白鬼笔（Phallus impudicus）是鬼笔科、鬼笔属的一种药用真菌，其主要分布在我国山西、山东、贵州等地[1-2]。白鬼笔是亚洲和北欧的一种传统医药，含有多糖、不饱和脂肪酸等生物活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化和免疫刺激特性等效果[3-7]。目前，在文献中对于白鬼笔多糖的报道比较少，仅见其具有良好的烟草保润效果、免疫调节功能和促进伤口愈合的特性[8-9]，还未见对白鬼笔多糖的提取工艺研究及体外抗氧化和抗糖化活性研究。对于多糖的提取，目前常使用高温水浴提取、超声辅助提取、微波辅助提取、高压辅助提取和酶提取等技术，高温水浴提取多糖提取率低，辅助提取方法可以高效提取多糖并且能改善多糖的生物活性，是更优异的高效提取方法[10]。微波是一种非离子的电磁辐射，细胞壁在电磁波作用下容易发生裂解，使胞内物质更易被提取出来[11]。本试验采用微波辅助提取白鬼笔多糖，以抗氧化能力及抗糖化能力为指标研究其生物活性，旨在为白鬼笔深加工提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白鬼笔：贵州省都匀市，用清水洗去表面泥土后切片，在50℃烘箱中烘至恒重，粉碎，过60目筛后储存在干燥器中。
D-葡萄糖标准品、L-抗坏血酸（Vitamin C，VC）、氨基胍、人血清蛋白（human serum protein，HSA）：北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸、无水乙醇、铁氰化钾：天津市科密欧化学试剂有限公司；苯酚：天津市北辰方正试剂厂；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海阿拉丁生化科技股分有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器
BHS-6型数显恒温水浴锅：上海凌科实业发展有限公司；PT-3502C型全波长酶标仪：北京普天新桥技术有限公司；DP-CW-2000型微波萃取仪：北京亚欧德鹏科技有限公司；RE2002真空旋转蒸发器：上海越众仪器设备有限公司；PH-5型精密便携式酸度计：广州瑞彬科技有限公司；ZKT-50EB型真空干燥箱：南京百夫诺机械设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 白鬼笔多糖的提取
精确称取20 g白鬼笔，设计特定的提取条件提取白鬼笔多糖，离心取上清液，加入10%三氯乙酸溶液，并用浓盐酸调节上清液pH3.0左右，后于4℃冷藏过夜，10 000 r/min，离心5 min取上清液。上清液在50℃，0.1 MPa下旋转蒸发至1/10体积后，加入无水乙醇使上清液中乙醇含量为95%，4℃冷藏过夜，5 000 r/min离心10 min取沉淀，将沉淀用无水乙醚、丙酮洗涤去除脂类、色素等物质后，于0.1 MPa，45℃真空干燥至恒重，制得白鬼笔多糖。
1.3.2 白鬼笔多糖的提取率
采用苯酚-硫酸法测定白鬼笔多糖含量[12]，以D-葡萄糖为标准品作标准曲线，C/（mg/L）=（A-0.002 4）/4.12（R2=0.999，式中 A 为吸光值；C 为浓度，mg/L），按式（1）计算白鬼笔多糖的提取率。
1.3.3 单因素试验
1.3.3.1 微波温度对白鬼笔多糖提取率的影响
精确称取20 g白鬼笔，加入700 mL去离子水[料液比 1∶35（g/mL）]，分别在 40、50、60、70、80、90 ℃的温度下，300 W微波辅助提取10 min。
1.3.3.2 微波时间对白鬼笔多糖提取率的影响
精确称取20 g白鬼笔，加入700 mL去离子水[料液比 1∶35（g/mL）]，在 50 ℃下，300 W 微波辅助提取 5、10、15、20、25、30 min。
1.3.3.3 微波功率对白鬼笔多糖提取率的影响
精确称取20 g白鬼笔，加入700 mL去离子水[料液比 1∶35（g/mL）]，在 50 ℃下，分别在 0、100、200、300、400、500 W功率下微波辅助提取10 min。
1.3.3.4 料液比对白鬼笔多糖提取率的影响
精确称取 20g 白鬼笔，分别以料液比 1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）加入去离子水，在 50 ℃下，300 W微波辅助提取10 min。
