悬钩子属（Rubus）植物的果实，是当今风靡全球的“第三代水果”，是联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）向全球推荐的健康小浆果；因其独特的药用、食用价值深受消费者青睐[1-3]。我国悬钩子资源丰富，有209种，其中139种为特有种[4]。我国悬钩子产业发展起步晚、产品种类和数量少、主栽品种来自国外、国内良好的悬钩子属种质资源尚未得到充分的利用[5-6]。红泡刺藤（Rubus niveus）是我国野生树莓资源中极具开发利用价值的一个种[7-8]。
红泡刺藤广泛分布于我国西南各省海拔500 m～2 800 m区域[9]。因果实成熟期集中、机械化采收难度高、采摘期与雨季重叠等原因，使得红泡刺藤运输难度大；果实娇嫩、果皮极薄、呼吸速率高等原因，使得红泡刺藤果实难以长期保鲜[10]。酿造果酒作为重要的深加工工艺之一，不仅能一定程度上缓解红泡刺藤运输和保鲜的困难，解决季节性成熟导致的浪费；而且填补了这个领域研究的空白，增加红泡刺藤的附加值，创造良好的经济效益。目前，红泡刺藤果酒的研究尚未展开，但其同属植物红树莓的研究表明，红树莓果酒中保留了果实中大部分生物活性物质，其中树莓酮、总酚、花色苷、原花青素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等含量较高，且具有抗氧化、抗炎和体外降血糖等功效[11-14]。
本研究借鉴同属植物红树莓的研究方法，以红泡刺藤果实为原料，在前期预试验的基础上探讨初始pH值、主发酵温度、酵母接种量、初始糖度对红泡刺藤果酒的影响，以单因素和正交试验探索果酒发酵工艺；对最优工艺果酒的抗氧化活性和挥发性风味物质进行分析，以期能为悬钩子产业的发展和生产提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生红泡刺藤果实：摘自云南省保山市隆阳区附近山林；葡萄酒-果酒专用酵母（Saccharomyces cerevisiae）、果胶酶（40 000 U/g）、柠檬酸：帝伯仕酵母有限公司；亚硫酸氢钠、无水乙醇、酚酞、磷酸二氢钠、抗坏血酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；葡萄糖标准品：天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠：广州新港化工厂；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；邻苯二甲酸氢钾：国药集团化学试剂有限公司；苯酚：浙江杭州双林化工试剂厂；硫酸：浙江临平化工试剂厂；磷酸氢二钠：德国Merck公司；硫酸亚铁：北京化工厂；邻二氮菲：上海试剂三厂；以上试剂均为分析纯。白砂糖、矿泉水、食用碱：市售。
1.2 仪器与设备
UV-2600紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；GXZ-15恒温培养箱：宁波东南仪器有限公司；JYLC012榨汁机：九阳股份有限公司；BCD 576 WDUP冰箱：海尔集团公司；HH-442664恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SW CJ ZD无菌接种台：苏州净化设备有限公司；TDL 5A离心机：上海安亭科学仪器有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；336号酒精计：上海华辰医用仪表有限公司；0%～32% Brix手持折光仪：邦西仪器科技（上海）有限公司；顶空固相微萃取装置（含SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头）：美国Supelco公司；TRACE1300+ISQ GC-MS联用仪：美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
