原花青素（procyanidins，PC）是植物中广泛存在的一类多酚化合物，由黄烷-3-醇单体（如儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯等）及其聚合体组成。原花青素具有抗氧化[1-2]、抗肿瘤[3]、防治心血管疾病[4]等多种生物活性，在食品、药品、化妆品等领域有着广泛用途。目前，原花青素含量的测定方法主要有铁盐催化比色法[5]、正丁醇-盐酸法[6]、香草醛法[7]、紫外分光光度法[8]、高效液相色谱法[9]等。其中，香草醛法的准确度、精密度较好，能同时测定单体及聚合体的总量，操作简单快捷，是原花青素含量测定常用的方法[10]。其原理是原花青素在酸性条件下，黄烷-3-醇单体A环的间苯三酚或间苯二酚与香草醛发生缩合，生成红色络合物，于500 nm处有最大吸收峰，可测其吸光度进而定量。香草醛法已用于葡萄[11]、莲子[12]及花生[13]等多种植物中原花青素含量的测定，但操作方式在不同植物间存在一定差异。
莽吉柿（Garcinia mangostana L.）属藤黄科藤黄属植物，别名山竹、倒捻子，果实为著名热带水果之一。莽吉柿果壳呈紫褐色，坚硬厚实，包含多种活性成分，如氧杂蒽酮[14]、原花青素[15]及果胶[16]等，具有很高的经济开发价值。关于莽吉柿中原花青素含量测定方面的研究较少[17-18]。本实验室在前期工作中，参照其他植物建立的香草醛法对莽吉柿原花青素进行测定，发现结果稳定性不高，有必要对测定方法进行优化。因此本文以莽吉柿果壳为材料，研究酸种类与浓度、香草醛浓度、反应温度、反应时间对香草醛法测定原花青素的影响，通过响应面分析优化获得最佳显色条件，为莽吉柿果壳中原花青素含量提供准确有效的测定方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
莽吉柿：郑州水果市场；儿茶素标准品（纯度＞99%）：中国食品药品检定研究院；香草醛：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、无水甲醇、浓硫酸、浓盐酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
精密电子天平（LT200E）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；超声清洗机（PL-FS80T）：东莞康士洁超声波科技有限公司；低速台式离心机（TD-600）：四川蜀科仪器有限公司；电子恒温水浴锅（DZKW-4）：北京中兴伟业仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2600A）：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 莽吉柿果壳原花青素的提取
称取1 g莽吉柿果壳干粉末，置于100 mL具塞三角瓶内，加入20 mL 50%乙醇溶液，放入超声清洗机中，设定超声功率300 W，超声提取20 min后，将料液3 000 r/min离心10 min取上清，即得原花青素提取液。取提取液10 mL，置于250 mL容量瓶内，加入50%乙醇溶液定容，作为供试样品溶液[19]。
1.3.2 原花青素的测定
取样品溶液0.5 mL（另取50%乙醇为空白对照），置于10 mL具塞试管内，加入3 mL一定浓度的香草醛-甲醇溶液（现用现配），再缓慢加入1.5 mL一定浓度的酸溶液，混匀，放入恒温水浴中避光反应，用分光光度计在500 nm处测定其吸光度值。
1.3.3 单因素试验
1.3.3.1 酸种类与浓度对吸光度值的影响
在香草醛浓度10 g/100 mL，反应温度30℃，反应时间10 min，硫酸浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%及70%，或盐酸浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%及100%条件下，按照1.3.2方法测定吸光度值。
1.3.3.2 香草醛浓度对吸光度值的影响
在硫酸浓度70%或盐酸浓度100%，反应温度30 ℃，反应时间 10 min，香草醛浓度分别为 2、4、6、8、10、12、14 g/100 mL条件下，按照1.3.2方法测定吸光度值。
1.3.3.3 反应温度对吸光度值的影响
