畜禽骨作为肉制品加工行业的主要副产物，约占动物体重的20%～30%[1]。据统计，2018年我国肉类总产量为8 624.63万吨[2]，约产生1 725万吨～2 587万吨畜禽骨，这些畜禽骨处理不当将会给环境和经济带来巨大的负担。对畜禽骨进行适当的处理，生产增值的原料或产品，不仅提高了畜禽骨的价值，而且还避免了环境污染。但是，目前我国畜禽骨大多被丢弃或用于制骨汤或加工低价值产品（骨粉、骨泥等），深加工利用率很低[3]。因此，高价值利用畜禽骨成为当今主要的研究内容。
针对畜禽骨的研究主要集中在胶原蛋白和生物活性肽的提取工艺优化、产业化应用、功效研究，目的是将畜禽骨用作功能性食品、化妆品、生物医药等领域的高附加值原料。大量的研究表明，利用蛋白酶水解得到的畜禽骨生物活性肽具有多种生物活性功能，比如抗骨质疏松[4-5]、降血压[6-7]、抑菌[8-9]、抗疲劳[10-11]、抗氧化[12-13]和促进伤口愈合[14-15]等。我国是家驴主产国之一[16]，但是目前对畜禽骨开发集中在猪[17]、牛[18]、牦牛[19]、羊[20]、鹿[21]、鸡[22]等畜禽骨，对驴骨的开发利用研究较少。驴骨作为我国的传统药物有着广泛的药用记载，动物骨骼药效可能与所含有的骨胶原、软骨素等活性成分有关，为精准提取独特的驴骨生物活性肽，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF/MS）方法分析驴骨蛋白质组成，并通过基因本体论（gene ontology，GO）分类法对检测到的蛋白质进行归类，揭示驴骨蛋白生物学功能，为今后驴骨生物活性肽的提取及功能研究提供一定的理论依据和试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
驴骨：山东天龙驴产业研究院；乙腈、甲醇、甲酸（均为质谱纯）：百灵威科技有限公司；Tris-base：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、尿素、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、考马斯亮蓝R-250（生物级）、十二烷基硫酸钠：北京索莱宝科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；两性电解质缓冲液（Bio-Lyte 3-10，20%）、固相化pH梯度（immoblized pH gradients，IPG）胶条（ready strip，7 cm，pH 3-10）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）maker：美国Bio-Rad公司；测序级胰蛋白酶（70 U/mg蛋白）：普洛麦格（北京）生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
MALDI-TOF/TOF-MS质谱仪（Autoflex speed）：美国Bruker Daltonics公司；SDS-PAGE电泳仪（Mini Protean 3 Cell）、2-DE 电泳仪（Protean IEF cell）：美国 Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 驴骨素样品的制备
防疫检验、微生物检验合格的鲜骨，经破碎、蒸煮提取、过滤、浓缩、喷雾干燥后，制成驴骨素样品。精密称取制备的驴骨素粉末10.000 0 g，加入100 mL pH 8.0含100 mmol/L氯化钠的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，在80℃下浸提60 min，待样品冷却至室温25℃后，10 000 r/min离心30 min，取中间层澄清溶液，即为10%待测驴骨素溶液。
1.3.2 蛋白质特性的测定
1.3.2.1 BCA法测定蛋白质含量
按照BCA蛋白浓度测定试剂盒上的方法检测驴骨胶原蛋白的蛋白质含量。
1.3.2.2 SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量范围
根据帕尔哈提·柔孜等[23]的方法稍作修改。10%驴骨胶原蛋白溶液稀释10倍后，加入等量的含DTT的2×上样缓冲液，充分混匀，沸水浴5 min。浓缩胶质量分数为5%，分离胶12%。上样量为10 μL，将凝胶扫描电子图谱保存，电泳所用的marker分子量范围在10 kDa～250 kDa。
