摘 要：以乙醇为提取剂，通过冷凝回流、盐酸酸化、乙酸乙酯萃取提取枸杞中酚酸成分，优化并建立宁夏枸杞中9种酚酸化合物的高效液相色谱检测方法。采用Ultimate
LP-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在流速1.0 mL/min、检测波长为280 nm、柱温30℃条件下对没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、丁香酸、阿魏酸进行分离，9种酚酸在46 min内完全分离。各组分的质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于0.993 0，方法的平均回收率在73.6%～99.8%，相对标准偏差小于8%。该方法可用于枸杞中酚酸化合物含量的测定，能够为枸杞质量控制提供一定技术支撑。
枸杞是我国传统的名贵中药材，被广泛用于医药、食疗、养生、保健等领域，其化学成分类型丰富，主要包括多糖类[1]、蛋白质氨基酸类[2]、黄酮类[3]、生物碱类[4]、类胡萝卜素[5]、甾醇类、萜类等多种类型化学成分，被国家卫生部规定为药食同源的品种[6]。随着人们的保健意识和食品安全意识增强，其生理作用和营养价值越来越被人们追捧。研究表明：枸杞有抑菌、抗突变、清除自由基、抗氧化、降血糖、降血脂、调节免疫、调节神经系统等作用[7]。枸杞之所以具有这些生理活性可能与其中的酚类成分有着一定关系。
枸杞多糖、黄酮等成分的研究已有大量报道[8-10]。近几年，研究者对枸杞功能营养成分总酚[11]、黑果枸杞汁中酚酸[12]、黑果枸杞花青素成分[13-14]展开了研究，比较了宁夏、新疆、青海、甘肃地区种植的枸杞总酚含量，研究枸杞总酚含量呈现的种植区域化[15]。张自萍等[16]、杨文等[17]采用高效液相色谱法测定了宁夏枸杞中绿原酸的含量。谭亮等[18]对青海产的不同品种枸杞中5种酚酸含量进行测定，同时比较了内蒙古、甘肃、新疆及宁夏产枸杞中酚酸含量。刘少静等[19]建立了同时测定黑果枸杞中绿原酸、咖啡酸、表儿茶素和阿魏酸含量的反相高效液相色谱法。杨春霞等[20]重点对宁夏4个产区种植的宁杞1号、5号、7号、9号中总酚含量进行分析，比较了各产区、每个品种间夏果枸杞与秋果枸杞中总酚含量的差异性。本试验选取与枸杞药理学作用有关的没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、阿魏酸为目标物，以30%～40%的乙醇作提取剂，通过冷凝回流、盐酸酸化、乙酸乙酯萃取提取枸杞中酚酸成分，建立了高效液相色谱法同时测定枸杞中9种酚酸化合物的方法，以期为枸杞的质量控制提供技术支撑和参考依据。
枸杞：中宁枸杞种植基地，采集成熟的宁杞1号、5号、7号和9号鲜果，样品用液氮冷冻研磨后保存待用。
乙腈（色谱纯）：Fisher Scientic公司；无水乙醇（优级纯）、磷酸溶液（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、丁香酸、阿魏酸（标准品，纯度≥98%）：北京世纪奥科生物技术有限公司；试验用水为超纯水（电导率小于 18.2 μs/cm）。
LC-20AD高效液相色谱仪（配SPD-20A紫外检测器）：日本岛津公司；U3900紫外分光光度计：日本日立公司；KQ5200DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LD5-2A型高速冷冻离心机：北京医用离心机厂；CHA-S恒温振荡器：常州国华电器有限公司；Milli-Q型超纯水机：美国密理博公司；
1.3.1 标准溶液的配制
准确称取没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、丁香酸、阿魏酸各5.0mg，用甲醇溶解，定容到10.00mL容量瓶中，浓度分别为0.5mg/mL。
用甲醇将对照品母液按不同倍数稀释，制备系列混合对照品溶液，9种酚酸的浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、5.0、10.0、20.0、30.0 mg/L。4 ℃条件下冷藏备用。
1.3.2 枸杞样品处理
称取一定量的枸杞粉末，加入30%～40%乙醇溶液，料液比 1∶10（g/mL），在 25 ℃条件下振荡 2 h，然后于水浴中回流2 h，回流后的液体过滤后进行减压蒸馏，蒸馏后用盐酸调节pH值为2.5～3.0，得到酸化液。酸化液中加入20 mL乙酸乙酯萃取，分离有机溶剂层，然后减压浓缩去除残留的乙酸乙酯，用无水乙醇复溶后过微孔滤膜，样液供上机测定。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：Ultimate