1.3.4 响应面优化试验
依据单因素试验，采用Box-Behnken响应面法，将微波温度、微波时间和微波功率设为自变量，白鬼笔多糖提取率设为响应值，进行三因素三水平试验设计，每个因素和水平试验均重复3次。优化试验因素水平见表1。
表1 中心组合试验Box-Behnken方案设计的因素及水平编码
Table 1 Independent variables and levels used for central composite rotatable design
水平 因素A微波温度/℃ B微波时间/min C微波功率/W-1 60 5 200 0 70 10 300 1 80 15 400
1.3.5 白鬼笔多糖抗氧化能力测定
以铁还原力、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力模型来评价白鬼笔多糖抗氧化能力，分别参考文献[13-15]的方法进行测定，以同等质量浓度的VC溶液作为对照品。
1.3.6 白鬼笔多糖抗糖化能力测定
参考Gutierrez等[16]的方法来评价白鬼笔多糖抗糖化能力，以同等质量浓度的氨基胍溶液作为对照品，采用多功能酶标仪测定晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）含量。按照公式（2）计算AGEs抑制率。
式中：F0为阴性对照组的荧光值；F为样品组和对照组的荧光值。
1.4 数据分析
数据处理与分析均采用SPSS 22.0进行，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。响应面优化采用Design Expert 8.0软件进行处理分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 微波温度对白鬼笔多糖提取率的影响微波温度对多糖提取率的影响见图1。
图1 微波温度对多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of microwave temperature on extraction rate of polysaccharides
由图1可知，白鬼笔多糖提取率随着微波温度的升高呈现出先升高后降低的趋势。当微波温度70℃时，多糖提取率最大，可能是由于温度的升高使得溶液的黏度与表面张力降低，加速传质过程，使多糖更易溶出。但微波温度超70℃时，多糖提取率反而下降，可能是由于过高的微波温度造成了多糖的降解，因此导致白鬼笔多糖提取率降低[17-18]。因而响应面优化试验的微波温度选择60、70、80℃。
2.1.2 微波时间对白鬼笔多糖提取率的影响
微波时间对多糖提取率的影响见图2。
图2 微波时间对多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of microwave time on extraction rate of polysaccharides
由图2可知，随着微波时间的升高，白鬼笔多糖提取率呈先升高后降低的趋势。当微波时间达到10 min时，多糖提取率最大。微波辐射能有效地促进白鬼笔多糖溶解，5 min～10 min期间提取率增大，但微波时间越长（10 min以上），增加了白鬼笔多糖提取液的热量的积累，引发多糖降解从而导致提取率降低[19]。因而响应面优化试验的微波时间选择5、10、15 min。
2.1.3 微波功率对白鬼笔多糖提取率的影响
微波功率对多糖提取率的影响见图3。
图3 微波功率对多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of microwave power on extraction rate of polysaccharide
由图3可知，随着微波功率升高，白鬼笔多糖提取率先增大后减小，当微波功率达到300 W时，多糖提取率最大。当微波功率超过300 W时，多糖提取率开始下降，可能是由于高功率造成了多糖的降解[19]。因而响应面优化试验的微波功率选择200、300、400 W。
2.1.4 料液比对白鬼笔多糖提取率的影响
料液比对多糖提取率的影响见图4。
图4 料液比对多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides
由图4可知，白鬼笔多糖提取率随着溶剂体积的增大呈现出先增大后减小的趋势，当料液比为1∶30（g/mL）时，多糖提取率达到最大。当溶剂体积继续增大，多糖提取率呈下降趋势，可能是由于溶剂体积过高，造成白鬼笔基质中非多糖类杂质过多溶出，并且微波能量被溶剂大量地吸收，从而导致多糖提取率降低[20]。大量溶剂的使用也会造成后期溶剂回收或浓缩时所需的热量过高，从而导致成本增加，因此料液比最优水平为1∶30（g/mL），该因素后续不再进行响应面优化。
2.2 响应面优化试验结果
2.2.1 响应面优化设计试验结果及方差分析
Box-Behnken试验设计及试验结果见表2。
表2 Box-Behnken试验设计及试验结果
Table 2 Box-Behnken design and experiment results
试验编号 A微波温度 B微波时间 C微波功率 Y多糖提取率/%1 1 1 0 8.45 2 0 0 0 9.24 3-1 -1 8.18 4 1 0 1 7.69 0 5-1 8.60 6 0 0 0 9.15 0 1 7 -1 1 0 8.49 8 0 0 0 9.09-1 0 7.86 10 0 1 1 7.76 11 0 -1 1 7.99 12 -1 0 -1 8.71 13 -1 -1 0 8.84 14 0 0 0 9.17 15 -1 0 1 8.09 16 1 0 -1 8.14 17 0 0 0 9.07 9 1
利用Design Expert 8.0软件对表2中的试验数据进行回归拟合分析，得到多糖提取率对自变量的方程为：Y=9.14-0.25A+0.054B-0.26C+0.24AB+0.043AC-0.16BC-0.35A2-0.38B2-0.63C2。方差分析结果如表3所示。
表3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation
注：**表示差异极显著（P＜0.01）；*表示差异显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性模型 4.52 9 0.50 183.57 ＜0.000 1 **A微波温度 0.50 1 0.50 180.99 ＜0.000 1 **B微波时间 0.023 1 0.023 8.45 0.022 8 *C微波功率 0.55 1 0.55 201.55 ＜0.000 1 **AB 0.22 1 0.22 80.772＜0.000 1 **AC 0.007 1 0.007 2.64 0.148 1 BC 0.11 1 0.11 38.62 0.000 4 **A2 0.53 1 0.53 193.47 ＜0.000 1 **B2 0.61 1 0.61 221.72 ＜0.000 1 **C2 1.68 1 1.68 614.91 ＜0.000 1 **残差 0.019 7 0.003失拟项 0.0008 3 0.000 3 0.06 0.978 2误差项 0.018 4 0.005总和 4.54 16
该回归方程模型P＜0.000 1极显著，失拟项P=0.978 2＞0.05不显著，R2=0.994 2，CV=0.68%，表明白鬼笔多糖提取率回归方程模型十分可靠，实际值与理论值之间高度拟合。因此该回归方程可以用来分析和预测白鬼笔多糖提取工艺。在影响因素中，微波功率和微波温度对多糖提取率的影响极显著（P＜0.01），微波时间对多糖提取率的影响显著（P＜0.05），各因素对多糖提取率的影响力排序为微波功率＞微波温度＞微波时间。
2.2.2 各因素之间的交互作用
微波温度、微波功率、微波时间三者之间交互作用可依据响应曲面的陡度及等高线的形状来判定影响是否显著，结果如图5～图7所示。
图5 微波温度和微波时间对多糖提取率的等高线图和响应面图
Fig.5 Response surface and contour plot of the effect of microwave temperature and microwave time on extraction rate of polysaccharides
图6 微波时间和微波功率对多糖提取率的等高线图和响应面图
Fig.6 Response surface and contour plot of the effect of microwave power and microwave time on extraction rate of polysaccharides
