重金属难于生物降解，且容易在食物链和环境中富集，近些年随着环境污染的加剧，逐渐成为危害极大的食品安全问题[1]。食品被镉污染后能对健康产生慢性或急性健康危害：骨折、肾功能紊乱、高血压，甚至癌症；砷可以与生物活性蛋白的硫醇基团键合，对动物的心肌、呼吸、生殖和免疫系统均有损伤[2-3]。火焰原子吸收法（flame atomic absorbption spectrometry，FAAS）、石墨炉原子吸收法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）、电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES）和电感耦合等离子体发射光谱法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-OES）等均可用来检测环境及食品中的重金属，但几乎所有的检测手段都需要先将样品处理为可溶液体才能做进一步的检测。前处理过程要花费分析过程60%以上的时间[4]，目的是移除可能与重金属络合的有机物质，释放待测组分进入消解液，消除基体干扰，浓缩待测组分，使处理后样品能满足分析方法要求[5]。选择高效、准确的样品预处理方法是测定重金属元素含量的关键步骤，直接影响检测结果的准确性和可再现性。
目前常见的预处理方式有溶解法、熔融法、烧结法、干灰化法、湿法消解、微波消解、高压密闭消解等[5]，主要是利用物理和化学处理的方式分解样品，提取目标物质，达到检测所需效果。消解方法的改进主要集中在便利热源和环保试剂的选择上，尚未见报道低成本且高效的有效预处理方法。
在诸多研究物质提取的报道中，酶法预处理作为一种样品预处理方法，一直被认为是一种温和、方便、高效和环保的样品处理方式[6]。与一般的样品预处理方式相比，酶处理因为操作灵活，使用有毒有害溶剂少，能量和资金上的投入低，是一种相比较而言更为安全、环保、经济的方法，被越来越多的应用于样品处理中[7-8]。本文对食品中镉、砷的存在形态及酶处理工艺进行了初步分析，并探讨了酶法预处理在重金属检测中应用的可能性。
1 镉、砷在食品中的存在形态分析
镉在谷物中主要与蛋白质结合。比如稻米中的镉主要与蛋白质相结合，尤其是谷蛋白对米中镉的结合起重要作用；香菇对镉有较强的富集能力，研究证实其结合物的分子量为3万以上和3 000以下，两种组分的比例为2∶1，其中低分子组分的紫外分析及茚三酮呈阳性反应的结果证实为肽；还有研究证明了大豆中的镉是以与蛋白质结合的形态存在，约占大豆总镉的30%[9]。也有研究表明玉米中无机离子态镉含量高于有机态镉[10]。
以镉在植物中可溶性来说，植物根系中的镉主要以乙醇提取态存在，叶片中镉主要以去离子水提取态和氯化钠提取态存在。镉在甜高粱中其化学形态主要以醋酸提取态及盐酸提取态为主[11]。镉在玉米中主要以酸溶态镉为最多[10]。此外，在一项以露天盆栽对试验对象的研究中发现，与乙醇提取态、水提取态、醋酸提取态和盐酸提取态相比较，镉在蔬菜中主要以氯化钠提取态的形式存在[12]。另有研究表明，海豚肝脏中，镉以可溶态和不溶态形式存在，可溶态镉占镉总量的45﹪左右；可溶态镉中没有游离的镉，全部都与蛋白质相结合[13]。
在生物机体中，砷多以复杂的有机形态存在，如甲基砷酸（monomethylarsine acid，MMA）、二甲基砷酸（dimethylarsinic acid，DMA）、砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）、砷胆碱（arsenocholine，AsD）及砷糖[14]。大量研究表明，海产品中的砷主要是毒性较小的有机砷，且基本上是以砷甜菜碱和砷胆碱形式存在，另外还存在更复杂的砷化合物包括砷糖、砷脂类化合物等[15]。经研究发现小麦中存在的砷主要与相对分子质量为54500和5500蛋白质相结合[16]，此外，面粉、大米等农产品中存在着极少量的亚砷酸[arsenious acid，As（Ⅲ）]、砷酸[arsenenic acid，As（V）]、二甲基砷酸（DMA）[14]。
2 酶法预处理在镉、砷检测中的应用探讨
酶处理是把生物大分子消化成为小分子，并利用溶剂将目标物质提取出来的过程。利用酶法对样品进行预处理，从酶解液中提取目标物质以满足重金属检测需求有着一定的理论及实际基础。
2.1 酶处理对样品中目标物质提取的促进作用