1.3.2.3 二维电泳分析蛋白质等电点范围
方法参考文献[24]，略有改动。200 μL 10%驴骨胶原蛋白溶液与800 μL的水化液混匀。取200 μL加载到电泳池，等点聚焦程序见表1。
表1 7 cm胶条的IEF程序
Table 1 IEF program for 7 cm latex
注：/为不需设置参数。
步骤 电压/V 状态 时间 目的水化 / / 12 h 被动水化S1 250 缓慢 25 min 除盐S2 1 000 快速 60 min 除盐S3 4 000 线性 3 h 升压S4 4 000 快速 24 000 Vh 聚焦S5 500 快速 任意时间 保持
等电聚焦后立即进行胶条平衡。平衡分两步，每次15 min，分别使用5 mL含1%DTT平衡液和5 mL含2.5%碘代乙酰胺平衡液。将平衡好的胶条放置于浓度为12%聚丙烯酰胺凝胶上，并用1%的琼脂糖固定胶条，进行第二向电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色后，以脱色液脱去背景颜色，使用凝胶成像设备扫描成电子图片保存。
1.3.3 蛋白质组成的分析
驴骨胶原蛋白经SDS-PAGE分离后，用考马斯亮蓝R-250染色，将条带对半切开，转移至EP管中。蛋白质的脱色酶切方法参考文献[25]。浓缩液与基质混合后，采用MALDI-TOF/TOF-MS分析。利用Mascot软件的SwissPort数据库进行搜索。检索分类（Taxonomy）为 Equus caballus，Mascot检索 p＜0.05 和 Mascot得分＞41分的结果被认为鉴定成功。
1.3.4 利用GO法对蛋白进行归类
通过GO法对以检测蛋白质分别以其分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞组成（cell component，CC）3 种方式进行归类，揭示驴骨素蛋白生物学功能。再对驴骨素蛋白进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，寻找驴骨素蛋白集中的生物学信号通路。
1.4 数据分析
以3次重复试验每次同时做平行试验所得的数据为结果，用均值表示。
2 结果与分析
2.1 蛋白质的基本性质
2.1.1 蛋白质含量的分析
利用BCA法测定驴骨素蛋白的蛋白质含量为47.82 g/100 g，小于刘楚怡等[26]报道的驴骨胶原蛋白含量57.3 g/100 g，可能是由于凯氏定氮法主要测定的是样品中总氮含量才导致的结果偏高。
2.1.2 蛋白质分子量的分布
利用SDS-PAGE凝胶电泳检测驴骨素蛋白的分子量分布见图1。
图1 驴骨胶原蛋白SDS-PAGE电泳图
Fig.1 SDS-PAGE of donkey bone extract
M为Marker；A为驴骨素。
由图1可知，驴骨素蛋白分子量在10 kDa～250 kDa之间呈弥散性分布，与马国霞等[27]、张崟等[28]报道的猪骨素蛋白电泳条带一致，可能是由于加工过程中蛋白质降解降解程度偏低，没有形成清晰的条带导致的。因驴骨素加工过程中一般使用高温蒸煮，导致蛋白质水解不彻底，使蛋白质分子呈弥散型。
2.1.3 蛋白质等电点
驴骨素的2-DE电泳结果如图2所示。
图2 驴骨素蛋白2-DE电泳结果
Fig.2 2-DE of donkey bone extract
由图2可知，水平方向为第一固相pH梯度等点聚焦，垂直向为第二向垂直板SDS-PAGE电泳，驴骨素蛋白的等电点主要集中在4.5～6.5之间，说明驴骨素蛋白结构中的酸性氨基酸及中性氨基酸较多。驴骨素也有微量蛋白质在碱性区域。
2.2 蛋白质组成的分析
利用SDS-PAGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法，总共鉴定出89种蛋白质，其中有21种未命名蛋白，剩余68种蛋白分析结果见表2。
表2 驴骨素蛋白质组分分析结果
Table 2 Analysis of components in donkey bone extract protein
