种吸附剂联用，对总黄酮的收率和纯度进行测定，结果见图3。
图3 乙醇浓度对聚酰胺-大孔吸附树脂洗脱的影响
Fig.3 The effect of ethanol concentration on the elution of polyamide-macroporous resin
由图3可知，样品液经水洗、聚酰胺树脂初步纯化后再经过大孔吸附树脂层析柱，乙醇体积分数为60%的洗脱液富集纯化效果最佳，收率为43.50%，纯度为42.54%，均高于单一吸附剂的吸附效果。先将粗提液以水为洗脱液除去生物碱和大量水溶性杂质，再利用聚酰胺和大孔吸附树脂进行纯化，可达到竹叶花椒总黄酮的初步富集纯化。结合聚酰胺树脂、大孔吸附树脂纯化工艺中的乙醇洗脱浓度的结果，选定体积分数为60%的乙醇作为洗脱剂。
3 结论
利用微波辅助提取竹叶花椒中总黄酮，试验获得的最佳提取条件为乙醇体积分数60%，料液比1∶30（g/mL），微波功率400 W，提取温度80℃，提取时间25 min，总黄酮得率为9.20%。试验确定了体积分数为60%乙醇为洗脱液，聚酰胺-大孔吸附树脂为联合吸附剂对提取物进行纯化，总黄酮收率和纯度分别为43.50%和42.54%，优于单一吸附剂的吸附效果，试验结果为竹叶花椒总黄酮的提取纯化提供了试验参考。
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