发酵香肠又称生香肠，是发酵肉制品的典型代表，是指以猪肉或牛肉为主要原料，绞碎后同盐、糖、发酵剂和香辛料等混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的具有稳定的微生物特性和典型的发酵香味的肉制品[1-3]。目前，国内外在发酵香肠的生产中常加入硝酸盐和亚硝酸盐作为发色剂[4]，使产品呈现诱人的玫瑰红色，抑制微生物繁殖，尤其对肉毒梭状芽孢杆菌抑制效果明显，从而延长储存期，并能赋予产品特殊风味[5]。但过量摄入亚硝酸盐使人体血液的载氧能力下降，从而导致机体组织缺氧。此外，亚硝酸盐可与食物或胃中的次级胺（仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸）结合形成亚硝胺从而诱发消化系统癌症[6-7]。我国对中式香肠和火腿肠中亚硝酸盐限量制定严格的标准，GB/T 23493—2009《中式香肠》中规定腊肠、风干肠亚硝酸盐含量不高于30mg/kg，GB/T20712—2006《火腿肠》中规定肉制品、火腿肠、灌肠类亚硝酸盐含量不高于30mg/kg。
亚硝酸盐在肉制品加工中具有独特作用，但到目前为止，研究人员仍在对能够完全替代亚硝酸盐的物质进行探讨。研究发现，采用发色剂（红曲色素、甜菜红、番茄红素、蛋黄粉、抗坏血酸、氨基酸等）和抑菌剂（乳酸菌、乳酸链球菌素、山梨酸钾等）部分替亚硝酸盐是降低肉制品中亚硝酸盐含量并能保证制品品质的有效途径[8-9]。
红曲，也称红曲米，是我国的传统发酵产品，是红曲霉接种在大米经发酵而成的产品，长期应用于食品着色防腐及药物加工。红曲霉能产生丰富的水解酶、酸、醇、酯类等一级代谢物质，可赋予发酵食品优良的香气与独特的味道。红曲霉的次级代谢产物——红曲色素，可用于代替亚硝酸盐添加于肉制品中。红曲色素是一种天然色素，具有对pH值稳定、受热稳定、理化性质稳定（不受金属离子、氧化剂、还原剂的影响）、有较强蛋白质着色能力以及具有一定的抑菌作用等特性[10-12]。已经有较多的研究单独使用红曲粉或者红曲色素应用于发酵肉制品中[13-17]，本试验综合利用红曲米及红曲色素替代部分亚硝酸钠进行发酵香肠的研制，并对关键发酵工艺参数条件进行优化，以期生产出适口性好、品质优良的发酵香肠，为进一步的工业化开发提供工艺参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪肉、食盐、葡萄糖、蔗糖、香辛料：市售；肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、汉逊德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）：上海嘉楚生物工程有限公司；红曲粉：古田县帝源红曲厂；亚硝酸钠（食品级）：四川金山制药有限公司；红曲色素、异抗坏血酸钠（食品级）：广东科隆生物科技有限公司。无水乙醚、NaOH、NaCl、无水葡萄糖（分析纯）：上海展云化工有限公司。月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose，LST）肉汤、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：广东环凯生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
紫外分光光度计（UV-3200S）：上海美普达仪器有限公司；测色色差仪（WSC-S）：上海精密科学仪器有限公司；电子天平（TE124S）：赛多利斯科学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-50S11）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A）：上海慧泰仪器制造有限公司；恒温培养箱（BKB11-II）：济南语驻医疗有限公司；料理机（JYLC022E）：九阳股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵香肠的制作
1.3.1.1 基本配方
参照巩洋等[18]的配方并进行了调整，猪瘦肉700 g，猪脂肪300 g，食盐20 g，葡萄糖5 g，蔗糖5 g，异抗坏血酸钠0.4 g，香辛料10 g，复合发酵剂（木葡萄球菌、清酒乳杆菌、汉逊德巴利酵母菌）107CFU/g，亚硝酸钠40mg，红曲粉 1.5 g，红曲色素 40 mg。
1.3.1.2 发酵香肠的生产工艺流程
