香菇，也被称为花菇、香蘑等，属担子菌纲伞菌目口蘑科香菇属[1]，起源于中国，是中国著名的食药两用食用菌[2]，也是全球第二大食用菌。它营养丰富，口味独特，食用和药用价值很高[3]，有“菌菇皇后”、“菇中之王”之称[4]。香菇多糖（lentinan，LNT）是香菇中重要生物活性成分。LNT 具有抗病毒[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、增强免疫力[8]、抗辐射[9]、降血糖[10]、抗衰老[11]等功效，在食品、保健、生物医药和临床等方面被广泛应用[12]。
目前，提取多糖的方法主要有热水浸提、酶解[13]、微波辅助[14]、超声波辅助[15]等，这些方法各有优劣。表面活性剂提取是近年发展起来的一种先进的提取方法，它利用其润湿、渗透和增溶的作用，来提高提取效率，它具有条件温和、成本低、环保、安全的优点，可工业化应用[16-18]。双频超声辅助提取是一种新的现代提取方法，该方法避免了单频超声声场不均匀、空化效应不完全而影响提取效率的问题[19]。吐温食品级表面活性剂具有经济、方便、低毒等优点，越来越多地用于保健食品的提取[20]。本研究通过表面活性剂协同双频超声波辅助提取LNT，来增强LNT提取效果，并对其抗氧化活性进行研究，为后续LNT的开发利用和工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香菇：西峡县雷氏菇品购销有限公司；吐温-80（Tw-80）、葡萄糖、苯酚、硫酸、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；联苯双酯、四氯化碳（均为分析纯）：郑州化学试剂厂；DPPH试剂：上海浩洋生物科技有限公司；维生素C：华北制药股份有限公司；水杨酸、硫酸亚铁、H2O2（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
智能温控双频超声波萃取仪（BILON-2009）：上海比朗仪器制造有限公司；旋转蒸发器（RE-3000A）：上海耀特仪器设备有限公司；紫外-可见分光光度计（760CRT）：上海仪电分析仪器有限公司；电动搅拌器（D2015W）：上海梅颖浦仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 LNT的提取
香菇→干燥→粉碎→过80目筛→密封保存备用→称取一定质量的香菇粉末→加入一定浓度的吐温-80溶液→双频超声波辅助提取→提取液Sevag法[21]脱蛋白→离心（5 000 r/min，10 min）→上清液旋转蒸发浓缩→3倍体积95%乙醇进行沉淀→放入4℃冰箱，静置24 h→离心（5 000 r/min，10 min）→真空冷冻干燥→香菇粗多糖。
1.3.2 LNT的测定
LNT的测定采用苯酚-硫酸法[22]。
1.3.3 LNT提取率的计算
LNT提取率的计算公式如下。
提取率/%=（提取的多糖量/提取的香菇粉样品量）×100
1.3.4 LNT提取试验设计
1.3.4.1 单因素试验设计
按1.3.1的方法，称取10 g香菇粉5份进行表面活性剂协同双频超声波辅助提取LNT，研究不同因素对LNT提取率的影响。固定条件：料液比1∶30（g/mL）、表面活性剂用量2.0%、超声频率（20+40）kHz，超声时间 30 min。分别设定料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），表面活性剂用量为 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，超声频率为（20+35）、（25+35）、（20+40）、（25+40）、（35+40）kHz，超声时间为 20、25、30、35、40 min，进行单因素试验。每组重复3次，取平均值。
1.3.4.2 正交试验设计
在预试验和单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验优化提取工艺。试验水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factor levels table of orthogonal experimental design
水平D超声时间/min 1 1∶20 1.5 25+35 25 2 1∶30 2.0 20+40 30 3 1∶40 2.5 25+40 35因素A料液比/（g/mL）B表面活性剂用量/%C超声频率/kHz
1.3.5 LNT的抗氧化活性试验设计
