黄秋葵[Abelmoschus esculentus（Linn.）Moench]又名糊麻、秋葵、羊角豆、补肾菜，是一年生药食两用的蔬菜。原产于非洲，现已在世界不同国家/地区种植，主要分布在热带、亚热带等地区[1]。近年来，黄秋葵在中国很多省份也得到广泛的种植，如江苏、湖南、江西、广东、贵州等。秋葵嫩果富含多糖、多酚、黄酮等生物活性物质，具有广泛的生理功能，如抗氧化、降血脂和降血糖等[2-3]。
黄秋葵既可以作为日常蔬菜直接食用，又可以作为新型食品和药品开发的新资源。目前黄秋葵的产品形式有秋葵饮料、秋葵泡菜、秋葵茶、秋葵脆等。未来黄秋葵的发展方向是通过合适的加工方式提高黄秋葵活性成分的利用率。乳酸菌本身不仅具有清除自由基的能力，并且可以通过发酵提高发酵液的抗氧化能力。有研究报道，经乳酸菌发酵的蓝莓[4]、卷心菜[5]等发酵液中总多酚含量和抗氧化活性显著提高；同时，不同乳酸菌发酵桂圆肉，桂圆肉中酚类物质的释放和清除自由基的能力也随发酵剂的不同发生显著变化[6]。因此，本研究利用不同乳酸菌发酵黄秋葵汁液，以求筛选合适的发酵剂，增加黄秋葵发酵汁液中活性成分的含量。但是，即使一种食物中含有丰富活性成分也不能反映其在体内生物利用度。通过人体实验或动物实验研究活性成分在机体消化和吸收过程中的变化存在一定困难，体外模拟消化具有操作简单、试验条件易于控制、试验周期较短等优点，是研究食物在人体消化过程中变化的重要途径。目前，体外模拟消化已广泛应用于食品营养素消化率、生物利用度、结构变化以及对某些植物化学物质和抗氧化活性的影响[7]。
目前不同发酵剂发酵对黄秋葵活性成分的释放和利用率变化的影响研究基本空白，本研究以新鲜黄秋葵为原料，以植物乳杆菌、干酪乳酸杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌为发酵剂，对不同乳酸菌发酵的黄秋葵进行体外消化，并对含量变化及抗氧化活性进行了评价。为丰富黄秋葵的加工形式、提高黄秋葵活性成分的利用、明确消化过程中乳酸菌发酵对酚类物质和抗氧化稳定性的影响、筛选更为合适的发酵剂提供基础理论数据和思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄秋葵：市售。碳酸钠、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、乙醇、氯化钾、磷酸二氢钾、硫氰化钾、硫酸钠、氯化钠、碳酸氢钠、尿素、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）（98%）、2，2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS]：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；没食子酸、福林酚、α-淀粉酶（380 U/mg）、胰酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胆汁盐：北京索莱宝科技有限公司。以上试剂均为分析纯。菌种（植物乳杆菌、干酪乳酸杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌）：山东中科嘉亿生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
T6型新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；恒温振荡培养箱（ZQWY-218N型）：上海知楚仪器有限公司；FE20实验室pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PL3002电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JYL-Y912破壁机：杭州九阳生活电器有限公司；ST16R冷冻离心机：美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 方法
1.3.1 黄秋葵发酵液制备
将新鲜的黄秋葵去蒂洗净，沸水中热烫5 min，灭酶，切块打浆后得到黄秋葵汁液，于90℃热杀菌10min，然后水浴冷却。将不同的乳酸菌按黄秋葵汁液质量的5%进行接种，置于37℃条件下培养24 h，得到黄秋葵发酵液，于-80℃冰箱下保存待测。
1.3.2 体外模拟消化试验
参考Wang等[8]、KOH等[9]的研究方法，略作修改。