蛋白质编号 蛋白名称 肽段个数 肽匹配图谱 氨基酸数量 分子量/kDa 等电点F7AAK7 肌动蛋白γ1 2 2 375 41.8 5.48 F7A5E3 肌动蛋白γ1 1 1 217 24.3 5.97 F7CW82 平滑肌肌动蛋白α2 2 2 377 42 5.39 F7CZ92 骨骼肌肌动蛋白α 2 2 377 42 5.39 F6R1X9 心肌肌动蛋白ɑ1 2 2 377 42 5.39 F7AHF3 肌动蛋白，β样2 1 1 376 41.9 5.48 P60708 肌动蛋白，细胞质1 2 2 375 41.7 5.48 F6T3Y8 肌动蛋白，细胞质1 1 1 365 40.6 5.83 K9KF76 肌动蛋白，细胞质1样蛋白 1 1 163 18.2 5.59 F6Z8K0 平滑肌肌动蛋白γ2 2 2 376 41.9 5.48 K9K3B5 肌动蛋白，γ肠平滑肌样蛋白 1 1 326 36.7 5.68 P08334 α-乳清蛋白A 2 5 123 14.2 5.12 P08896 α-乳清蛋白B 1 2 123 14.2 5.12 P02758 β-乳球蛋白-1 4 25 180 20.3 5.05 F6TZ87 钙调蛋白2 1 1 149 16.8 4.22 K9K252 钙调蛋白样蛋白（片段） 1 1 139 15.6 4.21 L7MRJ5 钙调蛋白样蛋白 1 1 149 16.9 4.27 F6RLT8 小亚基钙蛋白酶1 1 1 265 28.1 5.3 Q95MC4 心脏α肌动蛋白（片段） 1 1 75 8.2 4.78 F7A3F7 Ⅰ型胶原蛋白α1链 13 66 1455 140.6 5.66 F7D9C7 Ⅰ型胶原蛋白α1链 13 66 1448 140 6.18 F7D939 Ⅰ型胶原蛋白α1链 13 66 1448 139.9 7.27 F6VUP8 Ⅰ型胶原蛋白α1链 13 66 1449 140.1 6.09 F6SSG3 Ⅰ型胶原蛋白α1链 13 66 1424 137.3 8.25 F6RVX8 Ⅰ型胶原蛋白α1链 13 66 1432 138 8.27 F6RTH9 Ⅰ型胶原蛋白α2链 15 48 1357 128 9.03 F6RUA6 Ⅰ型胶原蛋白α2链 15 48 1364 128.6 9.03 F6RTN7 Ⅰ型胶原蛋白α2链 15 48 1364 128.7 8.98 F6RTJ6 Ⅰ型胶原蛋白α2链 15 48 1359 128.3 9.09 F6RTL6 Ⅰ型胶原蛋白α2链 15 48 1364 128.8 9.19 F6RTP3 Ⅰ型胶原蛋白α2链 15 48 1364 128.7 9.04 F6RTI8 Ⅰ型胶原蛋白α2链 15 48 1357 128 8.97 F6R4Y3 Ⅲ型胶原蛋白α1链 1 1 1485 140.6 7.4 F6R528 Ⅲ型胶原蛋白α1链 1 1 1489 140.9 7.14 F7BH47 Ⅴ型胶原蛋白α2链 2 4 1499 145 6.61 O46542 核心蛋白聚糖 1 1 360 39.9 8.53
续表2 驴骨素蛋白质组分分析结果
Continue table 2 Analysis of components in donkey bone extract protein
蛋白质编号 蛋白名称 肽段个数 肽匹配图谱 氨基酸数量 分子量/kDa 等电点F6RDD3 珠蛋白A1 1 1 147 16.1 7.02 P02062 血红蛋白亚单位β 1 1 146 16 7.02 F6YXV8 组蛋白H3 1 1 136 15.3 11.27 F7B238 组蛋白H3 1 1 136 15.5 11.12 F6Y7V5 组蛋白H3 1 1 136 15.4 11.12 F6VCB4 组蛋白H3 1 1 122 13.9 10.98 F7C964 组蛋白H3 1 1 136 15.4 11.27 F7BVE2 组蛋白H3 1 1 129 14.6 10.84 F7B7X0 角蛋白1 5 9 639 66.1 8.07 F6PJX6 角蛋白13 1 1 308 35.6 4.72 F7ATL5 角蛋白14 2 3 354 41 4.97 F6ZEQ3 角蛋白16 2 3 466 50.8 4.97 F6VE52 角蛋白3 2 2 624 63.7 6.95 F6W7V0 角蛋白5 4 6 593 62.4 7.81 F6S8W6 角蛋白75 1 1 549 59.2 8.22 F7C210 角蛋白76 1 1 640 65.8 8.9 F6WGX6 角蛋白77 2 3 586 