桑葚是桑科落叶乔木桑树（Morus alba L.）的果实，俗称桑果、桑枣，是我国传统的药食同源植物[1]，含有丰富的花色苷、多糖、有机酸等生物活性成分[2]，具有黑发明目、补益肝肾、提升人体免疫力、延缓机体衰老、降低血糖血脂、预防人体动脉硬化、骨骼关节硬化以及促进新陈代谢等保健功效，被誉为“二十一世纪的最佳保健圣果”[3-4]。
花色苷是一类具有苯并吡喃结构的天然水溶性色素，广泛存在于有色植物果实、花朵及子叶中[4-5]，可赋予果蔬、花卉等植物蓝色、红色和紫色，因其独特的结构[6]使其具有抗炎[7]、抗肿瘤[8]、降血糖[9]、保护神经细胞[10]、降血脂[11]等生物学功效。花色苷是桑葚中主要的食品功能因子，提取方法主要有热浸提法[12]、超声波辅助法[13]、微波辅助法[14]、酶提取法[15]、超临界萃取法[16]、超高压辅助提取[17-18]等。其中，超高压辅助提取技术（ultra-high pressure-assisted extraction，UHP）是利用水或其它流体为媒介，将样品在100 MPa以上压力下保持一定时间，促使细胞壁结构破坏、目标产物充分释放的一种新型提取技术[19]。与其它提取技术相比，超高压处理时提供给物料的能量相对较低，一般只破坏对生物大分子立体结构有贡献的氢键、离子键、疏水键等非共价键，而对共价键没有影响，具有能耗低、效率高、对生物活性物质影响小等优点[19-20]，目前已被应用于多酚[21]、多糖[22]、黄酮等物质的提取，但是超高压辅助提取桑葚花色苷的研究仍鲜见报道。
本研究以桑葚为原料，花色苷得率为评价指标，在单因素试验基础上通过响应面试验优化超高压辅助提取桑葚花色苷的工艺条件，并评价其体外抗氧化活性，为桑葚及天然色素的深度开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑葚：句容万山红遍生物科技有限公司。
DPPH、抗坏血酸（VC）：上海源叶生物科技有限公司；浓盐酸、三氯乙酸、铁氰化钾、氯化钾、过氧化氢（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；乙醇、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
MJ-PB40E253C多功能榨汁机：美的集团股份有限公司；D-Epoch全自动酶标仪：Bio Tek公司；PL303电子天平、FE-20实验室pH计：梅特勒托利多（上海）有限公司；D-8紫外可见分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；HPP600MPa超高压食品处理装置：包头科发高压科技有限责任公司；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 桑葚花色苷的提取
取解冻打浆后的桑葚果浆10.00 g，按照一定的液料比与一定浓度的酸化乙醇溶液（1mol/LHCl调节pH 3）混合均匀，无损转移于聚乙烯袋，充分混匀后封口，置于超高压食品处理装置中处理，提取结束后，将样品置于离心机中以4 500 r/min离心，收集上清液，即为花色苷提取液。
1.3.2 单因素试验设计
准确称取桑葚果浆10.00 g，无损转移至聚乙烯塑料袋中，加入酸化乙醇溶液（pH 3），混匀后封口，置于超高压食品处理装置中室温（25℃）保压处理10 min，分别考察液料比[6 ∶1、9 ∶1、12 ∶1、15 ∶1、18 ∶1（mL/g）]、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取压力（100、200、300、400、500 MPa）对花色苷得率的影响。
1.3.3 响应面优化试验
根据单因素试验结果，以乙醇浓度（A）、提取压力（B）、液料比（C）为试验因素，以桑葚花色苷得率为响应值（Y），采用Box-Behnken中心组合设计，根据Design-Expert 8.06软件优化超高压辅助提取桑葚花色苷的工艺条件。试验因素与水平编码表见表1。
表1 因素及水平编码
Table 1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design
水平 因素A乙醇浓度/%B提取压力/MPaC液料比/（mL/g）-1 60 300 9∶1 0 70 400 12∶1 1 80 500 15∶1
1.3.4 桑葚花色苷热提取法
参考文献[12]，准确称取10.00 g桑葚果浆于聚乙烯袋中，按照液料比15∶1（mL/g）加入60%乙醇溶液，封口，40℃水浴60 min，提取结束后，将样品置于离心机中以4 500 r/min离心，收集上清液，将热提取得到的花色苷得率与超高压辅助提取得到的花色苷得率进行比较。
1.3.5 桑葚花色苷得率的测定
采用pH值示差法测定桑葚花色苷含量[23]，取1.0mL样品液，分别加入9.0 mL pH 1.0的KCl缓冲液与pH 4.5的乙酸钠缓冲液，摇匀、避光静置60 min，分别在520、700 nm处测定吸光值，按照公式（1）计算花色苷得率 Y（mg/g）。
