陈香型铁观音是成品茶经过5年以上陈化，具有陈香特征的铁观音[1]，近年来由于陈香型铁观音独特的风味，越来越多的消费者关注陈香型铁观音，掀起了一股陈香型铁观音的收藏热潮[2-3]。铁观音制成茶后，再经过高温烘焙和长时间自然陈化，茶质由青涩转甘醇，酸味由强烈转柔和。陈化后的铁观音梅酸香浓，陈香细腻，是区别于其他陈茶的特征之一[2，4-6]。
有机酸作为茶叶酸味产生的物质基础，一般仅占茶叶干重3%。但它与其他滋味物质存在互作关系，同时又作为一些水解和氧化反应过程中碳氢化合物分解的中间产物，影响茶的风味品质[7-8]。目前对铁观音陈化中有机酸的研究仅集中在没食子酸（gallic acid，GA）的积累上。没有进一步探究其他有机酸的变化规律，故本文选取当年新制茶和存放 6、9、13、18、25、30年的陈茶，利用高效液相色谱法测定其中常见的10种有机酸含量，分析其在陈化过程中的变化规律。同时计算各有机酸的滋味活力值（taste activity value，TAV），考察各酸的酸味贡献度。以期为陈香型铁观音的年份鉴别和风味品质评价提供参考，为建立陈香型铁观音陈化品质监控体系提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁观音茶样选取新制浓香型铁观音成品茶（新茶）与自然陈放 6、9、13、18、25、30 年后的浓香型铁观音成品茶（陈茶），产地为福建省泉州市安溪县，7个茶样均以铁观音茶树新梢为原料，于当年秋季采摘，由福建安溪铁观音集团采用同一加工工艺制作。
L-苹果酸、柠檬酸、DL-酒石酸、琥珀酸、抗坏血酸、富马酸、乙酸（纯度均≥99%）、甲酸、草酸（纯度≥98%）、乳酸（纯度 89.98%）：Aladdin公司；磷酸（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂公司；乙腈（色谱纯）：德国默克公司；试验用水均为超纯水。
1.2 仪器
Agilent 1260型液相色谱系统 [包括四元泵（G1311B）、自动进样器（G1329B）、柱温箱（G13416A）和二极阵列管检测器（G1315D）]：美国Agilent公司；AS系列超纯水仪制备仪：深圳市宏森环保科技有限公司；KQ-5200B超声清洗机：昆山美美超声仪器有限公司。
1.3 茶样的处理
称取磨碎过30目筛后的茶样1 g（精确至0.001 g）于烧杯中，加入50 mL沸水，摇匀，沸水浴浸提45 min，每隔10 min晃动一次。对提取液进行抽滤，冷却后定容至50 mL，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，用于上机测定。试验重复3次。
1.4 有机酸的检测方法
参照王丽丽等[9]对茶叶有机酸测定方法。Prevail C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。流动相：0.10%磷酸水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）。线性洗脱程序为：100%A（0 min）-100%A（12 min）-0%A（17 min）-0%A（25 min）-100%A（30 min）-100%A（35 min）；柱温40℃；流速1 mL/min；二极管阵列检测器同时在210 nm和245 nm波长下检测抗坏血酸，在210 nm波长下检测其他9种有机酸。
1.5 有机酸标准曲线绘制
分别精密称取或移取一定量L-苹果酸、柠檬酸、DL-酒石酸、琥珀酸、抗坏血酸、富马酸、乙酸、甲酸、草酸、乳酸，用超纯水溶解并定容至10个容量瓶中，配制成单标母液，质量浓度分别为 5、2.5、2.5、20、2、0.05、5、10、10、100 mg/mL；各取一定量单标母液，用超纯水稀释成系列浓度梯度的混合标准溶液。按1.4中的检测方法，根据保留时间定性，分别以混标液中10种有机酸的质量浓度和其峰面积作出标准曲线。
1.6 数据分析
