鼠曲草（Gnaphalium affine）是菊科拟鼠麴草属草本植物，别名拟鼠麹草、鼠麹草、清明菜、田艾等，是民间喜爱的时令野生蔬菜。鼠曲草全草富含黄酮、氨基酸、挥发油及矿物质等多种功能性成分，营养价值高[1-5]。此外，鼠曲草全草可入药，现代药理学研究发现鼠曲草具有显著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抑制酶活性、镇咳和祛痰等作用[6-10]，可用于治疗急性支气管炎、慢性支气管炎、支气管哮喘、风湿性关节炎等疾病，有很高的药用价值。
黄酮类化合物是野菜鼠曲草中的重要生物活性成分，Morimoto等[11]发现鼠曲草中的甲氧基黄酮具有明显的昆虫拒食活性，可以保护鼠曲草免受昆虫的噬咬。田彩云[12]采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）方法建立了同时测定鼠曲草中6种黄酮类成分含量的方法。高俊斌等[13]和卢晓艺等[14]通过HPLC法发现鼠曲草因产地不同及叶茎根等部位不同其黄酮类化合物含量存在较大差异。谢建祥等[15]、李胜华[16]和白丽明等[17]均采用多种色谱技术对鼠曲草的乙醇提取物进行纯化，从提取物中分别鉴定出多种黄酮成分，均发现有芹菜素和木犀草素的存在，说明不同纯化方法和纯化条件对成分鉴定的影响较大。Lin等[18]从鼠曲草中分离出了木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷，并证实其有较高的药用价值。
本课题组前期研究了鼠曲草黄酮的微波辅助提取条件，并对提取的鼠曲草黄酮与常见的抗氧化剂维生素C进行了体外抗氧化性能的比较研究[19]。本研究采用微波法辅助提取得到鼠曲草黄酮，利用大孔树脂进行了纯化，并通过高效液相色谱电喷雾离子化串联质谱（high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）结合标准品对比法，对鼠曲草黄酮成分进行了系统分析，为鼠曲草的进一步开发利用提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鼠曲草：安徽诚信药家有限公司，产地安徽省，烘箱干燥后粉碎，过40目筛备用。
AB-8大孔树脂：南开大学化工厂；木犀草苷、金丝桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、毛地黄黄酮、槲皮素标准品：上海顺勃有限公司；绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、奎宁酸标准品：成都德天生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）：德国Mallinckrodt Baker公司；甲酸（色谱纯）：美国Columbus Chemical Industries公司。
1.2 主要仪器
G6410A LC-MSD QQQ液相色谱-质谱/质谱联机：美国Agilent Technologies公司；MAS-Ⅰ型微波快速制样系统：上海新仪微波化学科技有限公司；U-3900 UV-Vis分光光度计：日本Hitachi High-Technologies公司；LGJ-10冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品液的制备
鼠曲草黄酮的提取按照文献[19]方法，以50%的乙醇为溶剂进行微波辅助提取。得到的提取液经石油醚萃取，减压浓缩，再经冷冻干燥得到鼠曲草黄酮粗提物粉末。取粗提物粉末0.25 g，用5 mL无水乙醇溶解，并用蒸馏水定容至250 mL，即得浓度为1.0 mg/mL上样液。上样液经过填充有AB-8大孔树脂的15 cm层析柱进行纯化，吸附解吸参数：吸附流速2倍柱体积/h；上样液pH4.0；以4倍柱体积的50%乙醇作为洗脱剂；解吸流速为2 BV/h。收集洗脱液，经减压浓缩及冷冻干燥制得纯化后的鼠曲草黄酮。取适量的纯化后鼠曲草黄酮粉末，用50%甲醇配制成0.05 mg/mL样品液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，供LC-ESI-MS/MS分析用。
1.3.2 标准品溶液的制备
准确称取标准品奎宁酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、金丝桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素和毛地黄黄酮各0.0100g，用50mL50%甲醇溶解后，得到浓度为200 μg/mL的标准品储备液。然后用50%的甲醇将储备液稀释成10 μg/mL的标准品溶液，将标准品溶液过0.22 μm的微孔滤膜，贮存于4℃备用。