红泡刺藤果实→挑选原料→-20℃冷冻→20℃～25℃室温解冻→榨汁→酶解→调整成分→灭菌→接种→主发酵→后发酵→澄清→成品
操作要点：选择无病、无虫、无害、成熟度高的新鲜红泡刺藤果实冷冻备用；试验前12 h置于4℃冰箱解冻，然后用榨汁机将红泡刺藤果实榨汁，按果浆总质量的0.02%加入果胶酶，搅拌均匀后20℃～25℃室温酶解3 h；调整成分：添加160 mg/L亚硫酸氢钠[15]后，根据试验需要用浓白砂糖水调整红泡刺藤果汁的初始糖度，用柠檬酸、食用碱水溶液调整红泡刺藤果汁的初始pH值。灭菌：75℃水浴锅中恒温灭菌15 min[15]。酵母活化：将干酵母溶于10倍质量分数为5%的蔗糖水溶液中，32℃活化30 min。主发酵：灭菌冷却后，于无菌接种台内将活化好的酵母接种到红泡刺藤果浆中，在试验温度下主发酵8 d[13]。后发酵：将主发酵后的果酒转移至28℃培养箱中，恒温发酵30 d。澄清：离心机3 500 r/min离心3 min，上清液即为红泡刺藤果酒。
1.3.2 单因素试验
变量为拟研究的单因素，固定其它因素进行控制：初始pH值为3.3、主发酵温度为26℃、酵母接种量为0.6%、初始糖度为27%、主发酵时间为8 d，后发酵温度28℃后，发酵时间30 d。设置4个考察因素：初始 pH 值（2.5、2.9、3.3、3.7、4.1）、主发酵温度（18、22、26、30、34℃）、酵母接种量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）、初始糖度（23%、25%、27%、29%、31%）。在前期预试验的基础上，以发酵果酒的酒精度为主要考察指标，辅以总酸、总糖、可溶性固形物、pH值等指标判断发酵进程，并对优化后的果酒进行感官评价。
1.3.3 正交试验优化发酵工艺
结合单因素试验结果，以初始pH值、主发酵温度、酵母接种量、初始糖度4个因素建立L9（34）正交试验，对发酵工艺进行优化，以感官评分为考察指标，同时关注发酵果酒的总酸、酒精度、可溶性固形物、pH值。正交试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal expriment
水平 A初始pH值D初始糖度/%1 B主发酵温度/℃C酵母接种量/%3.3 26 0.4 27 2 3.7 30 0.5 29 3 4.1 34 0.6 31
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 理化指标测定
pH值的测定采用酸度计法[16]；酒精度的测定采用酒精计[16]；可溶性固形物的测定采用手持糖度计测定法[17]；总酸（以酒石酸计）的测定采用酸碱滴定法[18]。总糖的测定采用苯酚-硫酸法[16]以葡萄糖为标准品，绘制一元线性回归方程：y=0.849 6x＋0.002 9，R2＝0.999 8。
1.3.4.2 感官评价
由10位选修过《感官评价》课程的食品质量与安全专业学生（5男5女），组成的评审小组，从色泽、透明、香气、滋味等方面参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官评定方法对理论和实际最优发酵工艺果酒进行评分[18]，品评杯为统一的玻璃酒杯，评分标准见表2，最终得分以平均分±标准差记。
表2 感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards
色泽（20分） 透明（10分） 香气（30分） 滋味（40分）鲜明，协调，有光泽，酒红色（16分～20分）具有红泡刺藤酒固有滋味，酒体丰满，醇厚协调，爽口（33分～40分）鲜明，有光泽，浅红色（11分～15分）澄清透亮，无杂质，无沉淀（9分～10分）具有纯正果香，酒香浓郁持久柔和协调（25分～30分）澄清，有轻微悬浮，无沉淀（6分～8分）果香、酒香良好，较浓郁怡人（19分～24分） 酒体丰满，纯正，酸甜适口（25分～32分）有光泽，无变色（6分～10分） 微浑，有少量杂质或沉淀（3分～5分）果香、酒香较少，无异香（14分～18分） 酒体较丰满，酸甜适当（17分～24分）失光，不协调（0～5分） 浑浊，有明显杂质或沉淀（0～2分）果香、酒香不足，不怡人，无异香（7分～13分） 略酸，较细腻，欠浓郁，无异味（9分～16分）香气不良，有异臭（0～6分） 偏酸，有苦涩味，平淡，有异味（0分～8分）
