近年来，乳酸菌作为一种具有保健功能的优质天然抗氧化剂备受关注。有研究表明，乳酸菌可控制肠道微生态平衡，并有较好的抗氧化性和疏水性，能够提高糖苷型大豆异黄酮的转化率[1]，较高的抗氧化活性具有预防和治疗氧化损伤、清除自由基、抑制脂质过氧化物的形成等重要生理功能[2]，因此在发酵制品中广泛应用。而乳酸菌发酵制品中，发酵饮料是功能性食品研究热点，乳酸菌作为发酵饮料的关键因素之一，不仅能改善发酵饮料的营养、风味，一些功能独特的乳酸菌还可用于提高发酵饮料功能性，如副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）YJ1使发酵树莓汁中总黄酮和总酚含量分别增加了23.00%、18.58%，DPPH自由基和羟基自由基清除能力分别提高了22.92%、15.63%[3]；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）发酵的黄瓜牛奶复合物其羟基自由基清除率达87%，DPPH自由基清除率达85.12%[4]。
红枣原产于中国并广泛栽培，其含有丰富的营养物质，具有极高的食用价值和药用价值，在传统中医理论中具有补气、养生、安神等功能[5]。近年来研究发现红枣中的多糖、多酚和三萜类化合物具有延缓衰老、提高人体免疫力等多种生理功效[6]，并含有多种对超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基清除效果优良的抗氧化性物质[7]。丰富的功能性使红枣开发与利用热度持续升高，其中发酵红枣制品逐渐受到广大消费者的青睐，但发酵过程中出现发酵能力较差、发酵后抗氧化性降低等问题使其品质及产量受到限制，有必要进一步开发能够稳定提升品质及抗氧化活性的发酵剂，乳酸菌发酵能够提高饮料的抗氧化活性、改善果汁风味、提高口感及品质，且具有多种益生功能[8]；另外，乳酸菌发酵能够产生抗坏血酸等新的抗氧化活性物质，同时提高羟基自由基和DPPH自由基的清除能力[9]。将红枣汁与乳酸菌结合发酵，以期能够稳定提升红枣发酵汁的品质及抗氧化活性。
因此，本研究拟从红枣表面和泡菜中分离出乳酸菌，从产酸、抗氧化活性、发酵能力3个方面筛选出能够提升发酵红枣汁抗氧化活性、改善其风味品质的乳酸菌，丰富发酵红枣汁专用菌种资源，解决缺少红枣汁发酵专用菌株及红枣加工产品单一的问题，为乳酸菌发酵红枣汁的生产提供理论支持。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
泡菜：河北、云南、四川地区的自然发酵泡菜；红枣：采自新疆和田地区、河北省沧州地区。
1.1.2 培养基
MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；接触酶试验培养基、明胶液化培养基、硝酸盐还原试验培养基、H2S产生试验培养基：国药集团化学试剂有限公司；糖发酵培养基：上海晶纯试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ZHPW-70台式振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；DHP-9162电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；Microfuge 20高速离心机：美国贝克曼库尔特公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；UV-1901紫外可见分光光度计：杭州艾普仪器设备有限公司；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；T100 Thermal Cycler聚合酶链式反应仪、Power pac2000电泳仪、Universal Hood II凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司；2，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）diammoniumsalt，ABTS]法总抗氧化能力检测试剂盒、铁离子还原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法总抗氧化能力检测试剂盒：碧云天生物技术研究所。
2 方法
2.1 乳酸菌的分离纯化
2.1.1 红枣样品中乳酸菌的分离纯化
按照参考文献[10-11]的方法略加修改，将红枣样品浸泡在无菌生理盐水中，37℃、170 r/min条件下培养30 min，经梯度稀释后每个梯度取200 μL菌液浇注于CaCO3-MRS琼脂培养基（含1.5%碳酸钙的MRS培养基）中，37℃下倒置培养48 h。挑取溶钙圈直径较大、菌落圆形突起且边缘光滑的单菌落转接到MRS平板上划线，纯化培养3次，将单菌落转接至MRS肉汤培养基中，37℃培养24 h后，保种及备用。
2.1.2 泡菜样品中乳酸菌的分离纯化
按照参考文献[10]中的方法对泡菜中乳酸菌进行分离。
2.2 高产酸菌株筛选
按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[12]中的方法，测定菌株产酸能力。
2.3 生理生化试验
将分离纯化的菌株进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验，筛选出革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株进行硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验和糖发酵试验，试验结果对照《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）[13]、《乳酸菌细菌的分类鉴定及实验方法》[14]进行的综合判定。