原料肉修整→制馅→搅拌（加入辅料及发酵剂）→灌肠→发酵→干燥成熟（低温）→检验→包装
1.3.1.3 发酵香肠的操作要点
1）预处理：选料，一般选用新鲜、无污物、色泽鲜红的猪前腿肉。去皮除筋后用清水多次冲洗，直至表面没有血渍、污物。
2）制馅：用绞肉机将瘦肉打成肉糜，脂肪切成3cm左右的方丁，放入冰箱冷却至4℃以保证肉馅的制备效果。
3）搅拌：将冷却好的瘦肉和脂肪以7∶3（质量比）的比例在盆中搅拌混匀，加入香辛料、腌制剂、发酵剂等辅料再次进行搅拌，至混料均匀，肉温不能过高。
4）灌肠：用清水将肠衣表面食盐清洗干净，置于温水中浸泡，换水数次以保证肠衣内外食盐已彻底洗净，也可润滑肠衣内壁，有助于灌肠。将处理好的肠衣套在灌肠器漏斗上，在最前端用细绳系口，开始往肠衣中灌馅。灌肠要求肠体紧密饱满，避免产生气泡，如有气泡产生，要用牙签刺破肠衣将气体排出，避免影响发酵香肠的感官品质及货架期。
5）发酵：将灌装好的香肠挂置在温度22℃，相对湿度（relative humidity，RH）为85%～90%的恒温恒湿培养箱中发酵，至香肠的pH值降至4.5～5.5，发酵约60 h。如果发酵过程中，由于发酵条件不当，肠体表面受到微生物污染，可采用浓度10%以上的盐水清洗。
6）干燥成熟：将发酵完成的香肠挂在温度为13℃，相对湿度为90%，空气流速为0.1 m/s，湿度每日下降5%恒温恒湿培养箱干燥成熟2周。
1.3.2 试验指标的测定方法
1.3.2.1 亚硝酸盐残留量
亚硝酸盐残留量按照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的方法，采用盐酸萘乙二胺法进行测定，亚硝酸盐残留量的单位为mg/kg。
1.3.2.2 红度值
参考王中帅[19]的方法，用WSC-S型测色色差仪测定红度值，重复测定4次，取平均值。
1.3.2.3 pH值
pH值按照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》中的方法进行测定。
1.3.2.4 综合感官评价方法
将试验所得到的产品放在白色盘子中，随机编号，由20名受过感官品评训练的食品专业的学生组成感官评价小组，按照色泽、组织形态、质地、风味顺序，逐一对发酵香肠进行感官评定。参照GB/T 23493—2009《食品安全国家标准中式香肠》及上海市地方标准DB 31/2004—2012《食品安全地方标准发酵肉制品》中感官指标要求，结合发酵香肠自身特点，制定发酵香肠感官评价标准，见表1，满分20分，所得分数平均值作为感官评分。
表1 发酵香肠感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fermented sausage
分值色泽（5分） 香肠表面及瘦肉呈玫瑰红色，肥肉透明，切面有光泽 4.1～5.0香肠表面及瘦肉呈粉红色，肥肉稍偏黄色，切面有光泽 3.1～4.0香肠表面及瘦肉呈粉红色，肥肉呈黄色，切面稍有光泽 1.1～3.0香肠表面、瘦肉及肥肉均偏白，切面无光泽 0～1.0组织状态（5分） 肠衣紧贴肉馅，切面紧实整齐，肥瘦相间，结合紧密，香肠有弹性 4.1～5.0肠衣与肉馅贴合度较高，切面较完整，肥瘦交错，结合较紧密，香肠弹性较好 3.1～4.0肠衣与肉馅易于分离，切面不平整，肥瘦较不均，结合稍松散，香肠无弹性 1.1～3.0肠衣易分离，肠衣易撕裂，无法切片，肥瘦不均，结合不紧密，内部有软化现象 0～1.0质地（5分） 香肠肉馅紧实，表面和内部均干燥 4.1～5.0香肠肉馅较紧实，表面和内部较干燥 3.1～4.0香肠肉馅不紧实，表面较干，内部较湿 1.1～3.0肉馅松软，表面和内部均较湿 0～1.0风味（5分） 具有发酵香肠特有的气味，香味浓郁，口感良好 4.1～5.0香味不明显，但无脂肪或肉馅的酸败味，口感较好 3.1～4.0脂肪和肉馅有轻微的酸败味，口感较差 1.1～3.0无香味，脂肪和肉馅有明显酸败味，口感差 0～1.0指标 感官评价要求
1.3.3 试验设计
1.3.3.1 单因素试验
按照发酵香肠生产工艺的要求，分别对影响低亚硝酸盐型发酵香肠的感官品质起关键作用的亚硝酸钠的添加量、复合发酵剂的体积比、红曲色素的添加量、红曲粉添加量、发酵时间这5个因素进行研究，设计单因素试验，以发酵香肠的亚硝酸盐残留量、红度值、pH值和综合感官评分作为品质的评价标准，确定各个单因素对发酵香肠品质的影响。
固定亚硝酸钠添加量40 mg、红曲粉1.5 g、红曲色素 40 mg、复合发酵剂体积比 1∶1∶1（均为 107CFU/g，接种量为 0.01 mL/g），发酵时间设置 24、36、48、60、72 h 5个梯度，对发酵时间进行优化。
