美拉德反应（Maillard reaction）是羰基与氨基缩合生成类黑色素的反应[1]，美拉德反应能够给食物带来诱人的色泽、浓郁的芳香和醇厚的滋味，受到食品行业的广泛关注，常用于食品加工、酒业酿造、中药炮制、烟草研制以及饲料制备等过程[2-3]。美拉德反应通过醛、酮及还原糖的羰基与氨基酸、肽、蛋白质等含氮化合物的游离氨基发生反应[4]，可以改善食品的色、香、味、质，在食品加工特别是调味料的资源开发中有着十分重要的意义。
美味牛肝菌（Boletus edulis）属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），蘑菇亚门（Agaricomycotina），蘑菇纲（Agaricomycetes），牛肝菌目（Boletales），牛肝菌科（Boletineae），牛肝菌属（Boletus）[5]。美味牛肝菌肉厚细软，味道鲜美，营养丰富，长期食用可以增强机体免疫能力，具有抗肿瘤、抗突变、降血脂、抗病毒等作用[6]。美味牛肝菌的蛋白水解物中富含肽类和氨基酸，是制备热反应香精的风味前体物质，利用复合酶解技术对美味牛肝菌蛋白质进行水解，添加外源氨基酸和还原糖进行美拉德反应，制备一款具有菌菇风味、且能提升食品整体鲜味和醇厚味的高档调味核心基料，有着广阔的市场发展前景。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
美味牛肝菌：云南易门县康源菌业有限公司；风味蛋白酶（2×104U/g）、纤维素酶（2×104U/g）、L-谷氨酸：河南万邦实业有限公司；氢氧化钠：成都金山化学试剂有限公司；盐酸：昆明汕滇药业有限公司；以上试剂均为分析纯。
UV-VIS 300紫外可见分光光度计：美国Thermo Fisher公司；BAS224S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH-2数显电子恒温水浴锅：金坛市丹瑞电器厂；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；YB-250A多功能粉碎机：永康市速锋工贸有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 美味牛肝菌酶解液的制备
将美味牛肝菌于60℃恒温干燥箱中干燥24 h后粉碎，过60目筛，采用纤维素酶和风味蛋白酶的复合酶（1∶1，质量比），在初始 pH6、料液比 1∶36（g/mL）、温度50℃下酶解5 h。酶解结束后迅速在90℃下灭酶，离心分离得上清液备用[7]。
1.2.2 风味前体物质氨基酸与还原糖的选择
根据前期研究结果[8]，选择葡萄糖和L-谷氨酸为底物进行美拉德反应。
1.2.3 美拉德反应产物褐变指数A420nm测定
根据蒋迪等[9]的方法进行测定，以10 mL美味牛肝菌酶解液为基准，进行美拉德反应后溶液稀释5倍在波长420 nm处测定吸光度，以未进行美拉德反应的酶解液作为对照。褐变指数A420nm越大，表明经美拉德反应后的褐色产物越多。
1.2.4 单因素试验
固定反应温度90℃，葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.4%，初始pH4，考察不同反应时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响；固定反应时间2.0 h，葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.4%，初始pH4，考察不同反应温度（80、85、90、95、100℃）对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响；固定反应时间2.0 h，反应温度90℃，L-谷氨酸添加量0.4%，初始pH4，考察不同葡萄糖添加量（1%、2%、3%、4%、5%）对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响；固定反应时间2.0 h，反应温度90℃，葡萄糖添加量3%，初始pH4，考察不同L-谷氨酸添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）对美拉德反应产物 A420nm及感官评分的影响；固定反应时间2.0 h，反应温度90℃，葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.4%，考察不同初始 pH 值（2、3、4、5、6）对美拉德反应产物 A420 nm及感官评分的影响。
1.2.5 正交试验
在单因素试验结果的基础上，以反应时间、反应温度、葡萄糖添加量、L-谷氨酸添加量及初始pH值为自变量，以美拉德反应产物的褐变指数A420nm及感官评分为因变量Y，设计五因素四水平的L16（45）正交试验，优化美味牛肝菌酶解液美拉德反应的最佳工艺参数，正交试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments
水平E初始pH值1 1.5 85 2 0.2 2 2 2.0 90 3 0.3 3 3 2.5 95 4 0.4 4 4 3.0 100 5 0.5 5因素A反应时间/h B反应温度/℃C葡萄糖添加量/%D L-谷氨酸添加量/%
1.2.6 感官评价
邀请经过系统理论教学和专业实践的业内人员10人（男士5人，女士5人）对美味牛肝菌酶解液美拉德反应的产物进行感官评价，评分标准见表2。根据表2的感官评分标准，按照色泽、香气及滋味分别对美拉德反应产物进行评价，满分10分，最终评分取其平均值。
表2 感官评分标准
Table 2 Standards of sensory evaluation