2.4 基因序列检测及其系统发育树的构建
按照DNA提取试剂盒说明方法提取的菌株DNA为模板，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）体系（25 μL）：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）混合物 12.5μL，DNA 模板 1 μL，正向引物（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'）、反向引物（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）各 1 μL，无酶水 9.5 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94℃变性 30 s，42℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，30个循环；72℃终延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序，经同源序列比对分析，采用MEGA5.0软件构建系统发育树[15]。
2.5 抗氧化活性测定
2.5.1 DPPH自由基清除能力的测定按照参考文献[16]中方法测定DPPH自由基清除率。
2.5.2 羟基自由基清除能力的测定按照参考文献[17]中方法测定羟基自由基清除率。
2.5.3 ABTS+自由基清除率测定ABTS+自由基清除率按照试剂盒操作要求测定。
2.5.4 FRAP法测定总抗氧化能力FRAP值按照试剂盒操作要求测定。
2.6 优良菌株发酵能力的测定
将高产酸、高抗氧化活性的乳酸菌活化后，5 000 r/min离心2 min，无菌生理盐水清洗菌体，以5%的接种量、菌体浓度为1×108cfu/mL接种于经过去核、破碎、以 1∶6（g/mL）料液比打浆处理的红枣汁中[18]，37 ℃发酵72 h后以酸碱滴定法[19]测定酸度并进行感官评价[20]，每组试验3个平行，选择综合效果最优的作为红枣汁发酵菌株。
2.7 感官评定
由10名专业人员组成评定小组从色泽、香气、口感、组织状态4个方面对红枣汁的感官质量进行评价，每项满分为9分，评分标准见表1。
表1 感官评定评分标准
Table 1 Criteria for sensory assessment
指标 评分标准 评分色泽 色泽均匀 7～9色泽不均匀 4～6色泽异常 1～3香气 有红枣及乳酸的香气，气味协调 7～9稍有香气，气味协调 4～6没有香味，气味不协调 1～3口感 酸甜适中，口感细腻 7～9略甜或略酸，口感一般 4～6过酸或过甜，口感粗糙 1～3组织状态 组织细腻，均匀，无沉淀 7～9组织细腻，有分层，有沉淀 4～6组织不够细腻，分层严重，沉淀严重 1～3
3 结果与分析
3.1 高产酸菌株的分离筛选
从样品中分离出176株产酸细菌，挑选溶钙圈直径较大、菌落圆形突起、乳白色、湿润且表面光滑的10株菌株（泡菜分离菌株以ZC命名，红枣表面分离菌株以PC命名）进行产酸试验，产酸量见表2。
表2 高产酸菌株的筛选结果
Table 2 Screening results of high acid-producing strains
注：不同的小写字母代表每列数据之间差异显著（P＜0.05）。
产酸量/%泡菜分离菌株 ZC1 1.33±0.05ef ZC2 2.05±0.12c ZC3 1.36±0.10ef ZC4 2.45±0.08a ZC5 1.84±0.10d红枣表面分离菌株 PC8 1.23±0.13f PC9 2.25±0.09b PC11 2.15±0.12bc PC12 1.40±0.07ef PC14 1.46±0.12e菌株 编号
由表 2 可知，ZC2、ZC4、PC9、PC11 的产酸量显著高于其它菌株（P＜0.05），确定为高产酸菌株。
3.2 形态鉴定及生理生化试验结果
10株产酸菌株均为革兰氏阳性（G+）、无芽孢、过氧化氢酶阴性的短杆状菌株，生化试验表明，10株菌株满足乳酸菌无运动性、不产生气体、不液化明胶、不还原硝酸盐、不产生吲哚及H2S，可以发酵蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、核糖、纤维二糖、棉籽糖、海藻糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、七叶灵、苦杏仁苷和水杨苷的特性，初步鉴定这10株菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
3.3 基因序列检测及系统发育树的构建
乳酸菌的形态学鉴定只能初步判断表型特征相似，并不代表基因型亲缘关系相近，基因型特征需进一步鉴定。经同源性比对后系统发育树构建结果见图1。
图1 基于16S rDNA基因的10株菌株系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of 10 strains based on 16S rDNA gene
菌株 ZC1、ZC2、ZC4、ZC5、PC8、PC9 与 Lactobacillus plantarum KGP_PME_01-07的同源性分别为99.34%、99.62%、99.76%、99.89%、99.93%、99.73%，菌株 ZC3、PC11、PC12、PC14 与 Lactobacillus plantarum HBUAS52372 的同源性分别为99.36%、100%、99.57%、99.34%，因此将这10株菌株鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