LP-C18型色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相：A相为0.1%磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱（0～5 min，B 相维持 5%不变；5 min～65 min，B相从5%线性改变至30%；65 min～66 min，B相从30%线性改变至5%，66 min～80 min，B相维持5%不变）；流速：1.0 mL/min；柱温：30.0℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。
2.1.1 检测波长的选择
在波长200 nm～400 nm对没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、阿魏酸、香豆酸、原儿茶醛对照品溶液进行紫外光谱扫描，各标准品的最强吸收峰出现在240 nm～320 nm，综合考虑，选取280 nm作为测定波长为宜。
2.1.2 流动相的优化选择
在酚酸的分离中，由于酚羟基和羧基在水溶液中容易发生电离，极性增强，在固定相表面形成双重保留，色谱峰拖尾严重，如果加入酸性调节剂，可使酚酸的电离受到抑制，以中性分子的形态存在，极性减弱，有利于增强在固定相上的保留，使分离效果和峰形得到改善。试验采用不同配比的乙腈-水、甲醇-水为流动相，流动相的pH值通过不同的酸来调节。试验结果表明：选用甲醇-0.1%甲酸水溶液和80%甲醇-0.1%甲酸水溶液作流动相，分析时间长，分离效果不理想。采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相，乙腈的体积分数由5%变化到30%的梯度条件下分离效果最佳，9种酚酸在46 min内可完全分离。
2.1.3 流速对分离度的影响
本研究设计了0.8、1.0、1.2mL/min3个流速，通过优化出峰时间、分析时间和分离度，发现3个流速均能满足9种酚酸同时分析，出峰效果均较好。考虑到样品中杂质会干扰目标峰的确定，试验最终确定流速为1.0 mL/min。
2.1.4 温度对分离度的影响
试验设定30、35、40℃3个柱温进行试验，通过优化出峰时间、分析时间和分离度，发现柱温30℃以上时分离度均能达到要求，试验最终选择30℃为分析温度。
2.1.5 酚酸的色谱保留行为
在最优的色谱分离条件下对没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、阿魏酸进行分离，结果见图1。
图1 9种酚酸化合物标准色谱分离图
Fig.1 The chromatogram of a mixture of nine phenolic acid standards
1.没食子酸；2.香豆酸；3.原儿茶醛；4.儿茶素；5.绿原酸；6.咖啡酸；7.丁香酸；8.表儿茶素；9.阿魏酸。
由图1可知，9种酚酸化合物在46 min内完全分离，出峰先后顺序依次为没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、阿魏酸，分离效果良好。
平行进样5次，对没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、阿魏酸标样进行重复性测定，考察保留时间、峰面积和峰高的相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）的重现性，结果见表1。
由表1可知，不同酚酸的保留时间的RSD均≤1.04%，峰面积的RSD均≤0.91%，峰高的RSD均≤2.71%，试验条件下9种酚酸标准对照品都具有良好的重现性和稳定性。
表1 酚酸标准样品保留时间、峰面积和峰高的相对标准偏差（n=5）
Table 1 RSD of retention time，peak area and peak height of phenolic acid standards（n=5）
酚酸种类 保留时间RSD/% 峰面积RSD/% 峰高RSD/%没食子酸 1.04 0.68 1.79香豆酸 0.97 0.63 2.71原儿茶醛 0.42 0.70 1.45儿茶素 0.41 0.76 2.19绿原酸 0.40 0.91 1.58咖啡酸 0.34 0.73 1.08丁香酸 0.34 0.61 0.95表儿茶素 0.34 0.73 1.10阿魏酸 0.33 0.72 0.91
配制酚酸的标准溶液在0.1 mg/L～30.0 mg/L，以质量浓度x（mg/L）为横坐标，以相应的响应峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，获得标准曲线方程，结果见表2。