在香草醛浓度10 g/100 mL，硫酸浓度70%或盐酸体积分数100%，反应时间10 min，反应温度分别为10、20、30、40、50、60、70 ℃条件下，按照 1.3.2 方法测定吸光度值。
1.3.3.4 反应时间对吸光度值的影响
在香草醛浓度10 g/100 mL，硫酸浓度70%或盐酸浓度100%，反应温度30℃，反应时间分别为5、10、15、20、25、30、35 min 条件下，按照 1.3.2 方法测定吸光度值。
1.3.4 响应面试验设计
在单因素试验基础上，根据Box-Behnken设计原理，选取对测定影响较大的3个因素（硫酸浓度、香草醛浓度、反应温度）为自变量，以吸光度值为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验。响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
水平因素A硫酸浓度/% B香草醛浓度/（g/100 mL） C 反应温度/℃-1 50 6 30 0 60 10 40 1 70 14 50
1.3.5 标准曲线的绘制
准确称取儿茶素标准品配制成0.5 mg/mL母液，经稀释获得 0.01、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.20 mg/mL浓度梯度的标准溶液。按照响应面优化的最佳显色条件，各取0.5 mL标准溶液，加入3 mL 12 g/100 mL香草醛溶液，再缓慢加入1.5 mL 70%硫酸溶液，混匀后放入43℃水浴中，避光反应10 min，在500 nm处测定吸光度值。以吸光度值Y为纵坐标，儿茶素浓度X为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=6.1295X+0.0416，R2=0.998 9。
1.3.6 测定精密度试验
取样品溶液5份，每份0.5 mL，按照响应面优化的最佳条件进行测定，并于次日同样取5份样品溶液测定，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值。
1.3.7 加标回收率试验
取样品溶液0.5 mL，按照优化的最佳条件进行测定，由标准曲线计算出原花青素含量。再取样品溶液0.5 mL，加入0.12 mg/mL儿茶素标准溶液0.5 mL，测定混合溶液中原花青素总含量，计算加标回收率。
1.3.8 数据处理
每组样品做3～5个平行，采用SPSS 19.0软件处理数据并制作图表；采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计与回归分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酸种类与浓度对吸光度值的影响
酸种类与浓度对吸光度值的影响见图1。
如图1所示，随着硫酸与盐酸浓度的增高，吸光度值均越来越大。当硫酸浓度为70%时，吸光度值最大，超过70%后，样品溶液遇酸立即变为藏青色，无法进行测定，故硫酸浓度70%为浓度上限；盐酸浓度为100%时，吸光度值达到最大，无遇酸变色现象。相同浓度的硫酸与盐酸条件下，硫酸体系测定的吸光度值较高。因此选择最适宜的硫酸溶液浓度为70%。
图1 酸种类与浓度对吸光度值的影响
Fig.1 Effect of acid type and concentration on absorbance value
2.1.2 香草醛浓度对吸光度值的影响
香草醛浓度对吸光度值的影响见图2。
图2 香草醛浓度对吸光度值的影响
Fig.2 Effect of vanillin concentration on absorbance value
如图2所示，随着香草醛浓度的增高，硫酸与盐酸体系测定的吸光度值呈现相同变化趋势。香草醛浓度在2 g/100 mL～10 g/100 mL之间，吸光度值逐渐增大，该阶段香草醛浓度越高，与原花青素缩合生成的产物越多，吸光度值越大；当香草醛浓度超过10 g/100 mL后，吸光度值趋于平缓，说明样品溶液中原花青素已经反应完全，不再生成过多产物，故吸光度值变稳定。因此选择最适宜的香草醛浓度为10 g/100 mL。
2.1.3 反应温度对吸光度值的影响
反应温度对吸光度值的影响见图3。
图3 反应温度对吸光度值的影响
Fig.3 Effect of reaction temperature on absorbance value