3.4 抗氧化活性
DPPH自由基及羟基自由基清除率是评价抗氧化性能的重要指标，在一定程度上反映菌株的抗氧化能力[21]，乳酸菌不同菌株之间的抗氧化活性具有较大差异。图2为不同乳酸菌发酵红枣汁对DPPH自由基及羟基自由基的清除能力。
图2 不同菌株发酵红枣汁抗氧化能力的比较
Fig.2 Comparison of antioxidant activity in red date juice fermented by different strains
不同的小写字母代表数据之间差异显著（P<0.05）。
由图2可知，10株乳酸菌发酵红枣汁对DPPH自由基清除能力较强的菌株依次为ZC2＞PC9＞PC11＞PC14，其清除能力分别达到90.62%、87.82%、86.32%和74.91%；10株乳酸菌发酵红枣汁对羟基自由基清除能力不同，其中清除能力最强的菌株为PC9，其次是菌株PC11、ZC2和ZC4，清除率分别为 67.85%、63.78%、62.48%和59.48%。综合分析DPPH自由基及羟基自由基清除能力发现，菌株 ZC2、ZC4、PC9、PC11 发酵的红枣汁清除DPPH自由基和羟基自由基的能力均比较强。
3.5 优良菌株发酵能力测定
将高产酸、高抗氧化活性的4株优良菌株接种于红枣汁中，发酵结果见图3，感官评价结果见表3。
图3 不同菌株对发酵红枣汁酸度的影响
Fig.3 Effects of different strains on acidity of fermented red date juice
表3 不同菌株发酵的红枣汁感官评分结果
Table 3 Sensory scoring results of red date juice fermented by different strains
注：不同的小写字母代表每列数据之间的差异显著（P＜0.05）。
编号 色泽 香气 口感 组织状态 总分ZC2 7.94±0.38b 7.95±0.59a 7.62±0.38b 7.70±0.44ab 31.21±0.63bc ZC4 7.56±0.20b 7.28±0.64b 7.49±0.59b 7.56±0.78b 29.89±0.57c PC9 8.52±0.54a 8.15±0.60a 8.60±0.32a 8.17±0.56a 33.44±0.34a PC11 8.43±0.56a 7.85±0.38a 8.19±0.39b 8.19±0.44a 32.66±0.46ab
由图3可知，4株乳酸菌发酵过程中0～12 h发酵速率缓慢；12 h～60 h发酵速率提升较快，酸度上升明显；60 h～72 h整体酸度提高，但过高的酸度会不同程度上抑制发酵，发酵速率趋于平缓，酸度缓慢增高，其中菌株ZC4、PC9发酵的红枣汁酸度提升速率较快，相比于ZC2、PC11能更快增大发酵体系的酸度。
结合表3可知，红枣表面分离菌株整体感官评分优于泡菜分离菌株，其中菌株ZC4发酵的红枣汁过高的酸度影响红枣汁的口感及风味，菌株ZC2发酵后的红枣汁酸度过低，导致发酵香味与红枣香味不协调。菌株PC9发酵的红枣汁酸甜可口、组织细腻，具有红枣的香气，菌株PC11与PC9相比发酵不充分导致口感评分较差，且PC9发酵速率大于PC11。结合发酵红枣汁的产酸量与感官评分结果，PC9具有作为发酵红枣汁专用菌株的潜力。
3.6 发酵前后红枣汁抗氧化活性变化
将菌株PC9以5%接种量（菌体浓度为1×108cfu/mL）接入红枣汁中37℃发酵72 h，测定发酵红枣汁的抗氧化活性，结果见表4。
表4 发酵红枣汁的抗氧化活性
Table 4 Antioxidant activity of fermented red date juice
注：不同的小写字母代表每列数据之间差异显著（P＜0.05）。
样品DPPH自由基清除率/%羟基自由基清除率/%ABTS+自由基清除率/（mmol/L）FRAP/（mmol/L）发酵前 73.52±1.02b 68.73±0.73b 27.65±0.53b 19.67±0.83b发酵后 89.34±0.97a 79.17±0.68a 34.21±0.61a 23.48±0.49a
与未发酵的红枣汁相比，DPPH自由基、羟基自由基的清除率显著增加，其DPPH自由基清除率提升了21.52%，羟基自由基清除率提升了15.19%。发酵后红枣汁ABTS+自由基清除率提高了23.73%；FRAP提高了19.37%。
4 结论与讨论
本研究以新疆和田地区、河北省沧州地区的红枣以及河北、云南、四川地区的自然发酵泡菜为样品分离出对DPPH自由基及羟基自由基都有不同程度清除能力的10株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），并筛选出高产酸、高抗氧化活性的4株植物乳杆菌ZC2、ZC4、PC9、PC11应用于红枣汁的发酵，结合发酵红枣汁的酸度及感官评价结果发现红枣表面分离菌株PC9的发酵效果最佳。有研究表明，在番茄中分离的乳酸菌与同属外来菌株同时发酵番茄，番茄分离菌株发酵饮料有更高抗坏血酸、谷胱甘肽和总抗氧化活性[22]；菠萝中筛选出的乳酸菌应用于菠萝发酵后与同属外来菌株相比抗氧化活性最高，色泽保存及香气更好[22]，这表明红枣表面分离的菌株具有更高的抗氧化活性，且与未发酵红枣汁相比，发酵红枣汁DPPH自由基和羟基自由基清除能力分别提高了21.52%、15.19%，ABTS+自由基清除率和FRAP分别增加了23.73%、19.37%，并能显著提高红枣汁风味口感。因此红枣表面分离菌株具有作为发酵红枣汁专用菌株的潜在优势，一方面可以显著提高食品DPPH自由基、羟基自由基清除率，另一方面还可以提升发酵食品风味及营养，为红枣表面分离乳酸菌的研究提供了一定的理论依据，可作为新的研究方向进一步开发。
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