由表2可知，各酚酸的峰面积与进样浓度呈良好的线性关系，相关系数在0.993 7～0.999 1之间，据此确定在试验范围内仪器响应信号与进样量呈良好的线性关系。以3倍信噪比计算方法的检出限（detection limit，LOD），没食子酸、香豆酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、阿魏酸的LOD值分别为 0.07、0.10、0.10、0.12、0.08、0.09、0.10、0.10、0.10，方法检出限低，能满足分析要求。
表2 9种酚酸线性回归方程及检出限
Table 2 Linear regression equations and detection limit of nine phenolic acids
酚酸种类线性范围/（mg/L）回归方程相关系数r检出限/（mg/L）没食子酸 0.10～30.0 y=9 405.5x+373.4 0.993 7 0.07香豆酸 0.10～30.0 y=5 516.4x+1 022.3 0.995 7 0.10原儿茶醛 0.10～30.0 y=40 118x-655.6 0.999 1 0.10儿茶素 0.20～30.0 y=2 263.9x+1 594.4 0.995 4 0.12绿原酸 0.10～30.0 y=5 435.8x+509.43 0.998 8 0.08咖啡酸 0.10～30.0 y=10 313x+1 596.2 0.998 7 0.09丁香酸 0.10～30.0 y=8 299.5x-2 368.6 0.998 7 0.10表儿茶素 0.10～30.0 y=2 530.2x-731.9 0.996 6 0.10阿魏酸 0.10～30.0 y=7 704.1x+4 119.7 0.997 8 0.10
对枸杞样进行添加回收试验，准确称取2.00 g样品，通过添加不同水平的酚酸标准储备液，使最终浓度分别为5.0、10.0、20.0 mg/L。分别计算样品的回收率，对方法的准确度和精密度进行验证，结果见表3。
表3 9种酚酸回收率和精密度（n=5）
Table 3 Recoveries of 9 phenolic acids and precision of the method（n=5）
酚酸 本底值/（mg/L）加标质量浓度/（mg/L）加标测定值/（mg/L）平均回收率/%RSD/%没食子酸 0.752 5.00 4.975 84.1 4.2 10.00 8.098 73.5 3.6 20.00 17.780 85.1 5.8香豆酸 0.000 5.00 4.440 88.8 4.7 10.00 8.003 80.3 3.8 20.00 16.982 84.9 6.1原儿茶醛 0.263 5.00 5.253 99.8 5.9 10.00 8.051 77.9 4.2 20.00 19.624 96.8 6.7儿茶素 0.000 5.00 4.051 81.0 5.5 10.00 7.599 75.7 7.8 20.00 15.138 75.7 5.0绿原酸 0.189 5.00 3.873 73.7 6.2 10.00 6.547 63.6 5.6 20.00 15.378 75.9 6.9咖啡酸 0.330 5.00 4.594 85.3 7.9 10.00 7.948 76.2 5.2 20.00 18.835 92.5 5.8丁香酸 0.141 5.00 4.111 79.4 4.6 10.00 7.730 77.9 5.5 20.00 15.853 78.6 6.3表儿茶素 0.284 5.00 4.002 74.4 4.8 10.00 8.226 79.4 3.6 20.00 17.237 84.8 6.1阿魏酸 3.473 5.00 6.999 70.5 4.3 10.00 11.200 77.3 3.3 20.00 19.793 81.6 2.8
从表3可以看出，没食子酸的平均回收率为73.5%～85.1%，相对标准偏差为3.6%～5.8%，香豆酸的平均回收率为80.3%～88.8%，相对标准偏差为3.8%～6.1%，原儿茶醛的平均回收率为77.9%～99.8%，相对标准偏差为4.2%～6.7%，儿茶素的平均回收率为75.7%～81.0%，相对标准偏差为5.0%～7.8%，绿原酸的平均回收率为63.6%～75.9%，相对标准偏差为5.6%～6.9%，咖啡酸的平均回收率为76.2%～92.5%，相对标准偏差为5.2%～7.9%，丁香酸的平均回收率为77.9%～79.4%，相对标准偏差为4.6%～6.3%，表儿茶素的平均回收率为74.4%～84.8%，相对标准偏差为3.6%～6.1%，阿魏酸的平均回收率为70.5%～81.6%，相对标准偏差为2.8%～4.3%。样品的回收率、精密度均能满足检测要求，表明方法的准确度高、精密度好，基本能满足枸杞中9种酚酸的检测要求。
依据建立的方法，对枸杞样品中酚酸组分及含量检测分析，结果见表4。
表4 枸杞中酚酸含量
Table 4 Content of phenolic acid contents in Lycium barbarum L．mg/kg
注：-为未检出。
?