口腔消化过程：用0.1mol/L的HCl将人造唾液培养基（290 mg α-淀粉酶，89.6 g/L KCl，175.3 g/L NaCl，88.8 g/L NaH2PO4，20.0 g/L KSCN，57.0 g/LNa2SO4，84.7 g/L NaHCO3，2.0 g/L尿素）的pH值调至6.8，备用。然后将20 mL发酵液样品与6 mL人造唾液培养基混合均匀后放入含有40 mL蒸馏水的烧瓶中，并在恒温振荡培养箱中37℃培养5 min。然后将10 mL唾液培养基转移到新的试管中并在沸水中保持5 min以停止反应。冷却后，将试管中培养基的pH值调节至中性，然后在10 000×g、4℃下离心10 min。得到的上清液为口腔消化组样品，之后进行成分测定及活性检测，所有试验平行测定3次。
模拟胃消化过程：用HCl（6 mol/L）将剩余培养基的pH值调节至2.0，并加入溶解在0.1 mol/L HCl中的胃蛋白酶（15 mg）开始胃消化。然后将混合物在37℃下孵育2h。胃消化过程中，每隔30min取出10mL胃培养基，用NaOH（0.1 mol/L）将pH值调节至7.0以停止反应。将取出的消化液在10 000×g、4℃下离心10 min，得到的上清液为胃消化样品，之后进行成分测定及活性检测，所有试验平行测定3次。
模拟肠道消化过程：用NaHCO3（0.5 mol/L）将剩余胃培养基的pH值调节至6.5，并向溶液中加入5 mL胰酶（8 mg/mL）和胆汁盐（50 mg/mL）的混合物。并在37℃下再孵育4h。肠道消化过程每隔60min取出10mL肠内培养基。然后将取出的消化液在4℃、10 000×g条件下离心10 min，得到的上清液为肠道消化样品，之后进行成分测定及活性检测，所有试验平行测定3次。
1.3.3 总多酚含量测定
参照Meda等[10]的方法并稍作修改。将1 mL样品与5 mL 10%的福林酚试剂混合均匀，反应6 min后，用4 mL 7.5%的碳酸钠溶液中和。将上述混合物在室温（25℃）、黑暗环境放置30 min，在765 nm处测定吸光度。对照组用蒸馏水代替样品溶液和福林酚试剂，以没食子酸作为标准品计算总多酚含量，线性回归方程y=0.010 3x+0.003 7，R2=0.998 1。多酚含量以mg没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）/100 g鲜重（fresh weight，FW），即 mg GAE/100 g FW 表示。
1.3.4 抗氧化能力测定
1.3.4.1 DPPH自由基清除能力测定
取1 mL样品加入4 mL DPPH-乙醇（0.1 mmol/L）溶液，混合均匀并在室温（25℃）下静置20 min。以蒸馏水代替样品作对照，并用蒸馏水作为空白调零[11]。在517 nm处测定吸光度，计算公式如下。
式中：A0为对照品吸光度；A1为样品吸光度。
1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力测定
参照Gowd等[12]方法，略作修改。将7.0 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液（1∶1，体积比）混合，并在室温（25℃）下避光保存12 h～16 h以形成ABTS工作液。将新鲜制备的ABTS溶液在734 nm处的吸光度调为0.7±0.02。将1.3.2中制备的3种消化液、样品和空白（甲醇）各0.5 mL加入ABTS工作液4.5 mL，并使用涡旋混合器充分混合，在黑暗中于25℃的水浴中孵育10 min。在734 nm波长处测定吸光度。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
式中：A0为对照品吸光度；A1为样品吸光度。
1.3.5 统计分析
所有试验均重复3次，使用Origin pro 2018C软件绘图，采用SPSS 22.0软件进行数据处理，平均值的差异性采用单因素方差分析（one-way ANOVA）中的最小显著性差异法（least significant difference，LSD）进行检验，P＜0.05表示差异显著。数值用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 体外模拟消化过程中总多酚含量变化规律
黄秋葵模拟体外消化过程中总多酚释放量的变化见图1。
图1 黄秋葵模拟体外消化过程中多酚释放量的变化
Fig.1 Changes in total polyphenols of okra in vitro digestion