用Excel 2016对数据进行编辑，采用SPSS 26软件对数据进行方差分析，若方差齐则用邦弗伦尼（Bonferroni）进行组间检验，若方差不齐则使用盖姆斯-豪厄尔（Games-Howell）进行组间检验。
2 结果与分析
2.1 有机酸的总体积累特征
试验采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对当年新茶（陈化年份记为0年）和陈化年份分别为 6、9、13、18、25、30年的铁观音陈茶中的10种有机酸含量进行测定。有机酸混合标准品色谱图如图1所示，各有机酸工作曲线回归方程见表1。
图1 有机酸混合标准品色谱图
Fig.1 Chromatograms of mixed standards of organic acid
1.草酸；2.DL-酒石酸；3.甲酸；4.L-苹果酸；5.抗坏血酸；6.乳酸；7.乙酸；8.柠檬酸；9.琥珀酸；10.富马酸；除抗坏血酸在 245 nm 处测得，其余有机酸均在210 nm处测得。
表1 有机酸标准品回归方程
Table 1 Regression equation of standards of organic acid
注：除抗坏血酸标准曲线是以在245 nm处测得的峰面积建立，其余有机酸均在以210 nm处测得的峰面积建立。
有机酸回归方程拟合度线性范围/（mg/mL）草酸 y=7 927.8x+198.73 R2=0.998 8 0.040 0～0.110 0 DL-酒石酸 y=1 005.4x+2.474 3 R2=0.999 5 0.007 3～0.048 4甲酸 y=523.89x+1.614 9 R2=0.999 0.030 2～0.090 6 L-苹果酸 y=485.06x-0.282 6 R2=0.999 9 0.019 7～0.118 2抗坏血酸 y=28 495x-6.362 6 R2=0.999 4 0.003 9～0.015 5乳酸 y=264.51x+1.303 7 R2=1.000 0.190 0～1.895 1乙酸 y=250.54x+15.443 R2=0.999 9 0.008 1～0.081 2柠檬酸 y=757.78x-2.948 6 R2=0.998 9 0.005 0～0.004 5琥珀酸 y=334.49x-2.097 R2=0.999 4 0.199 3～1.793 9富马酸 y=185 166x+3.166 3 R2=0.998 9 0.000 1～0.001 0
将7个茶样测得的有机酸峰面积代入各自标准曲线方程，计算其在茶叶中的含量，结果如表2所示。
由表2可知，10种有机酸总量为100.24 mg/g～177.49 mg/g。30年陈化期里，有机酸总量上下波动，先在第6年出现峰值，随后快速下降，在第25年达到谷值，又小幅上升，但始终比新茶含量高。其中6、30年陈茶的总酸含量分别高出新茶77.2%、30.5%，而25年陈茶仅比新茶高出9.4%。
乳酸（44.6%～54.5%）和琥珀酸（24.8%～37.1%）始终为茶叶主要有机酸，两者的波动一定程度上决定了总酸含量的变化趋势。而DL-酒石酸和富马酸含量极少，两者之和仅占总酸的0.08%～0.42%，抗坏血酸也始终没有检出。
总酸含量所呈现的“先升后降，再逐渐平缓”的趋势，进一步解释陈茶陈化中存在pH值下降的现象[6，10]。同时说明陈茶的酸变现象不仅是大量表没食儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）转化成没食子酸（gallic acid，GA），其余有机酸的积累同样提供了酸味[10-11]。而有文献[6]提到铁观音陈化后期，pH值又开始缓慢上升，从23年～39年，pH值从4.66升至5.29。这与有机酸组分即使在陈化后期仍处于小幅波动的状态有关。从表2也可以看出，25年后的陈茶总酸含量又开始小幅增加。蔡怡婷等[6]对不同年份的铁观音进行感官评价，发现陈化期短于13年的茶叶带有令人不适的强烈酸味，而长于17年的陈茶酸味逐渐转醇，陈香、果香愈发明显。这说明铁观音陈化期间有机酸组分的动态累积对滋味的形成至关重要。所以优质铁观音老茶的风味并非部分消费者所认为的只是酸味强、陈味重，应是具有合适的酸度，且陈香细腻。
