槐米是夏季槐花未开放时采摘的花蕾，其有效成分是黄酮类化合物——芦丁（芸香苷）。黄酮类化合物是一大类广泛存在于植物中的化合物，具有保护心血管系统、抗菌及抗氧化等多种生物活性[1-3]。黄酮类化合物的主要提取方法有碱提酸沉法[4-5]、溶剂提取法[6-8]、水煎煮法[9]、微波辅助提取法[10-11]、超声辅助提取法[12]、双水相系统提取法[13]及超临界提取法[14]等。黄酮类化合物常用的有机溶剂提取法提取时间比较长。双水相系统提取法是利用高聚物-高聚物或高聚物-低分子盐形成双液体系，当两种物质浓度达到临界浓度时，该体系变为双水相体系，被分离物在两相中因具有分配差异而被提取。双水相系统提取法具有技术简单、分离速度快、易于纯化、宜于放大进行工业化生产等优点，是天然产物活性成分提取的一种理想技术[15-18]。本文以槐米为研究对象，以聚乙二醇1000（polyethylene glycol 1000，PEG 1000）与硫酸铵双水相系统为介质，超声辅助提取槐米中的总黄酮，利用可见分光光度法对槐米中的总黄酮含量进行测定，探究最佳的提取工艺，以期为黄酮类化合物的工业化开发的研究提供一定的方法参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
槐米：市售。将槐米放于恒温50℃的烘箱干燥2 h，粉碎过80目筛后装瓶备用。
聚乙二醇1000（化学纯）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠（以上均为分析纯）：郑州派尼化学试剂厂；芸香苷水合物标准品（优级纯）：上海阿拉丁试剂有限公司。
1.2 仪器设备
可见分光光度计（7230G）：上海菁华科技仪器有限公司；高速中药粉碎机（XFB-200）：吉首市中诚制药机械厂；超声波清洗器（KQ-300V型）：昆山市超声仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 双水相体系的选择
配制40%的PEG 1000和40%的硫酸铵溶液。取配制好的两种溶液，按照PEG 1000溶液和硫酸铵溶液体积比分别为 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合，总体积均为10mL，置于离心管中，摇匀，静置1h，观察分层情况并分别记录上下相体积之比。
1.3.2 总黄酮标准曲线的绘制
以芸香苷为标准品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[19]检测总黄酮含量。称取10mg芸香苷水合物，加水溶解后转移至100 mL容量瓶中定容，摇匀，得0.1 mg/mL的芸香苷水合物标准溶液。用移液管分别吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL 的芸香苷标准溶液于 50 mL的容量瓶中，加入蒸馏水约至25 mL，然后依次加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀静置6 min，加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀静置6 min，再加入4%的氢氧化钠溶液2 mL及60%的乙醇溶液10 mL，最后用蒸馏水定容，摇匀静置25 min。不加槐米的作为空白对照组。在510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
1.3.3 槐米中总黄酮的分离提取
称取槐米粉末 1 g，按料液比 1∶40（g/mL）溶解于40 mL双水相系统中，在30℃下超声30 min，抽滤，将滤液倒入离心管中，静置10 min，记录上下相的体积之比。分别取上下相各1 mL于50 mL容量瓶中，加入适量的蒸馏水稀释，按1.3.2的比色法测定吸光度，然后计算总黄酮的含量。
1.3.4 槐米中总黄酮萃取率和得率的测定和计算[20]
Y/%=RK/（1+RK）×100，R=V上/V下，K=A上/A下
式中：R为上下相的体积比，V上、V下分别为上、下相体积，mL；K为总黄酮在两相中的分配系数，A上、A下分别为上、下相吸光度，Y为萃取率。
式中：Y'为总黄酮得率，mg/g；C为总黄酮质量浓度，由标准曲线计算得到，mg/mL，V为待测液的体积，mL；D为稀释倍数；m为槐米粉末的质量，g。
1.3.5 单因素试验
固定其他条件，改变其中的一个条件，分别考察PEG 1000质量分数（20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%）、料液比 [1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]、浸提温度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）、硫酸铵质量分数（10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%）4个因素对总黄酮萃取率的影响。
1.3.6 正交试验
在单因素试验基础上，设计四因素三水平正交试验，确定槐米总黄酮提取的最优工艺。
2 结果与分析
2.1 双水相系统中PEG 1000溶液与硫酸铵溶液不同体积比时的分相结果
双水相系统中PEG 1000溶液与硫酸铵溶液不同体积比的分相结果见表1。
表1 双水相系统中PEG 1000与硫酸铵溶液不同体积比的分相结果
Table 1 Volume ratio of aqueous two-phase system mixed by polyethylene glycol 1000 solution and ammonium sulfate solution
注：/表示不分层。
初始体积比 1∶9 2∶8 3∶7 4∶6 5∶5 6∶4 7∶3 8∶2 9∶1静置后 V 上∶V 下 / 1.2∶8.8 2∶8 3∶7 4∶6 5∶5 6∶4 7.7∶2.3 /
从表1中可以看出，在PEG1000溶液和硫酸铵溶液体积比为6∶4时，双水相系统中上下相体积差最小，因此试验选用PEG1000溶液和硫酸铵溶液6∶4的体积比。