A.植物乳杆菌发酵液模拟消化；B.干酪乳酸杆菌发酵液模拟消化；C.鼠李糖乳杆菌发酵液模拟消化；D.长双歧杆菌发酵液模拟消化。小写字母不同表示同一消化时间差异显著（P＜0.05）；大写字母不同表示组内差异显著（P＜0.05）。
模拟体外消化前，由图1可知，经植物乳杆菌（70.74mg GAE/100gFW）和鼠李糖乳杆菌（64.45mg GAE/100 g FW）发酵以后的黄秋葵汁液总多酚含量比未发酵组（60.86 mg GAE/100 g FW）显著升高（P＜0.05），分别提高了1.16倍和1.06倍。而经干酪乳酸杆菌（60.07 mg GAE/100gFW）和长双歧杆菌（58.42mg GAE/100 g FW）发酵的黄秋葵汁液中总多酚含量与未发酵组对比，并未发生显著变化。有研究表明微生物可以产生果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶，这些酶可以有效地将不溶性的结合酚转化为可溶性多酚[13]。
模拟口腔消化过程，发酵黄秋葵与未发酵组的多酚释放量在消化5 min内，有一定的提高，但差异均不显著（P＞0.05）。模拟体外胃消化过程中，黄秋葵多酚释放量在消化30min内显著升高，达到释放最高点（P＜0.05），各乳酸菌发酵后的多酚释放量分别为76.79、63.95、69.80、62.98mg GAE/100g FW，并在之后的胃消化过程中，多酚释放量趋于稳定（P＞0.05）；其中经植物乳杆菌发酵的黄秋葵在胃消化的30min内多酚释放量最大，未发酵组多酚释放量变化最显著，由65.85mg GAE/100g FW降低至49.95 mg GAE/100 g FW，减少24.15%。在胃消化结束时，经过不同乳酸菌发酵的多酚释放量分别为64.53、59.66、59.27、56.41 mg GAE/100 g FW。
在体外模拟肠道消化过程中，未发酵的黄秋葵多酚释放量从47.89mg GAE/100g显著降低到40.28mg GAE/100 g FW（P＜0.05）。植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌发酵的黄秋葵多酚释放量经过肠消化以后虽然也显著降低，但是显著高于未发酵组。在肠消化结束时，经过不同乳酸菌发酵的多酚释放量分别为46.42、40.36、44.22、49.20 mg GAE/100 g FW。由上述结果可知，模拟人体消化后植物乳杆菌发酵的消化液中多酚的损失量最低，为29.92%。
经过模拟口腔消化，发现多酚释放量小幅增加，可能是由于与多糖结合的酚类物质在淀粉酶的作用下被释放出来。模拟胃液消化后的多酚类物质释放量在前30 min达到最高值，后续明显减少，表明模拟胃消化初期，强酸环境和胃蛋白酶的存在下，胃蛋白酶会分解蛋白质，从而使一些与蛋白质结合的多酚类物质释放出来，同时酸水解破坏酚类物质与其它物质之间的化学键，促进多酚的释放，随着消化时间的延长，多酚长时间暴露在强酸环境造成多酚的降解，但是无明显变化[14]。在模拟肠道消化过程中，多酚释放量明显减少，可能是多个酚羟基结构的多酚在碱性环境中不稳定，易发生降解[15]。有研究表明，柑橘[16]、南酸枣[17]等食物中的酚物质主要在模拟胃消化过程中释放，大部分多酚在模拟胃液条件中稳定存在，而在模拟肠液条件下发生降解，与本文研究结果一致。
2.2 体外模拟消化过程中抗氧化活性的变化规律
由于模拟体外消化过程对抗氧化成分的含量和结构都产生很大的影响，所以研究消化过程抗氧化能力的变化也十分重要。本文采用DPPH、ABTS法测定乳酸菌发酵黄秋葵样品在模拟人体消化过程中抗氧化能力的动态变化，结果见图2、图3。
图2 黄秋葵模拟胃肠消化过程中抗氧化活性（DPPH·）的变化
Fig.2 Changes in antioxidant activity（DPPH·）of citrus okra in vitro digestion
A.植物乳杆菌发酵液模拟消化；B.干酪乳酸杆菌发酵液模拟消化；C.鼠李糖乳杆菌发酵液模拟消化；D.长双歧杆菌发酵液模拟消化。小写字母不同表示同一消化时间差异显著（P＜0.05）；大写字母不同表示组内差异显著（P＜0.05）。
模拟消化前，由图2可知，0 min经不同乳酸菌发酵以后的黄秋葵汁液对DPPH自由基清除率都显著高于未发酵组样品（P＜0.05）。消化前各乳酸菌发酵组DPPH自由基的清除率分别为61.06%、52.05%、55.17%、59.62%。黄秋葵发酵液对DPPH自由基清除率随着消化过程中总多酚含量的变化而变化。在经过体外模拟胃消化30 min时，DPPH自由基清除率达到最高；之后随着消化时间的延长，总多酚的含量不断降低，清除率也不断降低。但是在消化结束时，植物乳杆菌（49.26%）和干酪乳酸杆菌（41.39%）发酵的样品对DPPH自由基清除率显著高于未发酵组（34.10%）（P＜0.05）。