1.3.4.3 抗氧化能力测定
DPPH自由基清除能力测定，参考文献[19]的方法进行；羟基自由基清除能力测定，参考文献[20]的方法进行。
1.3.4.4 挥发性风味物质分析
果酒挥发性风味物质检测：由昆明理工大学分析测试中心测定，进样程序和参数设置参考曾朝珍等[21]的研究。检测结果经计算机检索，与美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）谱库相匹配，并分析可能属于红泡刺藤果酒的风味物质，取匹配度≥75%的组分；峰面积归一化法计算各挥发性风味物质的相对百分含量。
1.4 数据处理及分析
发酵和测量试验均为3次重复，所有用Excel2016绘图制表，并以SPSS 16.0对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 初始pH值对红泡刺藤果酒发酵影响
初始pH值对红泡刺藤果酒发酵效果的影响见图1。
图1 初始pH值对红泡刺藤果酒发酵效果的影响
Fig.1 Effect of initial pH value on fermentation of R.niveus fruit wine
由图1可知，随着初始pH值的逐渐增加，果酒总酸迅速下降；而酒精度呈先上升后下降的趋势，当初始pH值为3.7时，酒精度最高，为9.33%vol；可溶性固形物呈平缓下降；总糖先上升，初始pH值高于2.9后缓慢下降；发酵后果酒的pH值随着初始pH值的增加而增加。发酵液初始pH值会影响果酒的发酵进程，从而影响酒精度[22]。当发酵初始pH值过低时，不仅抑制了酵母菌的生长，导致发酵不彻底，还会阻碍发酵液中的酸性物质分解，从而造成挥发酸的含量增加[23]，一定程度上影响红泡刺藤果酒的口感。当发酵液的初始pH值过高时，可能导致发酵体系中的杂菌生长，杂菌将糖等营养物质分解产生醋酸物质[24]，给果酒的风味带来不良影响。综合考虑最佳初始pH值为3.7。
2.1.2 主发酵温度对红泡刺藤果酒发酵影响
发酵温度对红泡刺藤果酒发酵效果的影响见图2。
图2 主发酵温度对红泡刺藤果酒发酵效果的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on fermentation effect of R.niveus fruit wine
随着发酵温度的不断升高，果酒的总酸先逐渐下降后缓慢上升；酒精度逐渐升高后下降，在30℃时酒精度最高为10.21%vol。不同主发酵温度下产生的果酒其pH值变化不大。过低的主发酵温度会抑制酵母的代谢，在一定程度上降低酵母对糖的利用率，不利于果酒发酵，可能会导致红泡刺藤果酒发酵不彻底。当发酵温度过高时，发酵反应剧烈，但酵母衰老速度快，果酒风味物质挥发明显，高温条件下使腐败微生物快速生长发育，可能导致红泡刺藤果酒品质下降[25]。综合考虑最佳发酵温度为30℃。
2.1.3 酵母接种量对红泡刺藤果酒发酵影响
酵母接种量对红泡刺藤果酒发酵效果的影响见图3。
图3 酵母接种量对红泡刺藤果酒发酵效果的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculation on fermentation of R.niveus fruit wine
由图3可知，随着发酵液中酵母接种量的逐渐增加，红泡刺藤果酒中的酒精度先升高随后降低，当酵母接种量达到0.5%时，酒精度最高，为9.47%vol；总酸先升后降，当酵母接种量达到0.6%时，总酸含量最高为14.20 g/L；可溶性固形物含量呈先上升后下降的趋势，当酵母接种量大于0.7%时，可溶性固形物含量下降；总糖含量呈现先上升后下降的趋势，在酵母接种量为0.5%时，总糖含量最高；发酵后果酒的pH值呈缓慢上升，在酵母接种量为0.8%时达到最大值。酵母接种量是影响果酒发酵的重要因素之一，直接影响到发酵过程的生物转化程度和酒精生成量[26]。接种量较少时，生物质利用速率慢，可能导致发酵周期的延长；接种量过多时，红泡刺藤果酒发酵进程受到酵母残体的影响。因此，最佳酵母接种量为0.5%。