63 8.69 F6XWG3 角蛋白79 2 3 535 57.8 7.77 F6V8C8 α-乳清蛋白 2 5 143 16.3 5.54 F6ZNI2 Ladybird homeobox 1 1 1 279 30 6.27 A0A077S9Q8 溶菌酶G 2 5 142 16.2 5.27 F6QRL2 PBX homeobox 2 1 1 429 45.6 7.59 P00559 磷酸甘油酸激酶1 1 34 417 44.6 8.41 F7D1R1 磷酸甘油酸激酶 1 34 396 42.2 7.37 K9K451 磷酸甘油酸激酶 1 34 417 44.6 8.28 O46388 前Ⅰ型胶原α1链（片段） 2 20 343 33.4 5.19 P35747 血清白蛋白 1 1 607 68.6 6.34 F7BAY6 血清白蛋白 1 1 607 68.3 6.13 F6S2R5 信号识别粒子亚基SRP68 1 3 623 70.3 8.47 K7THJ6 骨骼肌α-肌动蛋白1 1 1 171 19.3 5.39 F6XAC0 转录接头 1 1 401 46.2 8.47 Q28396 Ⅱ型胶原 6 18 1418 134.3 8.37
2.3 蛋白质GO分类和KEGG通路分析结果
利用在线生物信息数据库DAVID（http：//david.ncifcrf.gov，6.7版本）对驴骨素所含有的89种蛋白进行GO分类，结果见图3。
从细胞组成分析可知，驴骨素蛋白参与的细胞组分主要是角蛋白纤维（GO：0045095）、外泌体（GO：0070062）、血液微粒（GO：0072562）、胶原三聚体（GO：0005581）、细胞体 （GO：0044297）、丝状体（GO：0030175）、核小体（GO：0000786）、细胞周边（GO：0071944）、蛋白质细胞外基质（GO：0005578）、细胞核（GO：0005634）、片状伪足（GO：0030027）、细胞外区域（GO：0005615）、核小体（GO：0000788）、I型胶原三聚体（GO：0005584）、致密体（GO：0097433）、肌节（GO：0030017）、钙通道复合体（GO：0034704）。
驴骨素蛋白参与的生物过程主要包括间充质迁移（GO：0090131）、胶原原纤维组织（GO：0030199）、氨基酸刺激的细胞反应（GO：0071230）、核小体组装（GO：0006334）、视网膜稳态（GO：0001895）、基因表达的正调控（GO：0010628）、环核苷酸磷酸二酯酶活性的正调控（GO：0051343）、环核苷酸代谢过程的正调控（GO：0030801）、软骨内骨形态发生中的软骨发育（GO：0060351）、丹参碱敏感性钙释放通道活性的正向调控（GO：0060316）、骨骼肌细丝组件（GO：0030240）、毛发周期（GO：0042633）、中间丝细胞骨架组织（GO：0045104）、角化作用（GO：0031424）、皮肤形态发生（GO：0043589）、内质网调节螯合钙离子向细胞质释放（GO：0010880）、钙离子的识别（GO：0005513）、衰老（GO：0007568）、磷蛋白磷酸酶活性的正向调节（GO：0032516）、蛋白质异源三聚（GO：0070208）等。
图3 驴骨素蛋白GO分类结果
Fig.3 GO classification of protein in donkey bone extract
驴骨素蛋白参与的生物过程分子功能主要是结构分子活性（GO：0005198）、核小体DNA结合（GO：0031492）、细胞外基质结构成分（GO：0005201）、蛋白磷酸酶激活剂活性（GO：0072542）和氧结合（GO：0019825）。
对驴骨素蛋白进行KEGG的生物通路富集分析，以推断它们参与的信号通路，结果见图4。
图4 驴骨素蛋白KEGG生物通路富集分析结果
Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of protein in donkey bone extract