图3 黄秋葵模拟胃肠消化过程中抗氧化活性（ABTS+·）的变化
Fig.3 Changes in antioxidant activity（ABTS+·）of citrus okra in vitro digestion
A.植物乳杆菌发酵液模拟消化；B.干酪乳酸杆菌发酵液模拟消化；C.鼠李糖乳杆菌发酵液模拟消化；D.长双歧杆菌发酵液模拟消化。小写字母不同表示同一消化时间差异显著（P＜0.05）；大写字母不同表示组内差异显著（P＜0.05）。
模拟消化前，由图3可知，经不同乳酸菌发酵后的黄秋葵汁液对ABTS+自由基清除率都显著高于未发酵组样品（P＜0.05）。消化前各乳酸菌发酵组的ABTS+自由基清除率分别为57.06%、47.32%、50.35%、55.26%。黄秋葵发酵液对ABTS+自由基清除率随着消化过程中总多酚含量的变化而变化。在消化结束时，由植物乳杆菌（44.56%）发酵的样品对ABTS+自由基清除率显著高于未发酵组（29.14%）（P＜0.05）。由上述结果可知，在消化终点，植物乳杆菌发酵的黄秋葵消化液清除DPPH自由基、ABTS+自由基的能力是未发酵组的1.44、1.53倍。
结果表明发酵液的抗氧化能力与总多酚含量呈正相关。Bouayed等[18]和Jiao等[19]研究了苹果和蓝莓模拟胃肠道消化过程中多酚类和抗氧化活性的变化，同样发现抗氧化能力与酚类化合物的含量成正比关系。发酵后抗氧化能力增强可能是乳酸菌发酵释放具有抗氧化能力的酶或者促进发酵样品中结合态的活性成分释放，还有可能是由于乳酸菌本身具有的抗氧化能力。
3 结论
通过对比不同乳酸菌发酵的黄秋葵样品，在模拟体外消化过程中总多酚及抗氧化性的动态变化，以求筛选合适的发酵剂，为丰富提高黄秋葵活性成分吸收的加工方式提供数据支撑。结果表明，经植物乳杆菌发酵以后的黄秋葵汁液中总多酚含量是未发酵组的1.16倍。模拟人体消化后植物乳杆菌发酵的消化液中多酚的损失量最低，为29.92%。在消化终点，植物乳杆菌发酵的黄秋葵消化液清除DPPH自由基、ABTS+自由基的能力是未发酵组的1.44、1.53倍。综上，植物乳杆菌发酵是提高黄秋葵中多酚含量和生物可及性的有效方式。
[1]XIA F B,ZHONG Y,LI M Q,et al.Antioxidant and anti-fatigue constituents of okra[J].Nutrients,2015,7(10):8846-8858.
[2]JIANG N,LIU C Q,LI D J,et al.Evaluation of freeze drying combined with microwave vacuum drying for functional okra snacks:Antioxidant properties,sensory quality,and energy consumption[J].LWT-Food Science and Technology,2017,82:216-226.
[3]GAO H,ZHANG W C,WANG B S,et al.Purification,characterization and anti-fatigue activity of polysaccharide fractions from okra(Abelmoschus esculentus(L.)Moench)[J].Food&Function,2018,9(2):1088-1101.
[4]CHENG Y X,WU T,TANG S X,et al.Fermented blueberry pomace ameliorates intestinal barrier function through the NF-κB-MLCK signaling pathway in high-fat diet mice[J].Food&Function,2020,11(4):3167-3179.
[5]KUSZNIEREWICZ B,
MIECHOWSKA A,BARTOSZEK A,et al.The effect of heating and fermenting on antioxidant properties of white cabbage[J].Food Chemistry,2008,108(3):853-861.