2.1.4 初始糖度对红泡刺藤果酒发酵影响
初始糖度对红泡刺藤果酒发酵效果的影响见图4。
图4 初始糖度对红泡刺藤果酒发酵效果的影响
Fig.4 Effect of initial sugar concentration on fermentation effect of R.niveus fruit wine
由图4可知，随着初始糖度的增加，红泡刺藤果酒中的总酸先增加后下降，当发酵液初始糖度为25%时，总酸最高，为14.38 g/L；酒精度和可溶性固形物呈先平稳增加后缓慢下降的趋势，在初始糖度为29%时均达到最高；总糖先下降后升高，发酵液初始糖度为31%时，果酒总糖最高，为5.95 g/L。果汁中的糖分在酵母菌的作用下分解产生酒精和CO2等物质，适宜的初始糖度能够有效促进酵母代谢和繁殖。因此在一定范围内，果酒酒精度随着初始糖度增加而增加，当初始糖度大于一定范围时，渗透压的变化会使酵母菌的代谢和繁殖受到抑制，甚至导致死亡[26]，同时过高的初始糖度还会增加成本。当初始糖度达到29%时，果酒酒精度最高，为9.96%vol。
2.2 正交试验
基于单因素试验结果，设计L9（34）正交试验，结果见表3。
表3 发酵正交试验结果
Table 3 Fermentation orthogonal experiment results
试验号 A初始pH值B主发酵温度C酵母接种量D初始糖度 酒精度/%vol 1 1 1 1 1 8.30±0.09 2 1 2 2 2 12.55±0.35 3 1 3 3 3 9.28±0.16 4 2 1 2 3 10.27±0.12 5 2 2 3 1 9.99±0.28 6 2 3 1 2 9.58±0.18 7 3 1 3 2 10.65±0.08 8 3 2 1 3 11.13±0.12 9 3 3 2 1 9.79±0.12 k1 10.04 9.74 9.67 9.36 k2 9.95 11.22 10.87 10.93 k3 10.52 9.55 9.97 10.23 R 0.58 1.67 1.20 1.57
影响红泡刺藤果酒发酵的4个因素中，按各因素对酒精度的影响，从大到小依次为B＞D＞C＞A，即主发酵温度＞初始糖度＞酵母接种量＞初始pH值。通过k值比较可知组合A3B2C2D2最优，正交试验结果则表明试验2组为最佳发酵工艺组合A1B2C2D2，需进一步验证。验证试验结果见表4。
表4 验证试验结果
Table 4 The result of validation experiment
（g/L） pH值 感官评分A1B2C2D212.79±0.36试验组 酒精度/（%vol）总酸/（g/L）可溶性固形物/（°Bx）总糖/6.08±0.18 3.89±0.01 3.39±0.09 3.75±0.01 92.4±0.4 A3B2C2D212.61±0.19 7.97±0.15 4.49±0.04 3.72±0.16 3.72±0.02 91.6±0.3
经验证，组合A1B2C2D2的酒精度与感官评分均大于组合A3B2C2D2，即初始pH值为3.3，主发酵温度为30℃，酵母接种量为0.5%，初始糖度为29%为最适工艺。在最适发酵工艺下，所得红泡刺藤果酒酒精度为12.79%vol，总酸为 6.08 g/L，可溶性固形物为 3.89 °Bx，总糖为3.39 g/L，pH值为3.75。果酒色泽：鲜明、协调、有光泽、酒红色；透明度：澄清透亮、无杂质和沉淀；香气：具有纯正果香与和谐酒香；滋味：酒体较丰满、酸甜适当；感官评分为92.4分。
2.3 果酒抗氧化性分析