如图3所示，随着反应温度的增高，吸光度值呈现先升后降的趋势。硫酸体系反应温度在10℃～40℃之间，吸光度值逐渐上升，温度为40℃时，吸光度值达到最大；盐酸体系反应温度为30℃～40℃时，吸光度值较高；温度超过40℃后，吸光度值均逐渐降低，可能温度过高会影响原花青素的化学活性，干扰其与香草醛发生缩合，导致反应不充分，吸光度值下降[12]。因此选择最适宜的反应温度为40℃。
2.1.4 反应时间对吸光度值的影响
反应时间对吸光度值的影响见图4。
图4 反应时间对吸光度值的影响
Fig.4 Effect of reaction time on absorbance value
如图4所示，随着反应时间的延长，硫酸体系测定的吸光度值变化平坦；而盐酸体系在反应10 min时，吸光度值达最大，超过10 min后，吸光度值呈现缓慢降低的趋势，在以盐酸为酸性介质测定其它植物原花青素的研究中有类似现象[7，12，20-21]。因此选择最适宜的反应时间为10 min。对比试验结果，硫酸体系的稳定性较强，响应面试验选择硫酸为考察因素进行优化设计。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计及结果
根据表1试验因素与水平值，以吸光度值为响应值，对3个试验因素进行优化，响应面设计方案及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface methodology
试验序号 A硫酸浓度 B香草醛浓度 C反应温度 吸光度值A 1 1 0-1 0.923 2 0 1-1 0.663 3 0 0.977 4 1-1 0 0.920 1 1 5 -1 0 1 0.526 6 0 0 0 0.730 7 0 0.731 8 0 1 1 0.709 0 0 0 0.733 10 1 0 1 0.958 11 -1 1 0 0.548 12 0 0 0 0.725 13 0 -1 -1 0.610 14 0 0 0 0.720 15 0 -1 1 0.672 16 -1 -1 0 0.484 17 -1 0 -1 0.489 9 0 0
2.2.2 回归方程拟合与方差分析
对表2试验数据进行回归拟合，建立回归模型，获得吸光度值与硫酸浓度A、香草醛浓度B、反应温度C三因素变量的二次多项回归方程：
Y=0.73+0.22A+0.026B+0.022C-1.750×10-3AB-5.000×10-4AC-4.000×10-3BC+0.032A2-0.028B2-0.036C2。
对模型系数的方差分析结果如表3所示。
表3 回归模型的方差分析表
Table 3 Analysis of variance table of regression model
注：**表示差异极显著（P＜0.01）；N表示无显著性（P＞0.05）。
来源 平方和 自由度df 均方 F值 P值 显著性模型 0.40 9 0.004 785.79 ＜0.000 1 **A 0.37 1 0.37 6 670.44＜0.000 1 **B 5.565×10-3 1 5.565×10-3 99.11 ＜0.000 1 **C 4.050×10-3 1 4.050×10-3 72.13 ＜0.000 1 **AB 1.225×10-5 1 1.225×10-5 0.22 0.654 6 N AC 1.000×10-6 1 1.000×10-6 0.018 0.897 6 N BC 6.400×10-5 1 6.400×10-5 1.14 0.321 1 N A2 4.441×10-3 1 4.441×10-3 79.08 ＜0.000 1 **B2 3.307×10-3 1 3.307×10-3 58.89 0.000 1 **C2 5.541×10-3 1 5.541×10-3 98.67 ＜0.000 1 **残差 3.930×10-4 7 5.615×10-5失拟项 2.822×10-4 3 9.408×10-5 3.40 0.134 2 N纯误差 1.108×10-4 4 2.770×10-5总和 0.40 16
该模型P＜0.000 1，达到差异极显著水平，表明本次建模有意义；模型失拟项F=3.40，P＞0.05，无显著差异，说明试验结果误差较小；RSD=0.749 3%，说明可信度和精确度高；模型系数R2=0.999 0，校正系数Radj2=0.997 7，回归方程拟合度较好，可以利用该方程对数据进行分析和预测；模型变异系数C.V.=1.05%，显示试验统计数据可靠，能很好地预测响应面。从对响应值的影响程度来看，一次项 A、B、C，二次项 A2、B2、C2均达到极显著水平，表明试验因素对吸光度值的影响是一种非线性关系，影响大小依次为：硫酸浓度>香草醛浓度>反应温度。