式中：A1为样品中加入pH 1.0的KCl缓冲液时在520 nm与700 nm处测得的吸光度差值；A2为样品中加入pH 4.5的乙酸钠缓冲液时在520 nm与700 nm处测得的吸光度差值；Mr为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2 g/mol；DF为稀释倍数；V为总体积，mL；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；1为比色皿光程，cm；m 为样品质量，g。
1.3.6 体外抗氧化能力的测定
1.3.6.1 DPPH·清除能力的测定
参考文献[24]，准确配制终浓度为0.6 mmol/L的DPPH乙醇溶液。将2 mL DPPH溶液与1 mL不同浓度桑葚花色苷溶液（0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6 mg/mL）混合均匀，避光反应30 min，以同浓度的VC溶液作阳性对照，在517 nm处测定混合液的吸光度A，按照公式（2）计算DPPH自由基清除率。
式中：A1为2 mL DPPH溶液与1 mL样品液的吸光度；A2为2 mL无水乙醇与1 mL样品液的吸光度；A0为2 mL DPPH溶液与1 mL无水乙醇的吸光度。
1.3.6.2 羟自由基清除能力的测定
参考文献[25]，稍作修改，配制2 mg/mL硫酸亚铁溶液，取硫酸亚铁溶液1 mL，依次加入1.5 mg/mL水杨酸-乙醇溶液1 mL、不同浓度的花色苷样品溶液（0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）1 mL、1% 的过氧化氢1 mL，混合均匀，37℃保温1 h，于526 nm波长处测定其吸光度，以VC为阳性对照，按公式（3）计算羟自由基清除率。
式中：A1为样品吸光度；A2为无水乙醇溶液代替水杨酸-乙醇溶液的吸光度；A0为蒸馏水代替样品溶液的吸光度。
1.3.6.3 铁离子还原力测定
参考文献[26]，以VC为阳性对照，取1 mL不同浓度的样品液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，混合均匀后于50℃水浴中保持20 min，迅速冷却后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，充分混匀后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%的氯化铁溶液，通过测定700 nm处的吸光度，分析铁离子还原力的强弱，吸光度越高表明还原能力越强。
1.4 数据处理
所有试验重复3次，试验数据采用Excel 2010软件进行处理，Design-Expert 8.0.6进行响应面设计。
2 结果与分析
2.1 提取工艺单因素试验结果
2.1.1 提取压力对桑葚花色苷得率的影响
在液料比为 9 ∶1（mL/g）、保压时间为 10 min、乙醇浓度为70%（pH 3）条件下，考察提取压力对花色苷得率的影响，结果见图1。
图1 提取压力对桑葚花色苷得率的影响
Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of anthocyanins of mulberry
由图1可知，压力在100 MPa～400 MPa范围内，桑葚花色苷得率随着压力的增大而升高。这是由于压力的增大不仅可以改变细胞膜的构象，使得细胞膜的通透性增加，传质阻力降低，而且还能增大细胞内外的渗透压差，提高提取液对花色苷的浸润速率，进而促进了花色苷得率的提高[27]；当压力达400 MPa时，花色苷得率最高为（1.87±0.04）mg/g，此时花色苷已经充分溶出，继续增大提取压力，花色苷得率趋于稳定。
2.1.2 液料比对桑葚花色苷得率的影响
在提取压力300 MPa、保压时间10 min、乙醇浓度70%（pH 3）条件下，考察液料比对桑葚花色苷得率的影响，结果见图2。
图2 液料比对桑葚花色苷得率的影响
Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the yield of anthocyanins of mulberry
由图 2 可知，液料比在 6 ∶1（mL/g）～12 ∶1（mL/g）范围内，桑葚花色苷得率随溶剂体积的增加而提高，液料比为 12 ∶1（mL/g）时，花色苷得率最高（1.63±0.02）mg/g，之后花色苷得率趋于稳定。在提取过程中，提取液中的花色苷浓度逐渐提高，且液料比越大，二者浓度梯度越大，扩散速率越快，越有利于有效成分的溶出[27]。但进一步提高液料比会因提取液中的花色苷浓度变化较小而趋于平缓，而且还会增大后续浓缩的难度[28]。
2.1.3 乙醇浓度对桑葚花色苷得率的影响
在液料比 9 ∶1（mL/g）、提取压力 300 MPa、保压时间10 min条件下，考察乙醇浓度对花色苷得率的影响，结果见图3。
图3 乙醇浓度对桑葚花色苷得率的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanins of mulberry