驴骨素蛋白主要参与信号通路包括血小板激活（ecb04611）、黏附斑（ecb04510）、酒精中毒（ecb05034）、蛋白质的消化与吸收（ecb04974）、ECM受体相互作用（ecb04512）、阿米巴病（ecb05146）、系统性红斑狼疮（ecb05322）、血管平滑肌收缩（ecb04270）、催产素信号通路（ecb04921）、癌症中的转录失调（ecb05202）、PI3KAkt信号通路（ecb04151）、肥厚性心肌病（ecb05410）、Rap1信号通路（ecb04015）和扩张型心肌病（ecb05414）。其中，PI3K-Akt信号通路是胰岛素发挥代谢调节作用的主要信号转导途径，其任何一个环节异常均会干扰胰岛素的生理功能，进而导致2型糖尿病及其并发症的发生[29]。相关研究也证实[30]，Rap1信号通路参与糖尿病肾病的发生。这些研究成果从分子生物学角度解释了《本草纲目》中关于驴骨“牝驴骨煮汁服，治多年消渴，极效”的记载。
3 结论
本文旨在研究驴骨素蛋白质的性质和组成，为提取具有特征生理活性的驴骨生物活性肽提供理论依据。采用SDS-PAGE、二维电泳和MALDI-TOF/TOF/MS等手段揭示驴骨素蛋白的性质与组成，并通过GO分类法对检测到的蛋白质进行分类，同时，对驴骨素蛋白进行KEGG信号通路富集分析。研究表明，驴乳粉蛋白质的含量为47.82 g/100 g，分子量在10 kDa～250 kDa间呈弥散型分布，等电点均匀分布在4.5～6.5之间。通过与马科蛋白图库进行对比，共识别出89种蛋白。利用GO分类法对89种蛋白质进行分类，发现驴骨素蛋白主要参与构成的细胞组分包括角蛋白纤维、外泌体、血液微粒、胶原三聚体、细胞体、丝状体等，参与的生物过程主要包括间充质迁移、胶原原纤维组织、氨基酸刺激的细胞反应、核小体组装、视网膜稳态、基因表达的正调控、软骨内骨形态发生中的软骨发育等，参与的分子功能包括结构分子活性、核小体DNA结合、细胞外基质结构成分、蛋白磷酸酶激活剂活性和氧结合。KEGG的生物通路富集分析结果显示驴骨素蛋白主要参与了血小板激活、黏附斑、蛋白质的消化与吸收等14条信号通路，其中PI3K-Akt信号通路和Rap1信号通路的识别从分子机制角度解释了驴骨治疗糖尿病的可能机制。这些研究成果为驴骨素生物活性肽的提取和功能研究提供了一定的理论依据和试验基础。
[1]杨巍,成晓瑜,陈文华,等.畜禽骨深加工技术与应用现状[J].肉类研究,2009（11）:75-79.
[2]中华人民共和国国家统计局.中国统计年鉴[M].北京:中国统计出版社,2019:12-14.
[3]ZHOU Xiaocui,JIN Guofeng,JIN Yongguo,et al.Current status and progress of studies on protein hydrolysis of livestock and poultry bones and peptide chelated calcium[J].Meat Research,2015,29（8）:31-36.
[4]Zhu L Y,Xie Y Y,Wen B T,et al.Porcine bone collagen peptides promote osteoblast proliferation and differentiation by activating the PI3K/Akt signaling pathway[J].Journal of Functional Foods,2020,64:103697.
[5]安丽萍,任广凯,石力强,等.鹿骨多肽对地塞米松诱导的骨质疏松大鼠骨微结构的影响[J].中草药,2016,47（22）:4030-4034.
[6]Jung W K,Mendis E,Je J Y,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from yellowfin sole（Limanda aspera）frame protein and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J].Food Chemistry,2006,94（1）:26-32.
[7]Nakade K,Kamishima R,Inoue Y,et al.Identification of an antihypertensive peptide derived from chicken bone extract[J].Animal Science Journal,2008,79（6）:710-715.
[8]张顺亮,成晓瑜,潘晓倩,等.牛骨胶原蛋白抑菌肽的制备及其抑菌活性[J].肉类研究,2012,26（10）:5-8.