表2 各贮藏年份陈香型铁观音中10种有机酸含量
Table 2 Comparison of content of 10 organic acids in 7 old Tieguanyin teas mg/g
注：ND表示该物质含量低于检测限；各年份茶叶测3次，同列标有相同字母表示该有机酸年份间差异不显著（P＞0.05），标有不同字母表示年份间差异显著（P＜0.05）。
年份 乳酸 琥珀酸 甲酸 乙酸 L-苹果酸 柠檬酸第 0 年 54.15±1.17d24.82±1.97c8.84±0.83ab3.75±1.57de 3.62±0.20ae2.57±0.363abc草酸2.27±0.069b有机酸总量0.201±0.201abc0.016 1±0.001 2a DL-酒石酸 富马酸 抗坏血酸ND 100.24±4.10c第 6 年 95.44±1.73a55.92±1.86a8.42±0.11a 5.7±1.16cd 2.64±0.02ad 4.37±0.423a 4.47±0.204a 0.52±0.013a 0.005 3±0.000 4b ND 177.49±3.31a第 9 年 66.49±2.42b 40.3±1.6abc6.44±0.36ab2.11±0.17ed 1.87±0.13bcd1.71±0.329abc 3.01±0.219b ND 0.001 9±0.000 1b ND 121.94±4.04bc第 13 年 56.38±1.37cd39.06±5.43bc8.16±0.19a13.33±0.71ab2.58±0.27abcde ND第 18 年 51.35±3.26d40.77±3.75abc7.14±0.72ab10.61±2.06bc2.31±0.09abcde ND第 25 年 55.45±1.43cd40.72±1.89abc6.73±0.08b0.59±0.59de 2.06±0.03bce 1.09±0.195b第 30 年 64.54±0.71bc47.65±3.59ab8.09±0.18a4.52±0.94cde2.19±0.04bce 0.62±0.354b 2.76±0.203b 2.78±0.321b 2.67±0.142b 2.59±0.138b ND ND ND 122.27±6.98bc 0.089±0.089abc ND ND 115.04±8.21bc 0.31±0.01b ND ND 109.62±1.56bc 0.549±0.112abc ND ND 130.75±5.33b
2.2 有机酸各组分变化特征
陈香型铁观音陈化中9种有机酸变化特征见图2。
图2 陈香型铁观音陈化中9种有机酸变化特征
Fig.2 The variation characteristics of each 9 organic acids of old Tieguanyin tea during the aging process
a.小幅度变化组；b.中等幅度变化组；c.大幅度变化组。
以新茶（第0年）为对照，将检出的9种酸含量随年份的变化率特征归为3组，分别为小幅度变化组（a）、中等幅度变化组（b）、大幅度变化组（c）。可以看出，a组中4种酸陈化前期变化规律虽不同（乳酸和草酸前期含量先增后减，甲酸和L-苹果酸前期含量先减后增），但在第13年后，各酸变化率逐渐趋稳，不再出现大幅变化。后期变化的相对平稳，使4种酸最终保持在约±50%变化率内，是9种酸中变化相对温和的4种。b组中3种酸（琥珀酸、柠檬酸、富马酸）同样是前期波动较大而后期趋缓，但因前期的变化幅度比a组大，使后期最终保持在约±50%～±100%的变化率（其中富马酸第13年时，已无法检出）。不同于前两组的c组，乙酸和DL-酒石酸在经历了前期的波动后并没有趋缓，而是再次大幅度波动。其中乙酸在第9年达到峰值（变化率255.7%），随后快速下降，25年达到谷值（变化率-84.2%）后又开始回升；DL-酒石酸在前期先升后降，在含量降至无法检出后，又开始回升并一直保持增长势头，在第30年时变化率达到173.2%。