由图3可知，桑葚花色苷得率随着乙醇浓度的提高呈现先增大后减小的趋势。当乙醇浓度为70%时，花色苷得率最高（1.53±0.03）mg/g。可见较高浓度的乙醇溶液有利于花色苷的溶出；当乙醇浓度高于70%时，花色苷得率反而降低。这是由于一方面醇溶性、亲脂性等杂质的溶出量增大，与花色苷形成竞争，使花色苷得率降低；另一方面，较高浓度的乙醇溶液也可能会使细胞中的蛋白质变性凝固堵塞组织微孔，阻碍花色苷的溶出[29-30]。
2.2 桑葚花色苷提取条件的响应面优化结果与分析
2.2.1 响应面试验设计及结果分析
在单因素试验基础上，应用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken进行试验设计，以乙醇浓度（A）、提取压力（B）、液料比（C）3个因素为自变量，以花色苷得率（Y）为因变量，优化超高压辅助提取桑葚花色苷的提取条件，其试验设计与结果见表2。方差分析结果见表3。
表2 响应面试验设计及试验结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
因素 得率/（mg/g）试验序号 A乙醇浓度 B提取压力 C液料比1-1 -1 0 1.41 2 0 1-1 1.74 3-1 0 1 1.76 4 1 1 0 1.86 5-1 -1 1.52 6 1 0 1 1.87 0 7 1.82 8 0-1 1 1.53 0 1 1 1.95 10 1 -1 0 1.64 11 0 0 0 1.96 12 0 0 0 1.96 13 -1 1 0 1.77 14 -1 0 -1 1.66 15 1 0 -1 1.85 9 0 0 0
表3 模型和回归系数显著性检验
Table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性模型 0.41 9.00 0.05 268.18 <0.000 1 **A 0.048 1.00 0.05 285.45 <0.000 1 **B 0.15 1.00 0.15 882.25 <0.000 1 **C 5.51×10-3 1.00 0.01 32.75 0.002 3 **AB 4.90×10-3 1.00 0.00 29.11 0.003 *AC 1.60×10-3 1.00 0.00 9.5 0.027 4 *BC 1.23×10-3 1.00 0.00 7.28 0.042 9 *A2 0.022 1.00 0.02 130.33 <0.000 1 **B2 0.16 1.00 0.16 963.48 <0.000 1 **C2 0.033 1.00 0.03 196.23 <0.000 1 **残差 8.42×10-4 5.00 0.00失拟项 7.75×10-4 3.00 0.00 7.75 0.116 4 N纯误差 6.67×10-5 2 3.33×10-5总和 0.41 14
续表3 模型和回归系数显著性检验
Continue table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients
注：* 表示 p＜0.05，差异显著；** 表示 p＜0.01，差异极显著；N 表示 p＞0.05，差异不显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性R2 0.997 9 R2Adj 0.994 2 R2pred 0.969 2 CV 0.74%
采用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行多元回归拟合分析，得到桑葚花色苷得率Y对各因素二次回归方程为：Y=0.077A+0.14B+0.026C-0.035AB-0.020AC+0.018BC-0.077A2-0.21B2-0.095C2+1.96。
由表3可知，模型极显著（p＜0.000 1），失拟项不显著（p=0.116 4＞0.05），模型决定系数 R2=0.997 9，调整决定系数R2Adj=0.994 2。表明模型与试验值拟合性良好，试验误差较小，试验精密度高，各因素与桑葚花色苷得率之间具有高度相关性[31]，可以对桑葚花色苷得率进行准确预测和分析。由表3还可知，3个因素对响应值的影响程度大小依次为B＞A＞C，因素A、B、C对桑葚花色苷得率的影响极显著（p＜0.01），AB、AC、BC 以及 A2、B2、C2对花色苷得率的影响也显著（p＜0.05 或 p＜0.01）。
2.2.2 响应面分析与优化
各因素间交互作用对桑葚花色苷得率影响的响应面图见图4。
图 4显示，乙醇浓度（A）、提取压力（B）、液料比（C）3个因素中，任意2个因素交互作用的响应面都存在最高点，曲面越陡峭则表明因素对花色苷得率影响越大，反之则较小[32]。两因素间的响应面曲面坡度陡峭，表明其交互作用对桑葚花色苷得率的影响也较为显著。这与模型方程的各项方差分析结果一致。
图4 因素间交互作用对桑葚花色苷得率的影响
Fig.4 Effect of interaction between factors on the yield of anthocyanins of mulberry