1.3.3 LC-MS/MS分析
色谱条件：采用ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）硅胶色谱柱，柱温为30℃。流动相为甲醇-水体系（水相中含0.1%甲酸），采用梯度洗脱的方式：0～10min，甲醇由50%匀速升高至72%，然后保持该体积分数继续运行12 min，流动相流速为0.3 mL/min。鼠曲草黄酮样品溶液进样量为8 μL，黄酮标准品溶液进样量为5 μL。
质谱条件：电喷雾ESI负离子源，雾化气体为N2，喷雾电压3 842 V，雾化气流速10 L/min，雾化气压力35psi（1psi=6.895kPa），离子源温度350℃，碰撞气压力0.15 MPa，碰撞气体为高纯 N2，m/z扫描范围，100 amu～1 000 amu。
2 结果与分析
2.1 鼠曲草黄酮的定性分析
鼠曲草黄酮样品和黄酮标准品的LC-ESI-MS/MS总离子流图如图1所示。
图1 鼠曲草黄酮和标准品的总离子流图
Fig.1 Total ion chromatograms of flavonoids from Gnaphalium affine and standards
A.鼠曲草黄酮样品；B.标准品；1～11分别为奎宁酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、野黄芩苷、金丝桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷、毛地黄黄酮。
如图 1 所示，鼠曲草黄酮样品 1、2、3、4、6、7、8、9 和11号化合物与9种黄酮标准品的保留时间一致，可初步断定样品液中这9种成分与标准品是相同化合物。
对鼠曲草黄酮样品液和标准品溶液中每一个准分子离子[M-H]-进行二级质谱分析，以得到具有特征信息的碎片离子，根据待测物质一级质谱的准分子离子的质荷比（m/z）、保留时间及二级质谱的主要子离子的m/z与标准品相比较，结果见表1，并参考相关的文献[20-23]，对鼠曲草黄酮样品液中的11种物质进行质谱鉴定。
表1 样品和标准品中各化合物的保留时间和碎片离子
Table 1 The retention time and fragment ions of each compound in sample and standards
注：-表示无标准对照品。
峰号成分名称[M-H]-（m/z）保留时间/min子离子（m/z）样品 样品 标准品1奎宁酸 191 9.405 85.1，92.9 85.0，93.0 2绿原酸 353 9.423 191.0，85.1 191.1，85.2 3 3，5-二咖啡酰奎宁酸 515 11.677 191.1，353.2 191.1，353.2 4木犀草苷 447 13.363 284.8 285.1 5野黄芩苷 461 13.437 284.8 -6金丝桃苷 463 15.146 300.1，270.9 300.2，271.0 7 芹菜素-7-葡萄糖苷 431 15.294 268.1 268.1 8紫云英苷 447 15.842 284.3 284.1 9槲皮素 301 18.694 150.9，178.7 151.0，179.2 10 槲皮素-3-O-槐糖苷 625 18.520 301.1 -11 毛地黄黄酮 285 19.955 133.1，150.7 132.9，150.7标准品9.397 9.419 11.670 13.358-15.132 15.265 15.838 18.674-19.932
通过对比可以进一步确定 1、2、3、4、6、7、8、9、11号化合物分别为奎宁酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、金丝桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、毛地黄黄酮，其结构式见图2。
化合物5的二级质谱见图3。
图 2 化合物 1、2、3、4、6、7、8、9、11 的结构式
Fig.2 The structural formula of compound 1，2，3，4，6，7，8,9 and 11
图3 化合物5的二级质谱图
Fig.3 MS2spectrum of compound 5
由图3可见该化合物准分子离子m/z为461；子离子m/z为285，是野黄芩苷的特征峰。其准分子离子和子离子与文献中报道的野黄芩苷标准物质的质谱碎片相同[20-21]。减少的m/z为176的残基是由化合物5在裂解过程中脱去一分子的葡萄糖醛酸碎片产生的。结合文献[22]判断化合物5为野黄芩苷，其裂解过程见图4。
图4 野黄芩苷的裂解过程
Fig.4 The fragmentation process of scutellarin