项目 品质得分 权重好一般 差色泽 色泽均匀，呈棕黄色 1.6～2.0 1.1～1.5 0～1.0 0.2香气 海鲜味浓郁，有美味牛肝菌特殊风味，香气协调 3.1～4.0 2.1～3.0 0～2.0 0.4滋味 兼具鲜味和甜味，口感协调 3.1～4.0 2.1～3.0 0～2.0 0.4
1.3 数据处理
单因素及正交试验均做3次平行试验并取平均值。试验数据采用OriginPro 2017C软件作图，并用Excel 2010及IBM SPSS Statistics20软件对试验数据进行方差分析及显著性分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 反应时间对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响
反应时间对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响见图1。
图1 反应时间对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响
Fig.1 Effect of reaction time on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products
由图1可知，随着反应时间的延长，美拉德反应产物的感官评分呈现先升高后降低的趋势，感官评分在2.0 h时达到最高，为7.66。在2.0 h内，葡萄糖和L-谷氨酸发生美拉德反应，产生了一系列吡嗪类化合物及含硫化合物等，使反应液中的鲜味及烧烤味等风味增加[10]，感官评分逐渐增加。反应时间超过2.0 h后，长时间的高温反应会造成美拉德反应产物产生焦糊味[11]，造成感官评分的降低。同时，随着反应时间的延长，美拉德反应产物的A420nm也呈现先增大后减小的趋势，因此，选择反应时间1.0 h～2.5 h进行后续正交试验。
2.1.2 反应温度对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响
反应温度对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响见图2。
由图2可知，美拉德反应产物的感官评分随着反应温度的升高呈现先升高后降低的趋势，这是因为反应温度低于90℃时，美拉德反应可能不完全，产物色泽较浅、香气及滋味寡淡不协调，而反应温度超过90℃时美拉德反应过度，焦糊味严重。反应温度与A420nm呈正相关关系，温度越高，美拉德反应产生的类黑精色素越多，颜色越深。综合感官评分和A420 nm，选择反应温度85℃～100℃进行后续正交试验。
图2 反应温度对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响
Fig.2 Effect of reaction temperature on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products
2.1.3 葡萄糖添加量对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响
葡萄糖添加量对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响见图3。
图3 葡萄糖添加量对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响
Fig.3 Effect of glucose addition on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products
由图3可知，葡萄糖添加量对美拉德反应产物的感官评分的影响略小，葡萄糖添加量为3%时，美拉德反应后呈现出的美味牛肝菌特殊香气、海鲜味及烧烤味突出，感官评分达到8.0。葡萄糖添加量超过3%时，由于焦糖化反应过度会产生焦糊味，感官评分降低。同时，还原糖与氨基化合物的比例也会影响美拉德反应过程中的化学平衡，造成反应产物的A420nm先增大后减小。因此，选取葡萄糖添加量2%～5%进行后续正交试验。
2.1.4 L-谷氨酸添加量对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响
L-谷氨酸添加量对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响如图4。
图4 L-谷氨酸添加量对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响
Fig.4 Effect of L-glutamic acid addition on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products
由图4可知，L-谷氨酸添加量由0.2%增加到0.4%时，感官评分从7.08升高到8.52，美拉德反应产物呈现出的海鲜味及烧烤味越来越浓，美拉德反应越来越强烈。但是，L-谷氨酸添加量超过0.4%时，L-谷氨酸呈现的鲜味愈发单调，口感不协调，造成感官评分下降。另外，L-谷氨酸添加量过多会造成美拉德反应底物比例失调，影响美拉德反应，从而造成A420nm变小。因此，正交试验的L-谷氨酸添加量选择0.2%～0.5%为宜。
2.1.5 初始pH值对美拉德反应A420 nm及感官评分的影响
初始pH值对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响如图5。
图5 初始pH值对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响