研究酶处理对豆蔻出油率的影响，发现未经酶处理的出油率为6.73%，经果胶酶、纤维素酶、戊聚糖复合酶、蛋白酶处理后，出油率为7.23%～7.83%，在95%置信区间上有显著差异性。其中戊聚糖复合酶酶解效率最高[17]。使用纤维素酶对银杏叶进行预处理后，类黄酮的提取率与未经酶处理的提取率相比较，提高了120%[7]。使用果胶酶和纤维素酶从番茄加工废料（番茄皮/籽）中提取类胡萝卜素和番茄红素的提取率相比非酶处理的提取率分别高6倍和10倍[18]。经蛋白酶预处理的玉米蛋白粉，与非酶处理的玉米蛋白粉相比，不但使叶黄素的提取量由非酶处理的165.3 μg/g提高到340.5 μg/g，而且浸提时间由5 h缩短为20 min[19]。使用胃蛋白酶处理乳酪，与传统的氯仿提取方法相比较，黄曲霉毒素M1的提取率更高[20]。
使用扫描电镜观察经果胶酶和纤维素酶处理过的豆蔻细胞，发现经酶处理的细胞壁化合物分解，而未经酶处理的细胞壁仅有因物理处理而导致的结构上的破坏，两者细胞壁存在明显差异，证明了酶对细胞壁的裂解作用[17，21]。同样用扫描电镜对酶处理后的杜仲细胞壁的表面和纵切面进行了形态学上的研究，发现未经酶处理的细胞壁较厚且结构完整，有着清晰的组织边缘；而酶处理后的细胞和细胞壁裂解，表面组织起皱，架构坍塌，栅栏组织和薄壁组织已无明显界限[22]。一方面，在后续的提取过程中，细胞组织物理结构上的变化会促进溶剂进入细胞，加速目标物质的溶出[22]。另一方面，有研究认为目标物质的提取率不高，大部分情况下是由于提取时溶剂分子难以渗透进入组织而造成的。因为酶处理可裂解细胞壁成分，使细胞内物质暴露出来，从而更易提取[18]。并有研究表明细胞壁的降解程度与目标物质提取率之间有着显著的正相关关系[23]。
对植物性样品而言，植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶等。为提高提取率，纤维素酶、果胶酶和β-葡萄糖苷酶经常被用来裂解植物细胞壁组分，以促进细胞内成分的释放[8，22]。且有研究发现，镉主要富集在甜高粱及拟南芥等植物细胞的细胞壁上[11，24]。
对动物性样品而言，酶法预处理也可瓦解样品组织，促进目标物质溶出。利用胃蛋白酶处理鱼肉组织3 h后，成功使得囊幼虫脱离组织包裹，从酶解溶液中浮出[25]。
2.2 酶处理在镉、砷检测中的应用
对样品中镉、砷存在形态的了解可帮助选择适合的酶类和提取剂。研究发现小麦中相对分子质量为54 500的蛋白质与砷的结合体易被胃蛋白酶和胰蛋白酶分解[16]。使用碱性蛋白水解酶处理海豚肝脏，平均有45%的镉溶出[13]。选取胰蛋白酶与碱性蛋白酶，对翡翠贻贝进行酶法预处理，发现经酶处理后样品中砷含量的检测结果有所提升，提取率为98.21%与103.59%，而酶处理前的提取率为88.26%[14]。
另有报道称，糙米中重金属主要以蛋白、纤维、植酸结合态存在，在糙米发芽过程中，蛋白、纤维素、植酸在蛋白酶、纤维素酶、植酸酶作用下部分降解；并认为结合态重金属可能转变为游离态，从糙米内部迁移而出[26]。使用酶法预处理从样品中提取镉、砷化合物以满足检测要求，需要选择合适的酶处理工艺。
3 酶法预处理的工艺研究分析
分析现有的研究报告发现[7，17-20，22，27-28]，样品的酶法预处理工艺流程一般有3种，详见图1。酶解过程一般进行磁力搅拌，或将混合液置于恒温摇床上进行处理。
图1 酶法预处理工艺流程
Fig.1 Process flow sheet of enzyme pre-treatment
样品的酶法预处理包含两个重要步骤：水中或缓冲溶液中的酶反应（酶解）和利用有机溶剂提取[22]。以下对这两个重要步骤的影响因素进行分析。
3.1 酶反应过程的影响因素分析
3.1.1 样品粒度
样品粒度是影响酶功能和出油率的一个重要因素。从理论上来看，粉碎后细胞壁被破坏，酶与细胞组分之间的距离变短。一般来说，样品粒度越小，目标物质的浸出越好。将葡萄籽按粒度大小（mm）进行分组：＜0.50、0.50～0.60、0.60～0.71、0.71～1.0、1.0～1.4、1.4～2.0、大于2.0，发现粒度较小的样品出油率较高。与未粉碎样品相比较，粒度＜0.50 mm的出油率增加了130%[29]。使用酶法预处理姜黄根粉提取姜黄素时也发现，随着粒度的减小（0.425 mm～0.180 mm），提取率由2.64%升高到3.84%[28]。
3.1.2 酶的种类
不同的酶降解不同的成分，植物中的酶处理见报道的酶包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白质水解酶、淀粉酶和聚半乳糖醛缩酶[8]。就目前的研究而言，蛋白酶经常被用来去除高蛋白样品中的蛋白质，以提取目标物质[6]。选择合适的复合酶，由于酶之间的协同效应，可以增高目标物质的提取率[8]。使用果胶酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶的4∶1∶1（体积比）复合酶被报道从脱壳油菜籽中得到了91.6%的乳化油出油率[30]。用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的不同组合酶，从忽地笑中提取加兰他敏，发现纤维素酶和果胶酶的复合酶有最高的提取率[27]。用细胞壁多糖酶（聚糖酶+果胶酶）与蛋白酶先后作用于菜籽，油脂提取率最高，达到90.99%[31]。