2.2.3 因素间交互作用分析
各试验因素交互作用的响应面图和等高线图见图5～图7，通过判断响应面的坡度和等高线的圆形程度，从而获得最佳的工艺条件[22]。
图5 硫酸浓度与香草醛浓度交互作用的响应面图和等高线图
Fig.5 Response surface and contour map for the effects of sulfuric acid and vanillin concentration
图6 硫酸浓度与反应温度交互作用的响应面图和等高线图
Fig.6 Response surface and contour map for the effects of sulfuric acid and reaction temperature
图7 香草醛浓度与反应温度交互作用的响应面图和等高线图
Fig.7 Response surface and contour map for the effects of vanillin concentration and reaction temperature
分析响应面图可知，随着硫酸浓度的增高，吸光度值越来越大，随着香草醛浓度、反应温度的增高，吸光度值分别呈现上升后平稳与先上升后下降的趋势。将各响应面图进行对比，硫酸浓度对吸光度值的影响最大，表现为其曲面坡度较为陡峭；而香草醛浓度、反应温度的曲面坡度相对较平缓，说明两因素对吸光度值的影响较小。硫酸浓度、香草醛浓度、反应温度两两交互作用对吸光度值没有显著影响，表现为各等高线图中等高线的圆形程度明显[23]，这与回归方程的方差分析结果一致。
2.2.4 最佳显色条件的验证
响应面优化的最佳条件为：香草醛浓度11.69 g/100 mL、硫酸浓度70%、反应温度42.82℃、反应时间10 min，吸光度预测值可达0.985。根据实际操作需要，将最佳条件改进为：香草醛浓度12 g/100 mL、硫酸浓度70%、反应温度43℃、反应时间10 min，以此条件进行5次验证试验，获得吸光度平均值为0.979，RSD值为0.609%，由标准曲线计算出莽吉柿果壳中原花青素的含量为76.45 mg/g。所建模型优化的最佳显色条件稳定，能够真实反映试验值，可行性强。
2.3 测定精密度试验结果
按照最佳条件平行测定5份样品溶液，计算RSD值，结果见表4。
表4 测定精密度试验结果
Table 4 Results of precision tests
时间 吸光度A1吸光度A2吸光度A3吸光度A4吸光度A5 平均值 RSD/%第1日 0.968 0.978 0.982 0.983 0.974 0.977 0.635第2日 0.979 0.985 0.970 0.981 0.984 0.980 0.612
由表4可知，吸光度值RSD分别为0.635%和0.612%，表明优化最佳条件测定表现出良好的精密度。
2.4 加标回收率试验结果
按照最佳条件进行加标回收率试验，结果见表5。
表5 加标回收率试验结果
Table 5 Results of recovery rate tests
样品含量/mg加入量/mg实测量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%0.076 0.075 0.077 0.077 0.076 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.134 0.132 0.136 0.134 0.137 98.53 97.78 99.27 97.81 100.74 98.83 1.25
由表5可知，加标回收率的平均值为98.83%，RSD值为1.25%，表明优化最佳条件测定表现出较高的准确度。
3 结论
本文首次对香草醛法测定莽吉柿果壳原花青素的显色条件进行优化。单因素试验显示采用硫酸作为酸性介质，体系的稳定性较强；响应面优化最佳显色条件为：样品溶液0.5 mL，12 g/100 mL香草醛溶液3 mL，70%硫酸溶液1.5 mL，反应温度43℃，避光反应10 min；在此条件下测得莽吉柿果壳中原花青素含量为76.45 mg/g，RSD值为0.609%。优化后的方法具有较高的精密度及准确度，稳定性良好，适用于莽吉柿果壳中原花青素含量的测定。
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