由表4数据可知，宁杞1号、5号、7号、9号中没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸均被检出，以没食子酸和阿魏酸含量较高，其含量分别在 68.2 mg/kg～340.0 mg/kg、94.3 mg/kg～1 086.0 mg/kg，咖啡酸次之，含量在48.0 mg/kg～62.0 mg/kg，原儿茶醛、儿茶素和绿原酸的含量均很低，香豆酸、丁香酸和表儿茶素均未检出。枸杞样品及添加回收色谱图见图2。
图2 枸杞样品及添加回收色谱图
Fig.2 Sample and add recovery chromatography of the Lycium barbarum L．
1.没食子酸；2.香豆酸；3.原儿茶醛；4.儿茶素；5.绿原酸；6.咖啡酸；7.丁香酸；8.表儿茶素；9.阿魏酸。
建立了9种酚酸同时分析的高效液相色谱法。通过方法学验证，儿茶素测定的线性范围在0.2 mg/L～30.0 mg/L，其余8种酚酸测定的线性范围在0.1 mg/L～30.0 mg/L，相关系数大于0.990 0，各酚酸的平均回收率为63.6%～99.8%，RSD小于8%。方法准确度高、精密度好，能满足枸杞中9种酚酸同时分析的要求。
[1] 白寿宁,徐延梅,雍彤五,等.枸杞多糖提取与分离纯化技术探讨[J].食品工业,2000（3）：9-10.BAI Shouning,XU Yanmei,YONG Tongwu,et al.Extraction and purification of Lycium barbarum L.polysaccharides[J].The Food Industry,2000（3）：9-10.
[2]杨春霞.柱后衍生高效阳离子交换色谱法测定宁夏枸杞及枸杞花粉中氨基酸含量[J].食品科学,2011,32(18):239-242.YANG Chunxia.Simultaneous determination of amino acids in Chinese wolfberry fruit and pollen by high performance cation exchange chromatography with post-column derivatization[J].Food Science,2011,32(18):239-242.
[3]董静洲,王瑛.宁夏枸杞主要产区枸杞子总黄酮的测定与分析研究[J].食品研究与开发,2009,30(1):36-40.DONG Jingzhou,WANG Ying.Quantitation and identification of the flavonoids present in fruits of Lycium barbarum L.[J].Food Research and Development,2009,30(1):36-40.
[4] 黄元庆,鲁建华,沈泳,等.枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究[J].卫生研究,1999,28(2):115.HUANG Yuanqing,LU Jianhua,SHEN Yong,et al.The protective effects of total flavonoids from Lycium barbarum L.on lipid peroxidation of liver mitochondria and red blood cell in rats[J].Journal of Hygiene Research,1999,28(2):115.
[5] 李赫,陈敏,马文平,等.不同成熟期枸杞中类胡萝卜素含量的变化规律[J].中国农业科学,2006,39(3):599-605.LI He,CHEN Min,MA Wenping,et al.Law of changes of carotenoids contents in fructus lycii of Chinese wolfberry(Lycium barbarum L.)at different mature periods[J].Scientia Agricultura Sinica,2006,39(3):599-605.
[6] 白寿宁.宁夏枸杞研究[M].银川:宁夏人民出版社,1999:681.BAI Shouning.Studies on Lycium barbarum L.in Ningxia[M].Yinchuan:Ningxia People’s Publishing House,1999:681.
[7] 金治萃,贾彦彬,王陆一,等.中药枸杞子浸出液抑菌作用的实验研究[J].内蒙古医学杂志,1995,27(4):203-204.JIN Zhicui,JIA Yanbin,WANG Luyi,et al.The Experimental study of inhibitory effect on bacteria of Chinese[J].Neimenggu Nedical Journal,1995,27(4):203-204.
[8] NÄF R,VELLUZ A,THOMMEN W.Isolation of a glucosidic precursor of damascenone from Lycium halimifolium mil[J].Tetrahedron Letters,1990,31(45):6521-6522.
[9] POTTERAT O.Goji(Lycium barbarum and L.chinense):Phytochemistry,pharmacology and safety in the perspective of traditional uses and recent popularity[J].Planta Medica,2010,76(1):7-19.
[10]LE K,CHIU F,NG K.Identification and quantification of antioxidants in Fructus lycii[J].Food Chemistry,2007,105(1):353-363.
[11]王晓宇,陈鸿平,银玲,等.Folin-ciocalteu比色法测定枸杞子中总酚酸的含量[J].亚太传统医药,2012,8(1):45-47.WANG Xiaoyu,CHEN Hongping,YIN Ling,et al.Determination of total phenolic acid in the fruits of Lycium barabarum L.by folinciocalteu colorimetric method[J].Asia-Pacific Traditional Medicine,2012,8(1):45-47.
[12]陈晨,文怀秀,赵晓辉,等.固相萃取快速测定黑果枸杞果汁中酚酸类化合物[J].中国中药杂志,2011,36(7):896-898.CHEN Chen,WEN Huaixiu,ZHAO Xiaohui,et al.Fast determination of phenolic acids in Lycium ruthenicum Murr,juice by solid phase extraction and HPLC[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2011,36(7):896-898.