3.1.3 酶浓度
提取率一般随着酶浓度的增加而升高[8]。纤维素酶可破坏植物细胞壁与细胞间质，促使胞内物质快速扩散溶出，提高目标成分的提取率，但当酶解反应完全，继续增加酶量，对提取率的影响不大。另一方面，在较低的酶浓度下，酶与底物尚可较充分地结合；随着酶浓度的升高，底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制，所以对一定的底物浓度均存在一个最佳酶用量，并非酶越多酶解效果就越好[32]。商业用酶的浓度一般被限制在1%左右，酶活力100 000 U/g以上。
3.1.4 pH值
不同的酶有着不同的最适pH值。pH值不仅影响酶活力，还会影响目标物质的分离。酶可同时溶解和水解蛋白质，并且裂解多糖，从而促进物质浸出[8]。用碱性蛋白酶和纤维素酶的复合酶提取大豆油，pH值经优化后的出油（26.8%）高于在未经调节的pH值下的出油率（20.63%）[33]。
3.1.5 温度
温度是酶处理过程中不可忽视的一个工艺参数。不同样品及所用酶类均对温度有不同的要求。在用酶辅助提取植物油时，除了出油率，在选择最佳温度时，还要考虑油和蛋白质的质量特性。高温不仅导致酶活力的丧失，同时还会使油的颜色加深，使蛋白质变性。然而，相对的低温又会导致酶反应速率下降，以及出油率的降低。酶法水解的最适温度为45℃～55℃[8]。
3.1.6 液固比
低液固比有利于酶与底物之间的反应但会增加反应液的粘度，不利于目标物质的浸出[27]。还有研究认为，粘稠悬浮液不利于酶的渗透，从而有效地与底物接触[30]。高液固比降低了反应液的粘度，加快物质转移过程和酶解速度，相同时间内使更多的处于络合状态的目标物质被释放出来，提取量也随之增大。但当液固比增大到一定程度时，再增加液固比对酶解影响不大，反而会增加生产成本，且会导致废液的增多和增加之后的反乳化的难度[8，19，27，33]。因此，酶处理样品时需选择合适的液固比。
3.1.7 酶反应时间
酶与底物需要一定的接触时间。一般而言，在最初的1 h～3 h间，随着酶处理时间的延长，提取率会急剧升高，但之后随着时间延长，提取率变化不大甚至反而下降[22，27，30]。比如：在 40 ℃、pH 值为 5.0 的情况下，用纤维素酶从杜仲叶中提取绿原酸，发现2 h～24 h之间，提取率几乎没有变化[22]；利用纤维素酶和果胶酶的复合酶从蒜中提取加兰他敏发现，提取率在1.5 h达到最高，之后随着提取时间的严惩，提取率反而下降[27]；用碱性蛋白酶从油菜籽中提取脂肪和蛋白水解物发现最佳提取时间为2.5 h～3 h[30]。也有试验表明，若增加酶处理时间（120 h），出油率可由原优化时间（16 h）的13.7%增加至17.5%[29]。
3.2 镉、砷化合物常用提取试剂分析
样品中镉、砷化合物的溶解性无意是影响提取率的决定性因素。低溶解度意味着低提取率和提取溶剂的大量使用[7]。
由于不同试剂有不同的渗透能力和溶解能力，所以选择合适的提取试剂在提取时至关重要[18]。果蔬等农作物中砷大多以无机形态存在，因此常采用酸作为提取剂。此外甲醇也常被用作有机砷化合物的提取剂。需要特别注意的是，检测动植物组织和海产品中砷时，分析步骤的第一步通常是用丙酮、乙醚或轻石油浸取以除去油脂。甲醇对于去脂的样品的提取率要高于未去脂的样品[14]。提取镉的有机溶剂有水、乙醇、氯化钠、醋酸、盐酸[11-12，24]。
可通过化学基团的修饰提高目标物质的在提取试剂中的溶解性。使用纤维素酶在裂解植物细胞壁的同时，以麦芽糖作为糖基供体，通过转糖苷作用提高类黄酮在提取液中的溶解性，以提高提取率[7]。此外，超声、离心、微波辅助（microwave assisted，MAE）、固相萃取（solid phase extraction，SPE）等提取技术也广泛应用于样品前处理中[14]。
4 结语
根据仪器分析方法要求，以及空白值大小选择合适的样品预处理方法是确保重金属痕量分析准确性的重要保障。预处理技术的深入研究将对重金属分析的发展起到积极的推动作用。
本文总结了3种重金属检测前的酶法预处理样品的工艺流程；并认为镉在食品中主要与蛋白质结合，在叶菜类食品中主要以氯化钠提取态形式存在，在玉米、高粱等作物中主要以酸提取态最多；砷在动物性食品及谷物类中主要以有机态存在，一般用甲醇作为提取剂；蔬菜中砷以无机砷形态存在，以酸作为提取剂；酶法预处理的影响因素包括样品粒度、酶的种类、酶浓度、pH值、温度、液固比和酶处理时间。
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