[6]赖婷,刘磊,张名位,等.不同乳酸菌发酵对桂圆肉中酚类物质及抗氧化活性的影响[J].中国农业科学,2016,49(10):1979-1989.LAI Ting,LIU Lei,ZHANG Mingwei,et al.Effect of lactic acid bacteria fermentation on phenolic profiles and antioxidant activity of dried longan flesh[J].Scientia Agricultura Sinica,2016,49(10):1979-1989.
[7]PINACHO R,CAVERO R Y,ASTIASARÁN I,et al.Phenolic compounds of blackthorn (Prunus spinosa L.)and influence of in vitro digestion on their antioxidant capacity[J].Journal of Functional Foods,2015,19:49-62.
[8]WANG C,LI W W,CHEN Z Q,et al.Effects of simulated gastrointestinal digestion in vitro on the chemical properties,antioxidant activity,α-amylase and α-glucosidase inhibitory activity of polysaccharides from Inonotus obliquus[J].Food Research International,2018,103:280-288.
[9]KOH J,XU Z M,WICKER L.Blueberry pectin and increased anthocyanins stability under in vitro digestion[J].Food Chemistry,2020,302:125343.
[10]MEDA A,LAMIEN C E,ROMITO M,et al.Determination of the total phenolic,flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey,as well as their radical scavenging activity[J].Food Chemistry,2005,91(3):571-577.
[11]ARISE A K,ALASHI A M,NWACHUKWU I D,et al.Antioxidant activities of Bambara groundnut(Vigna subterranea)protein hydrolysates and their membrane ultrafiltration fractions[J].Food&Function,2016,7(5):2431-2437.
[12]GOWD V,BAO T,WANG L L,et al.Antioxidant and antidiabetic activity of blackberry after gastrointestinal digestion and human gut microbiota fermentation[J].Food Chemistry,2018,269:618-627.
[13]ACOSTA-ESTRADA B A,GUTIÉRREZ-URIBE J A,SERNASALDÍVAR S O.Bound phenolics in foods,a review[J].Food Chemistry,2014,152:46-55.
[14]GOULAS V,HADJISOLOMOU A.Dynamic changes in targeted phenolic compounds and antioxidant potency of carob fruit(Ceratonia siliqua L.)products during in vitro digestion[J].LWT-Food Science and Technology,2019,101:269-275.
[15]SVEDSTRÖM U,VUORELA H,KOSTIAINEN R,et al.Fractionation of polyphenols in hawthorn into polymeric procyanidins,phenolic acids and flavonoids prior to high-performance liquid chromatographic analysis[J].Journal of Chromatography A,2006,1112(1/2):103-111.
[16]从彦丽,彭梦雪,刘冬,等.柑橘在体外模拟胃肠消化过程中总多酚、总黄酮及总抗氧化活性的变化规律[J].食品科学,2016,37(17):96-103.CONG Yanli,PENG Mengxue,LIU Dong,et al.Changes in total polyphenols,total flavonoids and antioxidant activity of Citrus during in vitro gastrointestinal digestion process[J].Food Science,2016,37(17):96-103.
[17]王谢祎,翟宇鑫,李倩,等.南酸枣在模拟消化过程中抗氧化活性及多酚含量分析[J].食品科学,2016,37(11):7-11.WANG Xieyi,ZHAI Yuxin,LI Qian,et al.Changes in antioxidant activity and phenol content in Choerospondias axillaris fruits during simulated gastrointestinal digestion[J].Food Science,2016,37(11):7-11.
[18]BOUAYED J,HOFFMANN L,BOHN T.Total phenolics,flavonoids,anthocyanins and antioxidant activity following simulated gastrointestinal digestion and dialysis of apple varieties:Bioaccessibility and potential uptake[J].Food Chemistry,2011,128(1):14-21.
[19]JIAO X Y,LI B,ZHANG Q,et al.Effect of in vitro-simulated gastrointestinal digestion on the stability and antioxidant activity of blueberry polyphenols and their cellular antioxidant activity towards HepG2 cells[J].International Journal of Food Science&Technology,2018,53(1):61-71.