1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定
参照秦生华等[23]的方法，在517 nm波长处测吸光度。按下式计算DPPH自由基清除率。
式中：A0为空白组的吸光度；A1为样品组或阳性对照组的吸光度；A2为对照组吸光度。
1.3.5.2 羟基自由基清除率的测定
参照扈芷怡等[24]的方法，在510 nm波长处测吸光度。按下式计算羟基自由基自由基清除率。
式中：A3为空白组的吸光度；A4为样品组或阳性对照组的吸光度；A5为对照组吸光度。
1.3.6 数据处理
试验数据采用Excel整理，数据分析采用正交设计助手进行。
2 结果与分析
2.1 LNT提取工艺条件优化
2.1.1 料液比对多糖提取率的影响
料液比对香菇多糖提取率的影响见图1。
图1 料液比对香菇多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the lentinan extraction rate
由图1可知，随着溶剂用量的增加，LNT提取率先升高后略微降低。这是因为增加溶剂用量，溶液黏度会减小，多糖扩散和传质速率增加，利于多糖溶出和提取率升高。但料液比达到1∶30（g/mL）时，多糖基本完全溶出，再增加溶剂用量，其它杂质也可能被溶出，影响提取率，使提取率略微下降。这与韩淑琴等[25]的研究结果趋势相似。因此，取料液比1∶30（g/mL）为佳。
2.1.2 表面活性剂用量对多糖提取率的影响
表面活性剂用量对香菇多糖提取率的影响见图2。
图2 表面活性剂用量对香菇多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of surfactant dosage on the lentinan extraction rate
由图2可知，随表面活性剂用量的增大，LNT提取率先升高后降低。这是因为，增大表面活性剂用量，多糖的增溶和扩散作用增强，多糖溶出增多，提取率升高；当表面活性剂达到2.0%时，其增溶和扩散作用达到最大，再继续增大用量，多糖溶出也不会明显升高，而趋于稳定。这与洪松彬等[26]的研究结果基本相似。因此，取表面活性剂用量2.0%为佳。
2.1.3 超声频率对多糖提取率的影响
超声频率对香菇多糖提取率的影响见图3。
图3 超声频率对香菇多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on the lentinan extraction rate
由图3可知，随着超声频率的变化，LNT提取率先升高再降低。这是因为增加超声频率，其空化和机械作用增强，多糖的溶出增多，提取率升高。但当超声频率超过（20+40）kHz时，再继续增加超声频率，一是多糖的结构会被部分破坏，二是其它杂质也会溶出，影响了多糖的溶解，降低提取率。这与杨丽维等[27]的研究结果基本一致。因此，取超声频率（20+40）kHz为佳。
2.1.4 超声时间对多糖提取率的影响
超声时间对香菇多糖提取率的影响见图4。
图4 超声时间对香菇多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on the lentinan extraction rate
由图4可知，随着超声时间的增加，LNT提取率先升高后缓慢下降。这是因为增加超声时间，多糖受到表面活性剂增溶和超声波空化作用的增强，多糖溶出加快，提取率升高。但当超声时间达到30 min时，增溶基本完全，再增加超声时间，多糖的部分结构会被不同程度的破坏，降低提取率。这与杨丽维等[27]的研究结果相近。因此，取提取时间30 min为佳。
2.1.5 LNT提取正交试验结果
LNT提取的正交试验结果见表2，LNT提取的方差分析结果见表3。
表2 正交试验结果
Table 2 The result of orthogonal experimental design
试验号A料液比/（g/mL）B表面活性剂用量/%C超声频率/kHz D超声时间/min LNT提取率/%1 1:20 1.5 25+35 25 8.41 2 1:20 2.0 20+40 30 9.79 3 1:20 2.5 25+40 35 12.38 4 1:30 1.5 20+40 35 10.26 5 1:30 2.0 25+40 25 14.12 6 1:30 2.5 25+35 30 13.78 7 1:40 1.5 25+40 30 12.53 8 1:40 2.0 25+35 35 13.41 9 1:40 2.5 20+40 25 13.83 k1 10.193 10.400 11.867 12.120 k2 12.720 12.440 11.293 12.033 k3 13.257 13.330 13.010 12.017 R 3.064 2.930 1.717 0.103