化合物10的二级质谱信息见图5。
由图5可见该化合物准分子离子的m/z为625；子离子m/z为301，是槲皮素的特征离子。减少的质量数为324的残基是化合物11在裂解过程中脱去两分子的葡萄糖的结果。结合文献[23]，可推断该化合物为槲皮素-3-O-槐糖苷。其裂解过程见图6。
图5 化合物10的二级质谱图
Fig.5 MS2spectrum of compound 10
图6 槲皮素-3-O-槐糖苷的裂解过程
Fig.6 The fragmentation process of quercetin-3-O-sophorside
在鉴定出的11种化合物中，绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、野黄芩苷、金丝桃苷、槲皮素、毛地黄黄酮在相关文献中已有报道[8,12-16，22]。但奎宁酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-槐糖苷几种化合物是在鼠曲草中首次发现。
2.2 样品中化合物的定量分析
利用多重反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM），通过对鼠曲草提取液中化合物的特征碎片离子的监测来进行定量分析，以倍数稀释法将标准品溶液稀释成不同浓度，然后进行质谱测定。以标准品浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到每一种黄酮的标准曲线方程，分别以信噪比S/N=3时各对照品的含量作为检出限。其中有标准品对照的9种化合物采用外标法进行定量，5号化合物和10号化合物分别以木犀草苷和毛地黄黄酮为内标物进行定量，结果见表2。
由表2可见，在一定的浓度范围内，9种标准品的线性关系良好，相关系数在0.997 4～0.999 8之间，检出限介于1.35 ng/mL～15.9 ng/mL，添加回收率范围在97.2%～102.5%，可见此方法具有较高的灵敏度、精密度和准确度。
表2 鼠曲草中化合物的含量
Table 2 Contents of components in Gnaphalium affine
注：-表示无相关数据；a表示内标法定量。
峰号成分名称标准曲线线性范围/（μg/mL）相关系数含量/（μg/mg）添加回收率/%检出1奎宁酸 y=1.177 2×106x+1 980 0.1～4.0 0.999 3 1.073 99.4 2绿原酸 y=5.783 5×105x+370.3 2.0～10.0 0.999 8 2.144 97.2 3 3,5-二咖啡酰奎宁酸 y=2.465 35×106x+1 514.3 0.2～6.0 0.999 8 4.957 98.9 4木犀草苷 y=6.31×106x+71 792 0.1～5.0 0.997 8 0.066 102.5 5野黄芩苷 - - - 0.056a -6金丝桃苷 y=4.67×106x+29 971 0.1～10.0 0.998 4 0.486 100.4限/（ng/mL）6.27 15.9 15.8 12.4-1.35 7 芹菜素-7-葡萄糖苷 y=3.423 4×106x+25 891 0.1～25.0 0.999 6 0.327 97.4 2.39 8紫云英苷 y=2.933×106x+12 869 1.0～10.0 0.997 4 0.777 98.5 3.48 9槲皮素 y=1.768 36×106x+738.5 0.1～5.0 0.999 6 0.072 97.6 8.63 10 槲皮素-3-O-槐糖苷 - - - 0.144a - -11 毛地黄黄酮 y=1.205 9×106x+4 418 1.0～12.0 0.999 2 0.884 101.2 4.36
3 结论
利用LC-ESI-MS/MS技术结合标准品对比法，对鼠曲草乙醇提取物进行了成分分析鉴定，结果显示鼠曲草中存在11种成分，分别为奎宁酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、野黄芩苷、金丝桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷和毛地黄黄酮。其中奎宁酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸含量最高，为酚酸类成分。其余为黄酮类成分，含量较高的为毛地黄黄酮、紫云英苷、金丝桃苷。奎宁酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-槐糖苷在该植物中为首次发现。
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