[13]陈晨,文怀秀,赵晓辉,等.黑果枸杞色素中原花青素含量测定[J].光谱实验室,2011,28(4):1767-1769.CHEN Chen,WEN Huaixiu,ZHAO Xiaohui,et al.Determination of oligomeric proantho cyanidinsin Lycium ruthenicum Murr. Pigment[J].Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory,2011,28(4):1767-1769.
[14]赵子丹,葛谦,牛艳,等.HPLC测定黑果枸杞中花青素的成分及含量[J].食品研究与开发,2017,38(12):123-129.ZHAO Zidan,GE Qian,NIU Yan,et al.Determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC[J].Food Research and Development,2017,38(12):123-129.
[15]王晓中,杨庆凤,徐飞,等.宁夏枸杞中总酚酸的含量测定[J].辽宁中医杂志,2012,39(10):2020-2021.WANG XiaoKzhong,YANG Qingfeng,XU Fei,et al.Determination of total phenolic acid in lycii fruatns[J].Liaoning Journal of Traditional Chinese Medicine,2012,39(10):2020-2021.
[16]张自萍,廖国玲,史晓文.高效液相色谱法测定不同产地宁夏枸杞中芦丁和绿原酸的含量[J].时珍国医国药,2007,18(7):1586-1587.ZHANG Ziping,LIAO Guoling,SHI Xiaowen.Determination of chlorogenic acid and rutin in Lycium barbarum L.from different habitats by HPLC[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2007,18(7):1586-1587.
[17]杨文,廖国玲．RP－HPLC法测定不同产地枸杞中绿原酸含量[J].中国现代药物应用,2008,2(1):51-53 YANG Wen,LIAO Guoling.Determination of chlorogenic acid and rutin in Lycium barbarum L.from different habitats by HPLC[J].Chinese Journal of Modern Drug Application,2008,2(1):51-53.
[18]谭亮,董琦,肖远灿,等.RP-HPLC法同时测定枸杞子中5个酚酸类成分的含量[J].药物分析杂志,2013,33(3):376-381,394.TAN Liang,DONG Qi,XIAO Yuancan,et al.Application of RPHPLC method for simultaneous determination of five phenolic acids components in lycii fructus[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis,2013,33(3):376-381,394.
[19]刘少静,刘萌,杨黎彬.RP-HPLC法同时测定枸杞中4种酚酸类成分的含量[J].应用化工,2016,45(6):1181-1183.LIU Shaojing,LIU Meng,YANG Libin.Application of RP-HPLC method for simultaneous determination of four phenolic acids components in Lycium barbarum[J].Applied Chemical Industry,2016,45(6):1181-1183.
[20]杨春霞,李彩虹,杨静,等.宁夏产区不同品种枸杞中总酚含量分析[J].食品研究与开发,2020,41(8):183-187.YANG Chunxia,LI Caihong,YANG Jing,et al.Analysis of polyphenols content in different varieties of Lycium barbarum L.in Ningxia producing area[J].Food Research and Development,2020,41(8):183-187.
Determination of Nine Kinds of Phenolic Acids in Lycium barbarum L.Using High-performance Liquid Chromatography
Abstract：Phenolic acid compounds are typically extracted by condensation reflux，hydrochloric acid acidification，and ethyl acetate extraction.The present study sought to establish and optimize a reversed phase high-performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of phenolic constituents of Lycium barbarum L.Chromatography was performed using an Ultimate
LP-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with gradient elution using a mobile phase composed of acetonitrile-0.1% phosphoric acid，flow rate of 1.0 mL/min，and column temperature of 30°C.The absorbance of the eluted fractions was measured at 280 nm.Nine kinds of phenolic acids—gallic acid，coumaric acid，original tea aldehyde，catechin，chlorogenic acid，coffee acid，benzoic acid，epicatechin，and ferulic acid—were completely separated within 46 min.A strong positive linear correlation was evident between the concentration and peak area.The correlation coefficient was greater than 0.993 0.The average recoveries ranged from 73.6% to 99.8%，with relative standard deviations being less than 8%.The described method could be applied to the quantitative and qualitative analyses of phenolic acids in Lycium barbarum L..
杨春霞.高效液相色谱法测定枸杞中9种酚酸化合物含量[J].食品研究与开发，2021，42（20）：148-153.
YANG Chunxia.Determination of Nine Kinds of Phenolic Acids in Lycium barbarum L.Using High-performance Liquid Chromatography[J].Food Research and Development，2021，42（20）：148-153.