表3 方差分析结果
Table 3 The variance analysis results
注：*表示差异显著（P＜0.05）。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A料液比 16.056 2 892.000 19.000 *B表面活性剂用量 13.539 2 752.167 19.000 *C超声频率 4.583 2 254.611 19.000 *D超声时间 0.018 2 1.000 19.000误差 0.02 2
由表2、表3结果分析可知，各因素影响顺序为A＞B＞C＞D，最优组合为 A3B3C3D1。料液比、表面活性剂用量和超声频率对LNT提取率的影响显著，其它不显著。通过K值的分析，确定最佳工艺参数为料液比1∶40（g/mL），表面活性剂用量 2.5%，超声频率（25+40）kHz和超声时间25 min。在此最佳条件下做验证试验，重复5次，LNT提取率分别为14.13%、14.15%、14.18%、14.19%、14.17%，平均为14.16%（5次平均值），相对标准偏差为0.17%（n=5），表明此优化工艺方法稳定可靠。
2.2 对比试验
为了对比表面活性剂协同双频超声波辅助提取法与单一超声辅助和单一表面活性剂法提取LNT不同，根据付丽娜等[28]超声波提取条件略有改变和杨静娟等[29]表面活性剂提取条件略有改变，研究不同提取方式对LNT提取率的影响见表4。
表4 不同提取方法对LNT提取率的影响
Table 4 Effect of different extraction methods on the extraction rate of LNT
提取方法料液比/（g/mL）表面活性剂用量/%超声频率/kHz超声功率/W提取时间/min LNT提取率/%表面活性剂协同双频超声波辅助提取法1∶40 2.5% 25+40 25 14.15±0.03images/BZ_68_1823_664_1824_666.png超声辅助法 1∶40 300 40 10.73±0.02表面活性剂法 1∶40 2.5% 60 11.26±0.05
由表4可知，表面活性剂协同双频超声波辅助提取LNT与其它两种方法相比，所得LNT提取率明显提高，并且提取时间比其它两种方法更短，说明表面活性剂协同双频超声波辅助提取LNT更高效、省时。
2.3 抗氧化活性研究
2.3.1 LNT对DPPH自由基清除率的影响
LNT对DPPH自由基清除率的影响见图5。
图5 LNT对DPPH自由基清除率的影响
Fig.5 Effect of LNT on the clearance rate of DPPH free radicals
由图5可知，在试验测定的质量浓度范围内，随着LNT质量浓度的增加，对DPPH自由基清除率逐渐增强。当LNT质量浓度为25 mg/mL时，清除率为78.51%，与相同质量浓度的VC的清除率相近，表明其对DPPH自由基具有较强的清除能力。
2.3.2 LNT对羟基自由基的清除率的影响
LNT对羟基自由基清除率的影响见图6。
图6 LNT对羟基自由基清除率的影响
Fig.6 Effect of LNT on the clearance rate of OH·free radicals
由图6可知，在试验测定的质量浓度范围内，随着LNT浓度的增加，对羟基自由基的清除率逐渐增强，并呈现良好的正相关，当LNT质量浓度为25 mg/mL时，清除率为82.28%，其清除率和VC相近，表明其对羟基自由基具有较强的清除能力。
3 结论
本试验工艺采用表面活性剂协同双频超声波辅助提取 LNT，得到最优工艺条件：料液比 1∶40（g/mL），表面活性剂用量2.5%，超声频率（25+40）kHz，超声时间25 min。在此条件下，LNT提取率为14.16%。该方法高效、环保、易操作。LNT抗氧化活性研究表明，在一定的质量浓度范围内，LNT对DPPH自由基和羟基自由基的清除率随着质量浓度的增加而升高，当LNT质量浓度为25 mg/mL时，其对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别为78.51%和82.28%，表明LNT具有较强的抗氧化活性。本试验工艺方法可为LNT的提取与工业应用提供一种参考，而对LNT结构、组成及其生物活性的影响等，有待进一步研究。
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