图7 微波温度和微波功率对多糖提取率的等高线图和响应面图
Fig.7 Response surface and contour plot of the effect of microwave temperature and microwave power on extraction rate of polysaccharides
由图5～图7可知，微波温度和微波时间、微波时间和微波功率的等高线的形状为椭圆形且等高线曲面的陡度更高，此现象说明了微波温度和微波时间、微波时间和微波功率之间交互作用显著，与方差分析结果一致。
2.2.3 响应面模型验证
由回归拟合方程可以得到白鬼笔多糖最佳提取工艺参数为微波温度66.52℃，微波时间10.03 min，微波功率279.09 W，在此条件下白鬼笔多糖提取率为9.21%。为了验证工艺参数的可靠性，结合实际操作的方便性，将工艺参数调整为微波温度65℃，微波时间10 min，微波功率 280 W，并在固定料液比 1∶30（g/mL）的条件下进行3次平行试验，测得白鬼笔多糖提取率为9.03%，与该模型预测的理论值9.21%的相对误差小于2%，说明由此回归拟合方程得到最佳工艺参数具有高度的可靠性。
2.3 白鬼笔多糖抗氧化能力测定
由于铁还原力可以直接反映总抗氧化能力的大小，抗氧化活性物质可使得DPPH溶液和ABTS溶液发生褪色反应，因此采用这3种方法评价白鬼笔多糖抗氧化能力[21-23]。其抗氧化能力结果见表4。
表4 多糖及VC的抗氧化能力
Table 4 Comparison of antioxidation ability of polyasccharides and vitamin C
指标抗氧化能力/%IC50值/（g/L）VC VC 多糖铁还原力 92.85 0.133 0.489 DPPH自由基清除率 90.07 0.474 0.195 ABTS+自由基清除率 89.10 0.573 0.133多糖90.96 80.12 86.21
由表4可知，1 g/L白鬼笔多糖溶液的3种抗氧化能力虽然均不及同等质量浓度的VC，但白鬼笔多糖对ABTS+自由基清除率为86.21%，说明其具有较强的抗氧化能力。根据3种抗氧化能力指标的IC50值，可发现白鬼笔多糖具有较好的抗氧化能力。
2.4 白鬼笔多糖抗糖化能力测定
还原糖的羰基和自由氨基可生成AGEs，其会诱发糖尿病等疾病，具有较强生理毒性[24]。多糖和氨基胍的AGEs抑制率见图8。
图8 多糖和氨基胍的AGEs抑制率
Fig.8 Inhibition rate of AGEs of polysaccharides and aminoguanidine
由图8可知，相同浓度下白鬼笔多糖的抗糖化能力均高于氨基胍。白鬼笔多糖浓度达到0.2 g/L时，AGEs抑制率达到最大，为83.23%，表明白鬼笔多糖具有较强的抗糖化能力。AGEs抑制率与浓度在一定范围内呈线性相关。白鬼笔多糖在0.10 g/L～0.15 g/L范围内呈线性关系，方程为Y1=409.14X1+7.16（R2=0.937 9），由此方程可得IC50值为0.105 g/L；氨基胍在0.10 g/L～0.25 g/L呈线性关系，方程为Y2=256.92X2+9.896（R2=0.979 4），由此方程可得IC50值为0.156 g/L。由白鬼笔多糖及氨基胍的IC50值，可发现白鬼笔多糖具有较强的抗糖化能力，高于氨基胍。
3 结论
以白鬼笔为原料，去离子水作为溶媒，通过单因素试验考察了微波温度、微波时间、微波功率和料液比对白鬼笔多糖微波辅助提取工艺的影响，选择微波温度、微波时间和微波功率3个因素进行响应面试验优化，最终得到最佳的白鬼笔多糖微波辅助提取工艺条件：微波温度65℃，微波时间10 min，微波功率280 W，料液比 1∶30（g/mL），在此条件下白鬼笔多糖最高提取率为9.03%。采用了3种体外抗氧化模型和体外模拟人体环境生成的AGEs抑制率来评价白鬼笔多糖的抗氧化能力和抗糖化能力。结果表明白鬼笔多糖具有较强的抗氧化活性和抗糖化活性。本试验为白鬼笔多糖提取工艺及抗氧化活性和抗糖化活性研究奠定了基础，表明白鬼笔多糖是一种天然食源性抗氧化剂和抗糖化剂。
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