2.2 总黄酮标准曲线的绘制
以吸光度A对浓度C（mg/mL）作图，得到芸香苷水合物的标准曲线见图1。
图1 芸香苷水合物标准曲线
Fig.1 Absorbance-concentration standard curve of rutin hydrate
回归方程为y=14.19x-0.000 3，相关系数R为0.999 8，表明吸光度与浓度在0～0.05 mg/mL范围内有良好的线性关系。
2.3 单因素影响结果
2.3.1 PEG 1000质量分数对槐米总黄酮萃取的影响
PEG 1000质量分数对槐米总黄酮萃取率的影响见图2。
图2 PEG 1000质量分数对槐米总黄酮萃取率的影响
Fig.2 Effect of PEG 1000 mass fraction on the extraction rate of total flavonoids
由图2可以看出，当PEG 1000质量分数逐渐增加时，槐米总黄酮的萃取率先增加后降低。在PEG 1000质量分数为26%时，总黄酮的萃取率最大。因此，在正交试验时，选取PEG 1000质量分数分别为24%、26%和28%。
2.3.2 料液比对槐米总黄酮萃取的影响
料液比对槐米总黄酮萃取率的影响见图3。
图3 料液比对槐米总黄酮萃取率的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids
由图3可以看出，随着液体体积逐渐增加，槐米总黄酮的萃取率呈增加趋势，总黄酮的萃取率在料液比1∶60（g/mL）时最大，然后减小。结合试验，正交试验选择料液比分别为 1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。
2.3.3 浸提温度对槐米总黄酮萃取率的影响
浸提温度对槐米总黄酮萃取率的影响见图4。
图4 浸提温度对槐米总黄酮萃取率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids
由图4可知，当浸提温度不断升高时，槐米总黄酮的萃取率先增加后降低。在50℃时达最大值，之后随着浸提温度的升高逐渐减小。结合试验和经济成本因素，正交试验选取浸提温度为40、50、60℃。
2.3.4 硫酸铵质量分数对槐米总黄酮萃取率的影响
硫酸铵质量分数对槐米总黄酮萃取率的影响见图5。
图5 硫酸铵质量分数对槐米总黄酮萃取率的影响
Fig.5 Effect of ammonium sulfate mass fraction on the extraction rate of total flavonoids
由图5可知，在硫酸铵质量分数为10%时，总黄酮的萃取率最大，随着硫酸铵质量分数的增大，总黄酮的萃取率变小。结合试验，选取正交试验的硫酸铵质量分数分别为10%、12%和14%。
2.4 正交试验
根据单因素试验所得数据，选取PEG 1000质量分数、料液比、浸提温度、硫酸铵质量分数4个因素，通过正交试验研究了萃取最佳条件。因素水平见表2，正交试验结果分析及方差分析见表3、表4。
表2 正交试验因素水平
Table 2 Orthogonal experiment factors and levels of the flavonoids
水平D硫酸铵质量分数/%1 24 1∶50 40 10 2 26 1∶60 50 12 3 28 1∶70 60 14因素A PEG 1000质量分数/%B料液比/（g/mL）C浸提温度/℃
表3 正交试验结果分析
Table3 Orthogonal experiment results and analysis of the flavonoids
序号 A B C D Y/%1 1 1 1 1 95.77 2 1 2 2 2 93.75 3 1 3 3 3 79.74 4 2 1 2 3 85.04 5 2 2 3 1 90.23 6 2 3 1 2 94.78 7 3 1 3 2 88.89 8 3 2 1 3 89.57 9 3 3 2 1 95.06 K1 89.8 89.9 93.4 93.7 K2 90.0 91.2 91.3 92.5 K3 91.2 89.9 86.3 84.8 R 1.42 1.32 7.09 9.80
表4 正交试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of the orthogonal array design
因素 平方和 df 均方 F A 3.424 2 0.061 4.460 B 3.400 2 0.060 4.460 C 79.556 2 1.406 4.460 D 139.878 2 2.473 4.460误差 226.26 8
由表4可知，正交试验的各因素对提取率的影响均不显著。综合表3和表4可以得出影响总黄酮萃取率的主次顺序为D＞C＞A＞B，即硫酸铵质量分数对槐米总黄酮萃取率的影响最大，其次为浸提温度，PEG 1000质量分数对总黄酮萃取率的影响最小。从正交试验结果分析可得出提取总黄酮最优工艺条件为A3B2C1D1，即 PEG 1000 质量分数为 28%，料液比 1∶60（g/mL），浸提温度40℃，硫酸铵质量分数为10%。
2.5 验证性试验
在 PEG1000 质量分数为 28%，料液比 1∶60（g/mL），浸提温度40℃，硫酸铵质量分数10%，超声时间30 min的条件下，进行了3次平行试验，萃取3次，总黄酮的平均萃取率为95.91%，得率为20.53 mg/g，相对标准偏差为0.248 7%，结果重现性好。
3 结论
本研究采用单因素试验及正交试验得到了双水相系统萃取槐米总黄酮的最优工艺为PEG 1000质量分数 28%，料液比为 1∶60（g/mL），浸提温度 40 ℃，硫酸铵质量分数为10%。在该条件下，进行3次平行试验，总黄酮的萃取率为95.91%，得率为20.53 mg/g。结果重现性好，工艺稳定可行。该提取方法可为槐米总黄酮的工业化开发的研究提供一定的方法参考。
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