广西崇左市大新县2003年被授予“中国苦丁茶之乡”称号，原国家质检总局2006年正式批准对“大新苦丁茶”实施地理标志产品保护[1]。目前大新县大面积推广种植的苦丁茶其种名系为Ilex Kudingcha C.J.Tseng，喜高温多湿而不耐寒，若引至江浙一带栽培冬季会冻死，但是口感比大叶冬青好。近年来的科学研究表明：苦丁茶可以预防和干预高脂饮食引起的高脂血症[2]、保护肝损伤和胃损伤[3-5]、降低胆固醇[6]、保护心脏神经和皮肤[7-8]，具有抗衰老[9]、减肥[10]等作用，因此常被用作制成辅助治疗的功能性饮料[11]，备受人们青睐。苦丁茶中含有的黄酮类物质是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物，具有多种生物活性功能[12]，如抗氧化、抗菌、抗炎等。提取苦丁茶中总黄酮的方法[13]有热水提取法、乙醇回流法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等，不同的提取方法各有优点，都被广泛地应用在总黄酮的提取过程中。其中，超声波辅助提取的原理主要是利用超声波在液体中的空化作用加速被提取成分和溶剂的相互扩散，从而加速植物有效成分的浸出提取，因此应用比较广泛。
1 材料和方法
1.1 材料、试剂及仪器
1.1.1 材料与试剂
新鲜苦丁茶嫩叶：采集于广西大新县龙门乡；芦丁对照品：上海如吉生物科技发展有限公司；95%乙醇：天津市北联精细化学品开发有限公司；硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠：成都市科龙化工试剂厂。以上试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器
CLF-02型封闭粉碎机：中国浙江温岭市创力药材器械厂；722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司；KQ5200E型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；AR124CN电子天平：奥豪斯仪器有限公司制造；Φ300国家标准筛：新乡市大汉振动机械有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 苦丁茶原材料预处理
将采摘到的苦丁茶树叶清洗干净，用剪刀剪成碎片，放入鼓风干燥箱中，60℃烘干，置于高速粉碎机中粉碎，得到苦丁茶粉末，过60目筛，用塑料袋密封包装好，放入装有蓝色硅胶的干燥器中备用。
1.2.2 总黄酮的定性检验
1）Fe3+反应：取苦丁茶提取液2.0 mL于试管中，加1滴FeCl3溶液反应，振荡。当提取液表现出墨绿色，则证实其中含有黄酮。
2）HCl-Zn反应：取苦丁茶提取液2.0 mL于试管中，先添加少量锌粉，接着加4滴浓盐酸进行反应，振荡。当提取液表现出亮黄色，则证实其中含有黄酮。
3）NaOH反应：取苦丁茶提取液2.0 mL于试管中，加4滴4%的NaOH进行反应，振荡。当提取液表现出橙红色，则证实其中含有黄酮[14]。
4）Al（NO3）4反应：取苦丁茶提取液2.0 mL于试管中，加4滴10%的Al（NO3）3溶液，振荡。当提取液呈黄色，则证实其中含有黄酮。
1.2.3 标准曲线的绘制
1）标准溶液的配制：精准称取40.0 mg芦丁标准品于100 mL烧杯中，加入适量60%的乙醇溶液溶解，待完全溶解后移入100 mL容量瓶中，再用60%乙醇溶液定容至刻线，摇匀，得到质量浓度为400 μg/mL的芦丁标准使用液。
2）检测波长的选择：精确量取芦丁标准使用液1 mL于25 mL具塞比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min，然后加入4%的氢氧化钠溶液10.0 mL，用60%的乙醇溶液稀释至刻线，摇匀，静置15 min，用1 cm玻璃比色皿，测定溶液在400 nm～900 nm的吸收光谱，测得最大吸收波长为510 nm，作为检测波长。
3）标准曲线的绘制：用移液管分别吸取芦丁标准使用液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 25 mL 具塞比色管中，依次加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液 1.0 mL，摇匀，静置6 min，然后加入4%的氢氧化钠溶液10.0 mL，用60%的乙醇溶液稀释至刻线，摇匀，芦丁标准溶液系列的浓度分别为：0.00、16.00、32.00、48.00、64.00、80.00 μg/mL，同时做空白试验作为参比。静置15 min，用1 cm玻璃比色皿在波长510 nm处分别测定吸光度，以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，用excel软件拟合标准曲线，得到回归方程为A=0.013 2 C-0.005 2，R2=0.999 2。