固定亚硝酸钠添加量40mg、红曲粉1.5g、红曲色素40 mg，发酵时间48 h，复合发酵剂中清酒乳杆菌、肉葡萄球菌、汉逊德巴利酵母菌的体积比为 5∶1∶1、5∶1∶2、5∶2∶1、6∶1∶1、4∶1∶1，在这 5 个梯度下对复合发酵剂的体积比进行优化。
固定红曲粉添加量1.5 g、红曲色素40 mg，复合发酵剂体积比为4∶1∶1，发酵时间48 h，设置亚硝酸钠添加量 10、20、30、40、50 mg 5 个梯度，对亚硝酸钠的添加量进行优化。
固定亚硝酸钠添加量30 mg，红曲色素40 mg，复合发酵剂体积比为4∶1∶1，发酵时间48 h，设置红曲粉添加量 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g 5 个梯度，对红曲粉的添加量进行优化。
固定亚硝酸钠添加量30 mg，红曲粉1.5 g，复合发酵剂体积比为4∶1∶1，发酵时间48 h，设置红曲色素添加量 20、30、40、50、60 mg 5 个梯度，对红曲色素添加量进行优化。
1.3.3.2 正交试验
在上述单因素试验的基础上设计正交试验，选取亚硝酸钠添加量、红曲粉添加量、红曲色素添加量和复合发酵剂体积比4个试验因素进行四因素三水平的正交试验，以感官品质为指标，确定低亚硝酸盐型发酵香肠的最佳配方。正交试验设计因素水平表见表2。
表2 低亚硝酸盐型发酵香肠配方正交设计因素水平设计
Table 2 The factors and levels of orthogonal design of fermented sausage with low-nitrite
水平D复合发酵剂体积比1 25 1.2 25 4∶0.5∶1 2 30 1.5 30 4∶1∶1 3 35 1.8 35 4∶1.5∶1因素A亚硝酸钠添加量/mg B红曲粉添加量/g C红曲色素添加量/mg
1.4 数据处理与分析
运用Excel 2019统计所有数据，数据分析采用SPSS 20软件。方差分析采用ANOVA分析，采用Duncan’s多重比较进行差异显著性分析。图表绘制采用Origin 9.0软件。正交试验设计及分析使用Minitab 16。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 发酵时间对香肠品质的影响
发酵时间对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响见图1。
图1 发酵时间对香肠pH值、红度、感官品质
及亚硝酸盐残留量的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage
由图1可知，发酵时间对产品的色泽、pH值、感官评分及亚硝酸盐残留量均有较大影响。加入发酵剂后，产品的pH值开始明显下降，至发酵48 h时，降至最低值，为5.14，此时香肠口感较酸，适口性较差；随后又缓慢上升。pH值在发酵前期的下降是由于发酵剂的生长繁殖产酸所致，后期的回升可能与蛋白质酶水解所产生的碱性物质（如碱性的游离氨基酸、肽、和胺类）的积累有关[20-21]。当发酵至36 h时，产品的亚硝酸盐残留量最低，为（0.034±0.002）mg/kg，随后呈现波动上升的趋势。当发酵时间为60 h时，产品的感官品质评分最高，发酵香肠呈玫瑰红色，质地紧致，肥肉切片透明均匀，香味浓郁，口感良好，亚硝酸盐残留量都较理想。继续发酵至72 h时，香肠风味变化，感官评分减低，且亚硝酸残留量增高。故发酵时间以60 h为宜。
2.1.2 复合发酵剂体积比对产品品质的影响
相对于自然发酵，添加适宜的发酵剂可以显著缩短发酵周期，控制发酵过程，提高发酵的安全性，降低致病和腐败细菌的风险，保持稳定性和保质期，提高产品的营养及感官品质，也是实现规模化生产的保障[22-23]。发酵肉制品中常用的发酵剂包括乳酸菌、酵母菌、微球菌、葡萄球菌属、霉菌等[24]。在香肠发酵过程中，乳酸菌起主导作用。乳酸菌可以发酵碳水化合物产生乳酸、乙酸等，降低产品的pH值，同时促进蛋白质的凝胶化进程，加快香肠的干燥速度，促进产品发色，降低生物胺含量等。葡萄球菌和微球菌被称为是发酵香肠生产中的“呈香菌”，同时也提高色泽稳定性，对发酵香肠良好风味和感官品质的形成具有重要的作用[25-27]。酵母可以消耗肠内氧气，减少脂质氧化，降低氧化还原电势，从而抑制肉制品因氧化而产生的变色，并稳定定殖在香肠表面，成膜分布，防止产品过度脱水；同时酵母水解脂肪和蛋白质产生酯类、酮类、醇类等物质，有利于发酵肉制品风味形成。通常采用混合发酵剂的产品风味更佳。