Fig.5 Effect of the original pH value on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products
由图5可知，初始pH值为4时感官评分和A420nm都达到最佳，此时美拉德反应产物既有美味牛肝菌特殊香气，也有海鲜和烧烤风味，且颜色呈棕黄色，口感浓郁协调，风味最佳。pH值影响氨基酸的解离状态，pH值过低，美拉德反应的中间产物变得不活泼，得不到大量芳香类物质。pH值升高会加速焦糖化反应，产生不良气味，结果与朱振元等[12]研究结果一致。A420nm值随初始pH值的增加呈现先上升后下降趋势，说明初始pH值对美拉德反应产物的色泽影响较大。综上所述，初始pH值选择2～5进行后续正交试验。
2.2 正交试验结果
正交试验设计及结果见表3。
表3 正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal experimental design and results
试验号 A反应时间/h B反应温度/℃ C葡萄糖添加量/% D L-谷氨酸添加量/% E初始pH值 A420 nm 感官评分1 1（1.5） 1（85） 1（2） 1（0.2） 1（2）0.092 6.74 2 1 2（90） 2（3） 2（0.3） 2（3）0.100 7.22 3 3（95） 3（4） 3（0.4） 3（4）0.176 7.14 4 1 4（100） 4（5） 4（0.5） 4（5）0.093 6.92 1 5 2（2.0） 1 2 3 40.178 7.55 6 2 2 1 4 3 0.192 7.50 7 0.233 6.84 8 2 4 3 2 1 0.102 7.32 2 3 4 1 2 3（2.5） 1 3 4 20.163 7.50 10 3 2 4 3 1 0.086 6.74 11 3 3 1 2 4 0.137 7.28 12 3 4 2 1 3 0.121 7.34 13 4（3.0） 1 4 2 3 0.157 6.38 14 4 2 3 1 4 0.146 7.32 15 4 3 2 4 1 0.133 7.52 16 4 4 1 3 2 0.156 7.52 9
续表3 正交试验设计及结果
Continue table 3 Orthogonal experimental design and results
试验号 A反应时间/h B反应温度/℃ C葡萄糖添加量/% D L-谷氨酸添加量/% E初始pH值 A420 nm 感官评分A420 nm k1 0.115 0.144 0.144 0.148 0.103 k20.176 0.131 0.133 0.124 0.163 0.127 0.170 0.147 0.149 0.162 0.148 0.118 0.142 0.145 0.139 0.061 0.052 0.014 0.025 0.060最佳组合 A2B3C3D3E2 7.00 7.04 7.26 7.06 7.08 7.30 7.20 7.41 7.05 7.27 7.22 7.20 7.32 7.09 7.09 7.19 7.28 6.72 7.31 7.27 0.30 0.24 0.69 0.26 0.19最佳组合 A2B4C2D4E2或A2B4C2D4E4 k3k4R感官评分 k1 k2k3k4R
由表3可知，对于美拉德反应产物A420nm来讲，各变量影响的主次顺序为A（反应时间）＞E（初始pH值）＞B（反应温度）＞D（L-谷氨酸添加量）＞C（葡萄糖添加量），其中反应时间和初始pH值是影响美拉德反应产物A420nm的主要因素，最佳反应条件为A2B3C3D3E2。各变量对美味牛肝菌酶解液美拉德反应产物感官评分的影响顺序为C（葡萄糖添加量）＞A（反应时间）＞D（L-谷氨酸添加量）＞B（反应温度）＞E（初始pH值），其中葡萄糖添加量是影响感官评分的主要因素，最佳的美拉德反应条件为A2B4C2D4E2或A2B4C2D4E4。反应温度对A420nm的影响程度要远大于其对感官评分的影响，故反应温度选择95℃。同理，综合考虑各因素对美拉德反应产物A420nm及感官评分的影响，葡萄糖添加量选择3%，L-谷氨酸添加量选择0.5%，即美拉德反应的最佳工艺参数组合为A2B3C2D4E2，即反应时间2.0 h、反应温度95℃、葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.5%，初始pH 3。
2.3 验证试验
采用最佳美拉德反应条件（即反应时间2.0 h、反应温度95℃、葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.5%，初始pH3）进行3次平行试验，获得美拉德反应产物的感官评分为8.37，A420nm为0.241，优于正交试验的所有组合，证明优化结果是可靠的。美拉德反应产物色泽均匀呈棕褐色、具有美味牛肝菌特殊风味和浓郁的海鲜味及烧烤味，口感协调饱含鲜、甜味，无异味。
3 结论
通过外源添加葡萄糖和L-谷氨酸，以美味牛肝菌酶解液为试验原料，以感官评分和A420nm为试验指标，通过美拉德反应制备美味牛肝菌风味基料。在单因素试验结果的基础上，采用L16（45）正交试验优化出美味牛肝菌酶解液美拉德反应的最佳反应条件。反应时间2.0 h、反应温度95℃、葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.5%及初始pH3时，美拉德反应产物呈棕黄色，具有美味牛肝菌特有香气、浓郁的海鲜风味及烧烤风味。研究结果为开发新型天然食用菌风味基料及美味牛肝菌资源的高值化利用提供了一定理论依据和技术支撑。
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