1.2.4 苦丁茶总黄酮的提取及测定
准确称取1.00 g苦丁茶粉末于100 mL的干燥锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液为提取剂，放入设定温度的超声波清洗仪中冷凝回流提取，提取结束后，迅速抽滤，并用少量60%的乙醇溶液洗涤3次，将滤液全部转移至50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀释定容到刻度线，摇匀，用移液管准确移取1.0 mL于25 mL比色管中，同时做试剂空白，以试剂空白为参比，按照1.2.3芦丁标准曲线的测定方法测定溶液吸光度。
1.2.5 苦丁茶黄酮提取率的计算
将测定的溶液的吸光度代入1.2.3标准曲线方程A=0.013 2C-0.005 2，求算出浓度C，提取率计算如下式：
式中：w为苦丁茶总黄酮的提取率，%；C为总黄酮的质量浓度，μg/mL；V为溶液的体积，mL；N为溶液的稀释倍数；m为称取苦丁茶粉末的质量，g。
1.2.6 单因素试验设计
在苦丁茶粉末称样量固定为1 g的情况下，考察分析料液比、乙醇浓度、超声温度、超声时间4个单因素对苦丁茶总黄酮提取率的影响。每组单因素试验只保持1个因素改变，其它3个因素不变，研究4个单因素对苦丁茶总黄酮提取率的影响。
1.2.7 正交试验设计
根据单因素的试验结果，以料液比、乙醇浓度、超声温度、超声时间4个条件为因素，每个因素选取3个水平，因素水平表如表1。以总黄酮的提取率为考察指标，采用L9（34）正交试验表设计正交试验。
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
水平 A料液比/（g/mL）B乙醇浓度/%C超声时间/min D超声温度/℃1 1∶15 50 15 35 2 1∶20 60 20 50 3 1∶25 70 25 65
1.3 数据处理
试验数据采用Excel软件进行数据统计和结果分析。
2 结果与分析
2.1 定性检验结果
按照1.2.2操作，对苦丁茶提取液中黄酮类化合物进行鉴定，结果见表2。
表2 苦丁茶提取液中黄酮类化合物的显色鉴定
Table 2 The color identification of flavonoids in the extract of Kuding tea
试剂Fe3+HCl-ZnNaOHAl（NO3）3显色现象 墨绿色 亮黄色 橙红色 黄色
由表2说明，通过显色反应鉴定，表明提取液中含有黄酮类化合物。
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对总黄酮提取率的影响
不同料液比对苦丁茶总黄酮提取率的影响如图1。
由图1可看出，当料液比处于1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）之间时，随着提取剂用量增多，苦丁茶总黄酮提取率不断增大，在料液比为1∶20（g/mL）时达到最大值，随着提取剂用量的继续增多，在料液比为1∶20（g/mL）～1 ∶30（g/mL）范围内，提取率随提取剂用量的增多呈现出下降趋势。说明当提取剂用量太少时，不足以完全浸渍苦丁茶粉末样品，也无法渗入粉末颗粒内部，因此随着提取剂用量增多，浸润和渗入的更彻底，溶出的总黄酮就越多，当提取剂的用量能够完全浸润苦丁茶粉末并渗入粉末内部溶出样品中的绝大部分黄酮时，提取率达到最高，继续增加提取剂的用量，可能会溶出一些影响黄酮显色反应及吸光度测定的杂质，或者造成已经溶出的黄酮的变性，且过多的使用提取剂，会造成溶剂与能源的浪费，综合考虑，选择料液比1∶20（g/mL）时为最佳。
图1 料液比对总黄酮提取率的影响
Fig.1 The effect of liquid-material ratio on extraction
2.2.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
不同浓度的乙醇溶液提取剂对苦丁茶总黄酮提取率的影响如图2。
图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction
由图2可看出，苦丁茶总黄酮提取率随乙醇浓度的增大先增后降。当乙醇浓度较小时，黄酮溶解于提取剂中的溶解推动力较小，溶解速率较慢，总黄酮提取率随着提取剂中乙醇浓度的增加而增大。当乙醇浓度为60%时，总黄酮提取率达到最大值，乙醇浓度超过60%以后，总黄酮的提取率随着乙醇浓度增大出现降低的情况，可能原因是高浓度的乙醇溶解出了苦丁茶粉末中更多的物质，其中一些物质影响了黄酮的显色反应，造成了吸光度降低。因此，选择乙醇浓度60%为最佳。
2.2.3 超声时间对提取率的影响
超声时间对苦丁茶总黄酮提取率的影响如图3。
由图3可知，在10 min～20 min时，总黄酮提取率随着超声时间的延长而增大，20 min时达到最大值，随后其随时间的增加而下降。当超声时间较短时，黄酮类化合物未能于提取剂中充分析出，故其提取量不高。随着超声时间延长，黄酮类化合物析出不断增多，故提取率逐渐增大。但当超声波作用时间过长时，使得提取率逐渐趋于极限，同时具有抗氧化性的黄酮类化合物由于长时间暴露在外，容易被氧化分解破坏，导致提取物中杂质增多，所以20 min后，其提取率降低。故从总黄酮提取率、节约时间等方面综合考虑，超声时间选取20 min最佳。
图3 超声时间对总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on extraction
2.2.4 超声温度对提取率的影响
超声温度对苦丁茶总黄酮提取率的影响如图4。
图4 超声温度对总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of temperature on extraction
由图4可知，总黄酮的提取率随着超声温度的不断升高而逐渐增大，在35℃～50℃时增长速度最快，而后随着温度升高逐渐趋于平稳。形成这样的原因可能是，温度对溶质的溶出都有促进作用，温度越高，分子热运动速度越快，降低提取剂的黏滞性，使得扩散系数变大，总黄酮提取量则增加，随着温度持续升高到80℃，总黄酮提取率并没有降低，说明苦丁茶总黄酮在该温度区间比较稳定，并没有被破坏。因温度过高会增加提取剂的挥发损失且增大了能耗，选取的超声温度为50℃为最佳温度。
2.3 正交试验
2.3.1 正交试验结果与分析
依据2.2单因素所得出的试验结果及所做出的分析，以总黄酮提取率为考察指标，按1.2的试验操作进行正交试验，正交试验的设计及结果见表3。
表3 L9（34）正交试验结果
Table 3The results of L9（34）orthogonal experiment
试验序号 A B C D 总黄酮提取率/%1 1 1 1 1 0.691 2 1 2 2 2 0.685 3 1 3 3 3 0.702 4 2 1 2 3 0.706 5 2 2 3 1 0.676 6 2 3 1 2 0.753 7 3 1 3 2 0.756 8 3 2 1 1 0.73 9 3 3 2 3 0.761 K1 2.078 2.153 2.174 2.097 K2 2.135 2.091 2.152 2.194 K3 2.247 2.216 2.134 2.169 R 0.169 0.125 0.04 0.097优水平 A3 B3 C1 D2
根据表3可以看出，本试验中A、B、C、D4个因素的主次关系是 A＞B＞D＞C，即 A（料液比）>B（乙醇浓度）>D（超声时间）>C（超声温度）。可以从正交试验中看出，用超声波辅助提取法从苦丁茶中提取总黄酮最优的条件组合为A3B3C1D2，故最后可以确认的最佳提取工艺为：料液比1∶25（g/mL），乙醇浓度70%，超声时间15 min，超声温度50℃。
2.3.2 最优条件验证试验
以正交试验得出最佳工艺的条件为试验条件，进行验证性试验，结果见表4。
表4 最佳工艺验证性试验结果
Table 4 The results of replication experiment about optimum process
总黄酮提取率/% 总黄酮平均提取率/% 相对标准偏差/%0.771 0.772 0.12 0.773 0.773
从表4中可以看出，在最佳提取条件下试验3次，苦丁茶总黄酮的提取率平均值为0.772%，3次平行试验的相对标准差为0.12%。
3 结论
采用超声波辅助提取大新苦丁茶中的总黄酮，分析料液比、乙醇浓度、超声时间和超声温度4个单因素对总黄酮提取率影响。通过正交设计试验得到了超声波辅助提取苦丁茶总黄酮的最佳条件为料液比1 ∶25（g/mL），乙醇浓度 70%，超声时间 15 min，超声温度50℃。在最佳提取条件下，得到的总黄酮的得率为0.772%。
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