前期菌种筛选试验发现，清酒乳杆菌、肉葡萄球菌、汉逊德巴利酵母菌3种菌种能显著提高发酵香肠的风味。进一步通过发酵剂的复配，改善发酵工艺，复合发酵剂体积比对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响见图2。
由图2可知，3种发酵剂的体积比对产品pH值、亚硝酸盐残留量及感官品质均有较大的影响。当3种发酵剂的体积比为5∶2∶1时，肉葡萄球菌的添加量较高，产品有微弱的不良气味，可能与肉葡萄球菌量过高引起的脂类氧化及氨基酸代谢旺盛，致使不良气味的小分子物质（如戊醛、庚醛等）浓度较高引起的[28]，此时样品的pH值和亚硝酸盐残留量均较高。当3种发酵剂的体积比为4∶1∶1时，产品中的亚硝酸盐含量最低，肉质pH值为5.08，较为理想，且肉质均匀，感官评分最高，因此，选择混合发酵剂的体积比为4∶1∶1。
图2 复合发酵剂体积比对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响
Fig.2 Effect of compound starter volume ratio on the pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage
2.1.3 亚硝酸钠添加量对产品品质的影响
亚硝酸盐在发酵香肠中具有改善肉品色泽、抑菌防腐、丰富产品风味、抑制脂肪氧化等作用[29]。亚硝酸盐带来的危害也备受消费者关注。但迄今为止还未能找到一种物质在腌肉制品中完全替代亚硝酸盐[4]。因此，减少肉制品中亚硝盐的添加量是降低安全风险的重要措施。亚硝酸钠添加量对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响见图3。
图3 亚硝酸钠添加量对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响
Fig.3 Effects of sodium nitrite addition on pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage
从图3中可以看出，随着亚硝酸钠的增加，香肠产品中亚硝酸盐残留量逐渐上升，在添加量为50 mg时亚硝酸盐残留量达到最大，为0.039 mg/kg，远远低于我国发酵肉制品中＜30 mg/kg的标准。当添加量为10 mg和20 mg时，香肠表面及瘦肉呈粉红色，肥肉偏黄，发酵风味欠佳。当添加量为30 mg时，在红曲色素及红曲粉的协同增色作用下，香肠表面及瘦肉呈玫瑰红色，产品感官评分最好，产品质地及风味均较佳，故选定亚硝酸钠最适添加量为30 mg。
2.1.4 红曲粉添加量对产品品质的影响
红曲粉中包含了红曲霉以及菌种的菌体外水解酶、酸、醇、酯类等一级代谢物质，可赋予发酵食品优良的香气与甘甜的味道，其次级代谢产物红曲色素，可用于代替部分亚硝酸盐添加于肉制品中，赋予肉制品诱人的色泽[20]。适量添加红曲粉能有效改善并稳定发酵香肠的色泽，延长保质期，且不干扰香肠的风味和质地[30-31]。试验通过添加红曲粉，改善减少亚硝酸钠用量带来的色泽和风味的不足，红曲粉添加量对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响见图4。
图4 红曲粉添加量对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响
Fig.4 Effects of red kojic rice addition on pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage
从图4中可以看出，红曲粉添加量在0.5 g～2.5 g时对产品pH值的影响不大。亚硝酸盐残留量呈现先降低并趋于平稳状态，表明红曲霉参与亚硝酸钠的降解和转化。继续增大红曲粉添加量时，产品红度继续增加，至2.5 g时，香肠呈现令人不愉悦的暗红色甚至红黑色，同时香肠也带有酒糟味等异味。因此，红曲粉的适宜添加量为1.5 g。
2.1.5 红曲色素添加量对产品品质的影响
大量研究证实，将红曲色素用于发酵香肠中替代部分亚硝酸盐是可行的[32-34]，且不会影响产品的风味及品质。红曲色素添加量对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残留量的影响见图5。