[9]张顺亮,潘晓倩,成晓瑜,等.牛骨胶原蛋白源抑菌肽的分离纯化及成分分析[J].肉类研究,2013,27（11）:33-36.
[10]缪福俊,熊智,吴本行,等.驴骨蛋白多肽对小白鼠抗疲劳作用的研究[J].食品工业科技,2011,32（11）:411-413.
[11]国肽生物工程（常德）有限公司.一种缓解疲劳和抗氧化的牦牛骨蛋白肽及制备方法:201810162657.6[P].2018.07.31.
[12]姜海洋,张周莉,孙敏,等.牦牛骨抗氧化肽的分离纯化及鉴定[J].基因组学与应用生物学,2019（8）:3479-3485.
[13]郭冰洁,苑广信,张静,等.鹿骨胶水解物抗氧化活性及对H2O2损伤PC12细胞保护作用的研究[J].安徽农业科学,2019,47（7）:193-196.
[14]徐腾,李迪,李林,等.牛骨胶原低聚肽对术后小鼠伤口愈合作用初步探讨[J].中国食物与营养,2018,24（12）:45-49.
[15]鲍雷,肖杨,李迪,等.牛骨胶原低聚肽促进皮肤切口手术模型小鼠术后伤口愈合的机制研究[J].食品工业科技,2018,39（13）:292-295,330.
[16]Xu F P,Zhang L W,Cao Y,et al.Chemical and physical characterization of donkey abdominal fat in comparison with cow,pig and sheep fats[J].Journal of the American Oil Chemists'Society,2013,90（9）:1371-1376.
[17]张杰,潘风光,刘婧,等.响应面分析法优化猪骨素提取工艺条件的研究[J].食品工业科技,2011,32（6）:286-289.
[18]刘丽莉,李丹,杨陈柳,等.牛骨胶原蛋白酶解工艺优化及结构特性分析[J].食品与机械,2017,33（7）:40-46.
[19]王晓军,吴婷,贾伟,等.酸法和酶法提取牦牛骨胶原蛋白的特性分析[J].食品科学,2018,39（12）:101-106.
[20]Gao L L,Wang Z Y,Li Z,et al.The characterization of acid and pepsin soluble collagen from ovine bones（Ujumuqin sheep）[J].Journal of Integrative Agriculture,2018,17（3）:704-711.
[21]张磊,刘松鑫,刘畅,等.鹿骨胶原螯合钙的制备[J].食品工业,2019,40（11）:1-6.
[22]Dong X B,Li X,Zhang C H,et al.Development of a novel method for hot-pressure extraction of protein from chicken bone and the effect of enzymatic hydrolysis on the extracts[J].Food Chemistry,2014,157:339-346.
[23]帕尔哈提·柔孜,高彦华,木合布力·阿布力孜,等.中药牛骨髓中蛋白与多肽提取方法的比较研究[J].中草药,2018,49（15）:3600-3608.
[24]陈静廷,卜登攀,马露,等.不同等电点沉淀法和超速离心法提取牛奶乳清蛋白的双向电泳分析[J].食品科学,2014,35（20）:180-184.
[25]Marbaix H,Budinger D,Dieu M,et al.Identification of proteins and peptide biomarkers for detecting banned processed animal proteins（PAPs）in meat and bone meal by mass spectrometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64（11）:2405-2414.
[26]刘楚怡,樊雨梅,王长伟,等.不同分子量抗骨质疏松驴骨肽的制备工艺[J].安徽农业科学,2019,47（17）:155-158.
[27]马国霞,邬应龙,刘凌志.猪骨素发酵及其产物的电泳分析[J].食品与发酵工业,2011,37（8）:56-60.
[28]张崟,王新惠,王卫,等.骨素及骨素酶解液中蛋白质及肽的电泳分离[J].现代食品科技,2015,31（6）:178-182.
[29]宋紫临,吴丽丽,秦灵灵,等.PI3K/AKT信号通路与糖尿病的研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化,2019,21（6）:1264-1269
[30]任慧雯,王秋月.Epac-Rap1与糖尿病肾病[J].国际内分泌代谢杂志,2015,35（3）:170-172.