2.2.3 验证试验
通过Design-Expert软件对回归方程进行优化，得到桑葚花色苷最佳提取条件为：乙醇浓度74.19%、提取压力 429.52 MPa、液料比 12.37 ∶1（mL/g），在此条件下桑葚花色苷得率的预测值为1.99 mg/g。为了方便操作，修正提取条件为：乙醇浓度75%、提取压力430 MPa、液料比12∶1（mL/g），在此条件下验证模型的有效性，并与传统热提取法进行比较，3次重复试验表明，传统热提取法所得桑葚花色苷得率为（1.37±0.03）mg/g，超高压辅助提取法所得花色苷实测值得率为（1.97±0.02）mg/g，与预测理论值接近，说明超高压辅助提取法显著优于传统热提取法，所得模型的拟合程度较好，可以较好地预测提取条件与桑葚花色苷得率的关系。
2.3 桑葚花色苷抗氧化活性分析
2.3.1 对DPPH自由基的清除作用
桑葚花色苷的DPPH自由基清除率如图5所示。
不同质量浓度的花色苷均具有一定的DPPH自由基清除能力，在0.01 mg/mL～0.10 mg/mL浓度范围内时，花色苷和VC的DPPH自由基清除率随着质量浓度的增加而增加，且花色苷的DPPH自由基清除率高于同浓度的VC，当花色苷质量浓度为0.10 mg/mL时，DPPH自由基清除率达（93.60±2.28）%，高于同浓度VC的DPPH自由基清除率（91.30±1.64）%；桑葚花色苷与VC质量浓度高于0.10 mg/mL时，二者对DPPH自由基的清除率趋于平缓。另外，VC的IC50为0.055 mg/mL，而桑葚花色苷的IC50为0.026 mg/mL，是VC的0.47倍，表明桑葚花色苷对DPPH自由基的清除能力优于VC。
图5 桑葚花色苷对DPPH自由基的清除率
Fig.5 DPPH radical scavenging rates of anthocyanins of mulberry
2.3.2 对羟自由基的清除作用
桑葚花色苷对羟自由基的清除能力见图6。
图6 桑葚花色苷对羟自由基的清除能力
Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of anthocyanins of mulberry
由图6可知，桑葚花色苷质量浓度对羟自由基清除能力呈现一定的量效关系。在0.02 mg/mL～0.2 mg/mL浓度范围内，桑葚花色苷对羟自由基的清除能力随着样品浓度的增大逐渐增强，且强于同浓度的VC；当桑葚花色苷与VC的质量浓度高于0.2 mg/mL时，花色苷对羟自由基的清除能力趋于平缓，而VC对羟自由基的清除能力继续增大，并且高于同浓度的桑葚花色苷。其中，VC的IC50为0.344 mg/mL，桑葚花色苷为0.406 mg/mL，是VC的1.18倍。当浓度为0.8 mg/mL时，桑葚花色苷对羟自由基的清除能力达到最大值为（51.12±1.85）%，低于同质量浓度VC对羟自由基的清除能力（63.68±1.12）%。因此，桑葚花色苷对羟自由基具有较强的清除能力。
2.3.3 铁离子还原力
桑葚花色苷对铁离子的还原能力见图7。
图7 桑葚花色苷对铁离子的还原能力
Fig.7 Reducing ability to iron ions of anthocyanins of mulberry
由图7可知，在所设质量浓度范围内，桑葚花色苷的还原力随着质量浓度的增大先增强后趋于平缓，且强于同浓度VC溶液的铁离子还原能力。当质量浓度为0.8 mg/mL时，吸光度从0.42±0.024升高到 1.72±0.035，与同质量浓度VC溶液的铁还原力1.48±0.031相比，提高了16.22%，表明桑葚花色苷对铁离子的还原能力明显高于阳性对照VC对铁离子的还原能力[33]。
3 结论
超高压辅助提取技术是近年快速发展的可用于活性物质提取的新技术，与热提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等相比，能够有效地避免因热效应引起的活性成分结构变化、损失以及生物活性的降低，也降低了传统提取时间过长而导致的热敏性物质的损失[34]。本研究以桑葚为原料，采用超高压辅助法提取桑葚中的花色苷，在单因素试验基础上通过响应面分析法，确定了超高压辅助提取桑葚花色苷的最佳工艺条件为：提取压力 430 MPa、液料比 12 ∶1（mL/g）、乙醇浓度75%，在此条件下桑葚花色苷得率为（1.97±0.02）mg/g。各因素对桑葚花色苷提取效果影响的主次顺序为：提取压力＞乙醇浓度＞液料比；与传统热提取法对比发现，超高压辅助提取花色苷得率提高了43.80%，时间缩短了6倍。体外抗氧化试验表明桑葚花色苷具有较强的抗氧化活性，在一定的浓度范围内，花色苷质量浓度与抗氧化活性呈现出良好的量效关系。其中，桑葚花色苷对DPPH自由基与羟基自由基的IC50分别为0.026、0.406 mg/mL，分别是VC的0.47倍、1.18倍。本研究结果为天然色素的高效提取提供了一种有效的手段，同时为开发具有功能活性的食品添加剂提供了理论基础。
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