如此看来，9种有机酸在铁观音陈化前期（0～13年），其含量都有较大的波动。第6年除L-苹果酸和甲酸有小幅减少及原本含量就很少的富马酸大幅下降外，其余有机酸均大幅增加，致使第6年陈茶总酸含量最高；进入第9年，各酸的含量均不同程度地回落。13年后，各酸总体变化趋缓，除了乙酸和DL-酒石酸外，其他7种酸含量不再大幅变化。因而总酸含量的变化曲线表现出先升后降，逐渐平稳。但由于乳酸、琥珀酸和乙酸在25年后再次增加，使第30年陈茶的总酸含量小幅攀升。这一方面说明了有机酸在陈化中的动态累积是铁观音“由酸转醇，越陈越香”的物质基础。因而只有陈化超过15年甚至20年以上的铁观音，待酸度回落，有机酸各组分大体趋稳后，才能得到品质上乘的陈茶。同时也可以推断，陈香型铁观音在陈化后期风味品质虽已成形，继续延长陈化时间并不会使茶的香型、口感发生很大转变。但一些内含物仍处在不断转化中，因此在陈化后期里，陈茶仍能在不同阶段给品饮者不一样的风味体验。
而陈化前，铁观音新茶中有机酸总量为100.24 mg/g，大大高于其他茶叶。谢娇枚[12]分析了黑茶在近一年半陈化中8种有机酸（草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸）的变化特征，发现其总酸占茶叶1.7%～2.2%，陈化过程中含量波动变化无明显规律。相比之下，陈香型铁观音有机酸组分丰度高，浓厚适口的酸味便成为其主要特征。而且不同于黑茶的陈化，铁观音陈化中有机酸组分变化特征性更强，具有潜在的变化规律。
铁观音在长期陈化中，除总灰分较为稳定外，水浸出物、茶氨酸、茶多酚和游离氨基酸总量均不同程度地下降[13]。故有机酸组分的特征性累积，应与一些大分子物质降解有关。其实质便是微生物参与茶叶陈化，将碳氢化合物代谢生成有机酸及各种小分子物质。陈化中微生物新陈代谢产生有机酸影响茶叶pH值，期间茶叶又通过反复烘烤再陈放维持相对稳定的含水量。这些陈化环境因子的变化又反过来影响微生物的生长发育及其种群的更迭。因此可以推测陈化前期产酸类微生物处于优势地位，大量生成有机酸；中期产酸类微生物代谢活动受到抑制，有机酸的降解速度大于生成速度，总酸含量下降；后期有机酸生成与降解处于相对平衡，总酸含量变化幅度不大。
2.3 各有机酸的酸味贡献度
计算铁观音陈化中有机酸的滋味活力值，考察各酸对茶汤酸味的贡献度，结果见表3。
当滋味活力值（TAV=呈味物质浓度/阈值）小于1，则说明可能无法在茶汤中尝出该物质的滋味。相反，呈味物质的TAV越大，说明其越有可能成为特征风味物质[15]。从表3可以看出，铁观音中9种有机酸之间滋味活力值差异较大。各年份中仅乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸和L-苹果酸的TAV出现大于1的情况，而其中仅有琥珀酸TAV始终大于1，占总酸含量最多的乳酸TAV却仅在第6年大于1。草酸、DL-酒石酸和富马酸在各年份中TAV都较小，其中富马酸TAV相对较低。若仅以TAV考量，9种酸中，琥珀酸在酸味的贡献度上占据主导。
表3 各贮藏年份陈香型铁观音9种有机酸滋味活力值
Table 3 The taste activity values of 9 organic acids in each old Tieguanyin teas
注：选取文献[14]中最新收录的滋味阈值作为各有机酸的滋味阈值；除富马酸的滋味阈值是在啤酒溶液中测得的察觉阈值（引起味感所需要的最小刺激量）外，其他有机酸均为在水溶液中测得的识别阈值（味觉能够感知到并识别具体变化的最小刺激量）；以茶水比1∶50（g/mL）计算茶汤中各酸TAV；/表示无法检出。