从图5中可以看出，红曲色素对发酵剂产酸有较大的影响，随着添加量的增加，产品的pH值逐渐增高，当红曲色素添加量＞40 mg时，产品的pH值＞5.66，这对于抑制腐败菌和致病菌的生长，保证产品的安全性是非常不利的。随着红曲色素添加量的增加，产品颜色逐渐变成深紫色至紫黑色，影响制品的感官品质。当添加量为20 mg时，制品着色均匀品质较佳，因此，选择红曲色素的添加量为20 mg。
图5 红曲色素添加量对香肠pH值、红度、感官品质及亚硝酸盐残
留量的影响
Fig.5 Effects of red kojic pigment addition on pH value，redness，
sensory quality and nitrite residue of sausage
2.2 正交试验结果与分析
正交试验结果见表3。
表3 正交试验结果
Table 3 The orthogonal experiment results
感官评分1 1 1 1 1 17.8 2 1 2 2 2 18.1 3 1 3 3 3 18.3 4 2 1 2 3 18.8 5 2 2 3 1 19.4 6 2 3 1 2 18.2 7 3 1 3 2 17.5 8 3 2 1 3 17.2 9 3 3 2 1 18.1 k1 18.067 18.033 17.733 18.433 k2 18.800 18.233 18.333 17.933 k3 17.600 18.200 18.400 18.100极差R 1.200 0.200 0.667 0.500因素主次 A＞C＞D＞B优组合 A2B2C3D1序号 A亚硝酸钠添加量B红曲粉添加量C红曲色素添加量D复合发酵剂体积比
极差的大小可以反映各因素的影响程度，从表3可以看出，各因素对发酵香肠感官品质影响的大小顺序为A＞C＞D＞B，即亚硝酸钠添加量＞红曲色素添加量＞复合发酵剂体积比＞红曲粉添加量。根据产品感官评分的极差分析结果确定低亚硝酸盐发酵香肠的最佳配方为亚硝酸钠的添加量30 mg，红曲色素添加量35 mg，复合发酵剂体积比（清酒乳杆菌∶肉葡萄球菌∶汉逊德巴利酵母菌）4∶0.5∶1，红曲粉的添加量 1.5 g。
对感官评分的方差分析如表4所示。
表4 方差分析结果
Table 4 Analysis of variance
注：P＜0.01表示差异极显著。
变异来源 df SS MS F P A 2 6.586 7 3.293 3 329.33 0.000 B 2 0.206 7 0.103 3 10.33 0.001 C 2 2.426 7 1.213 3 121.33 0.000 D 2 1.166 7 0.583 3 58.33 0.000误差 18 0.180 0 0.010 0合计 26 10.566 7
从表4中可以看出，A（亚硝酸钠添加量），B（红曲粉添加量），C（红曲色素添加量），D（复合发酵剂体积比）均对低亚硝酸盐发酵香肠的感官品质有极显著的影响（P＜0.01），影响的主次顺序为 A＞C＞D＞B，进一步验证了极差分析的结果。
在优化的工艺条件下，重新制备3批低亚硝酸盐发酵香肠。对3批香肠产品进行感官品评，所得的香肠产品表面及瘦肉呈鲜艳均匀的玫瑰红色，肥肉切片呈现透明状；肠衣干燥且紧贴肉馅，无霉，坚实有弹性，具有发酵香肠特有的气味及香味，不同批次香肠品质的稳定性良好。香肠的亚硝酸盐含量为（0.026±0.003）mg/kg，远低于30mg/kg的标准，香肠的pH值为5.09±0.07。使用红曲霉及红曲色素是有效的替代亚硝酸盐的方法。将香肠置于室温条件下（25℃左右）贮藏30 d后，检测微生物指标，菌落总数为5CFU/g，其中大肠杆菌及致病性细菌（沙门氏菌、志贺氏菌及金黄色葡萄球菌）均未检出，表明发酵香肠符合微生物安全性标准。
3 结论
本试验使用红曲粉及红曲霉色素部分替换亚硝酸盐的添加，研究低亚硝酸盐发酵香肠的制备工艺。在单因素试验的基础上，通过正交试验优化关键因素的参数，最终确定的工艺配方为猪瘦肉700 g、猪脂肪300 g、食盐 20 g、葡萄糖 5 g、蔗糖 5 g、异抗坏血酸钠0.4g、香辛料10g、亚硝酸钠30mg、红曲粉1.5g、红曲色素35 mg，接种复合发酵剂（肉葡萄球菌∶清酒乳杆菌∶汉逊德巴利酵母菌）的体积比为4∶0.5∶1，通过48 h发酵（温度22℃，相对湿度为85%～90%），干燥成熟2周后可以得到成品。此工艺条件下的低亚硝酸盐的香肠pH值为5.09±0.07，感官评分最高，颜色诱人均匀，香气浓郁，品质稳定，亚硝酸盐残留量远低于国家标准要求，可为今后工业化应用提供一定的参考。
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