羟基自由基可通过加成、脱氢或电子转移等方法与体内的多种分子发生反应，从而造成营养物质及细胞组织的氧化，可能导致细胞坏死或突变。通过比较稀释后红泡刺藤果酒的DPPH自由基的清除能力和羟基自由基清除能力，可以反映红泡刺藤果酒抗氧化性的强弱[27]，具体结果见图5。
图5 DPPH自由基和羟基自由基清除率比较
Fig.5 Comparison of DPPH·and hydroxyl radical scavenging rate
由图5可知，稀释后20倍的红泡刺藤果酒的DPPH自由基和羟基自由基清除率显著高于5 mg/L的维生素C溶液。
2.4 挥发性风味物质分析
果酒中的挥发风味物质，既受果实本身挥发性风味物质的影响，又与发酵过程中微生物的代谢密切相关[28]。在不同的发酵工艺下，果酒的挥发性风味物质不同[29]。感官最优的红泡刺藤果酒的挥发性物质分析结果见表5。
表5 红泡刺藤果酒中挥发性物质分析
Table 5 Analysis of volatile flavor components in R.niveus
fruit wine
种类 序号 化合物 相对含量/%醇类 1 2，3-丁二醇 31.47 2 （R，R）-（-）-2，3-丁二醇 1.78 3 3-呋喃甲醇 0.91 4丙三醇 16.41 5 （6-甲基-2-吡嗪基）甲醇 0.20 6对羟基苯乙醇 0.86酯类 7 乙酸乙酯 10.84 8 2-甲基乙酰乙酸乙酯 0.49 9琥珀酸单乙酯 8.27 10 丁二酸二乙酯 0.32 11 （±）-3-羟基-r-丁内酯 0.15 12 己二酸二辛酯 0.99 13 己二酸二（2-乙基己）酯 0.74酸类 14 醋酸 6.39 15 糠酸 0.57酸酐类 16 柠康酸酐 1.90 17 丁二酸酐 0.17酮类 18 4-羟基-2-丁酮 0.17 19 4-羟基-2，5-二甲基-3（2H）呋喃酮 0.72 20 2-呋喃基羟基甲基甲酮 1.85 21 2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮 8.47 22 3，5-二羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮 0.25醛类 23 异戊醛 0.22 24 糠醛 3.88 25 苯乙醛 0.17 26 5-羟甲基糠醛 1.56醚类 27 2-乙酰呋喃 0.15
由表5可知，红泡刺藤果酒中检测并鉴定出27种挥发性成分，其中包含醇类物质6种，总相对含量为51.63%；酯类物质7种，总相对含量为21.80%；酸类物质2种，相对含量为6.96%；酸酐类物质2种，相对含量为2.07%；酮类物质5种，相对含量为11.46%；醛类物质4种，相对含量为5.83%，醚类物质1种，相对含量为0.15%。相对含量较大挥发性风味物质为醇类、酯类和酮类物质（占总挥发性物质的84.89%），是构成红泡刺藤果酒挥发性风味成分的主要基础物质。
3 结论
本研究在单因素试验的基础上，采用正交试验优化红泡刺藤果酒发酵工艺，考察初始pH值、主发酵温度、酵母接种量、初始糖度4个因素对果酒品质和感官评分的影响。初步探索得到红泡刺藤果酒的最适发酵条件：初始pH3.3，主发酵温度30℃，酵母接种量0.5%，初始糖度29%，所得红泡刺藤果酒酒精度为12.79%vol，总酸为 6.08 g/L，可溶性固形物为 3.89 °Bx，总糖为3.39 g/L，pH值为3.75。此时果酒色泽鲜明、协调、有光泽、酒红色；透明度澄清透亮、无杂质和沉淀；具有纯正果香与和谐酒香；酒体较丰满，酸甜适当；感官评分92.4分。抗氧化活性方面，稀释20倍后的红泡刺藤果酒对DPPH自由基和羟基自由基的清除率均显著高于5 mg/L维生素C溶液。挥发性风味物质分析表明，红泡刺藤果酒中的醇类、酯类和酮类物质为其挥发性风味物质的主要基础物质，占总挥发性风味物质的84.89%。研究填补了红泡刺藤果酒发酵工艺上的研究空白，为高值化综合加工利用红泡刺藤资源提供了新的途径。
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