组分阈值/（mg/kg）TAV第0年 第6年 第9年 第13年 第18年 第25年 第30年 变异系数/%乳酸 1 400 0.774 1.363 0.950 0.805 0.734 0.792 0.922 23.93琥珀酸 106 4.68 10.55 7.60 7.37 7.69 7.68 8.99 22.79甲酸 200 0.884 0.842 0.644 0.816 0.714 0.673 0.809 11.89乙酸 120 0.625 0.950 0.351 2.222 1.768 0.099 0.753 79.16 L-苹果酸 55 1.318 0.959 0.682 0.936 0.839 0.750 0.798 23.36柠檬酸 127 0.405 0.688 0.270 / / 0.172 0.098 106.29草酸 500 0.091 0.179 0.120 0.110 0.111 0.107 0.104 24.33 DL-酒石酸 44 0.091 0.236 / / 0.040 0.141 0.250 96.60富马酸 422 0.000 8 0.000 3 0.000 1 / / / / 178.88
一般酸味物质是通过H+刺激味蕾中的酸味感受器，形成传导电流，最终使大脑发出“酸”的信号。但感官接收的酸味强弱并不总是和pH值呈正比。酸味剂的阴离子对酸味强度和自身的风味都有重要影响，如大多数有机酸都具有清鲜、爽快的酸味，而当其浓度低到某种程度时，就变成了一种甜美味[16]。而且，无论是酸味还是其他滋味都不是简单的线性叠加，除了滋味物质因具有多个滋味属性而具有不同识别阈值外，滋味物质间的交互作用也尤为重要[8]。即茶汤中的酸味可通过与其他滋味（甜、苦、涩、鲜）物质间的互作关系，最终体现为滋味协同、滋味加和、滋味抑制[8]。而当各种滋味物质形成混合物时，即使其浓度比其阈值还要低，它们的阈值也会相互减少为原来阈值的1/n，最终使其敏感度升高[15]。因此，尽管陈茶有机酸组分中只有琥珀酸TAV一直大于1，却不能认为其他有机酸对滋味贡献不大。相反，正是不同TAV的各酸在长时间陈化中此消彼长，才形成了铁观音陈茶的独特风味。
毛世红[8]在研究中用偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）对工夫红茶中的关键滋味组分筛选后发现：乳酸、乙酸、有机酸总量与5个滋味属性（甜、酸、苦、鲜、涩）均有一定程度相关性。其中乳酸与5个滋味都呈正相关，而乙酸与苦味、酸味、鲜味呈正相关，与涩味、甜味呈负相关。并且进一步认为有机酸含量变化可能对工夫红茶整体滋味品质产生巨大影响，因为有机酸一方面通过自身酸味调节口腔对其他滋味的感知，另一方面又通过影响茶汤体系中的pH值来调控滋味物质之间的交互作用。而吕海鹏等[17]在研究中通过对普洱茶滋味得分与其重要滋味化学物质间的相关性分析后发现，酒石酸、柠檬酸、有机酸总量均与其滋味得分呈显著性负相关（P＜0.05）。如此看来，有机酸组分是构成茶叶良好品质的重要一环，而其对不同茶类的滋味的影响结果也迥然不同。作为陈香型铁观音风味形成的关键物质，有机酸组分与感官属性的关联还待做进一步的研究。
3 结论
国家标准[1]中把陈化5年作为区别陈香型铁观音与其他香型铁观音的时间节点，但仅从本试验的结果及相关文献[6]的描述来看，5年恰好处在茶汤酸味较重、陈香未显的陈化前期。这使得部分消费者形成了酸味强、陈味闷味重才是陈香型铁观音的固有印象。优质的陈茶应是陈化15年甚至20年以上，其酸度下降转柔和，且陈香浓厚。而由于目前还缺乏对铁观音陈期的统一鉴定标准，导致消费者难以明辨不同年份的铁观音，这都不利于陈香型铁观音的开发和推广。铁观音陈化中有机酸组分累积潜在规律性的揭示，既解释了陈茶酸度变化的原因，也进一步完善了各年份陈香型铁观音化学组分识别体系，为陈茶年份认定提供了一种简便可行的方法。各酸滋味活力值分析也表明：陈茶酸甘细腻的独特风味是由于不同滋味活力值的有机酸的非线性叠加效应以及各滋味物质的交互效应的结果。而铁观音有机酸组分在陈化中动态累积生成的机理以及其与感官属性的联系还有待进一步探究。
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