氧化应激使有机体处于易损状态，可引起有机体抗氧化系统崩溃、衰败，甚至产生重大疾病死亡及食物腐败等多方面不良影响。如何抗氧化已成为医药保健、水产畜禽养殖、食品加工领域面临的关键课题。目前，使用外源抗氧化剂维持机体抗氧化系统的平衡，被认为是克服氧化应激危害的有效方式[1]。其中，植物来源的天然抗氧化剂还具有来源可靠、安全性高、副作用低等诸多优点，受到广泛关注[2]。世界卫生组织估计，地球上80%的居民依赖传统药物满足初级保健需求，这种疗法大多数依赖于植物提取物及其有效成分的使用[3]。因此，筛选具高抗氧化活性的植物品种资源，并研究其抗氧化活性特性与活性成分的关系，对进一步开发安全高效的抗氧化剂具有重要意义。
木薯（Manihot esculenta Crantz）是与马铃薯、番薯并称为世界三大薯类的重要的热带作物之一，为世界第五大粮食作物，在全世界热带地区广泛栽培。木薯属于大戟科，此科植物多供药用，具有抗癌、抗菌、保肝和抗炎等功效[4]。已有研究表明，木薯叶经捣烂、煮熟后，不仅可以作为蔬菜食用，可以治疗膀胱炎，并且孕妇和哺乳期的妇女都可以食用[5]。木薯叶中还富含黄酮、胡萝卜素、三萜类等生物活性物质[6-8]，前人研究表明了木薯叶乙醇提取物中的总黄酮比维生素C表现出更强的抗氧化活性[9]，并已作为畜禽水产养殖饲料添加剂进行应用[10-11]，极具研究开发价值。
目前，我国木薯种植主要以收获块茎为主，而占薯块根产量约30%木薯叶片副产物，除少部分作低附加值饲料外，大部分被丢弃，尚未得到充分开发利用[12]。研究还表明，植物抗氧化活性受品种、植龄等多种因素的影响[13-14]。但目前关于木薯叶提取物的抗氧化活性及成分的仅局限于单个品种的抗氧化活性评价、提取物成分的研究分析及总黄酮含量的动态分析[15-17]，而关于不同品种、不同植龄的互作影响，仍未见报道。因此，本研究基于前人研究进展，假设木薯叶乙醇提取物的抗氧化性与总黄酮含量存在显著关系，选取9个叶片产量较大的木薯品种的3个植龄的叶片乙醇提取物作为研究对象，检测提取物中总黄酮含量及抗氧化活性，探讨品种和植龄对总黄酮含量与抗氧化活性及其相关关系的影响，以期将木薯叶片开发为抗氧化剂提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验所用样品共27个，分别为9个木薯品种（华南 系 列 品 种 SC06、SC07、SC08、SC09、SC10、SC12、SC13、SC205 及面包木薯品种 BC） 的 120、180 、240 d植龄的叶片样品，按“品种-植龄”进行编号，如SC06-120，表示木薯品种SC06的120 d植龄叶片样品。木薯品种来自海南省儋州市的农业农村部木薯种质资源圃，叶片样品采自海南省海口市三江镇美达农园农场种植基地，洗净后经60℃烘干至恒重，粉碎至粒径0.3 mm，-20℃保存备用。
标准品芦丁（含量≥98.1%，批号：1022799）：中国食品药品检定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本东京化成工业株式会社；Fe3+-三吡啶三嗪（TPTZ）：比利时Acros organics公司，试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Waters e2695高效液相色谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；ME204E电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；JL-721DTH数控超声波清洗器：南京科捷分析仪器有限公司；HACH DR 6000紫外可见光分光光度计：美国哈希公司。
1.3 方法
1.3.1 木薯叶乙醇提取物制备
参考文献[9]，采用超声波辅助法制备木薯叶乙醇提取物，具体为：精确称取1 g样品于50 mL带螺旋纹的离心管中，加入40 mL 90%的乙醇提取液。以优化的超声波辅助法进行提取，提取条件为：超声功率90 W，提取温度70℃，提取时间20 min。提取液分装于离心管中，-20℃保存作为待测母液备用。
1.3.2 木薯叶总黄酮含量测定
精密称取10.0 mg芦丁标准品，以70%的乙醇溶液溶解并定容至25 mL，制得0.4 mg/mL的标准液。分别向 10 mL 比色管中加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL芦丁标准液，并用70%乙醇补充体积至5mL，加入0.3 mL质量浓度为5%的NaNO2溶液，混匀后反应6 min，加入0.3 mL质量浓度为10%的Al（NO3）3溶液，混匀后反应6 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，混匀后反应10 min，加70%乙醇至10 mL。以70%乙醇为参比，于510 nm下比色。以0.4 mL提取液母液代替芦丁标准液进行样品测试，3个平行。根据标准曲线获得的回归方程，计算木薯叶总黄酮含量[18]。
1.3.3 DPPH自由基清除率测定
参考文献[19-20]，吸取经梯度稀释后的待测母液1 mL于2 mL的离心管中，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇液1 mL，摇匀后暗处反应30 min，于517 nm下比色。同时以无水乙醇代替样品同程序操作测定溶剂空白，以无水乙醇代替DPPH乙醇液同程序测定样品空白。DPPH自由基清除率按下述公式计算。
式中：A0为1 mL DPPH乙醇液与1 mL无水乙醇在517 nm处的吸光度；A1为1 mL样品液与1 mL DPPH乙醇液在517 nm处的吸光度；A2为1 mL样品液与1 mL无水乙醇在517 nm处的吸光度。
将各种浓度的母液待测液DPPH自由基清除率数据，导入Origin 2018，通过最优模型计算DPPH自由基清除率为50%时的母液浓度，记为EC50。
1.3.4 FRAP测定
参考文献[19-20]，以不同浓度的FeSO4溶液在590 nm下的吸光度制得工作曲线。精密吸取提取液0.3 mL于小试管中，加入预热至37℃的TPTZ工作液2.7 mL，摇匀后放置10 min，于590 nm测其吸光度值，以无水乙醇代替样品加入TPTZ工作液为空白，每个浓度做3次，求平均值。根据所得吸光值，在工作曲线上求得相应Fe2+当量，定义为FRAP值。FRAP按下述公式计算。
式中：C为样品扣除空白后的吸光度代入回归方程得到的Fe2+当量，μmol/L；V为待测液总体积，取3 mL；N为样品稀释倍数；M为样品质量，g。
1.4 数据分析
采用EXCEL 2010软件进行数据整理和计算。采用SPSS 25软件进行差异显著性分析、聚类分析与相关性分析。
2 结果与分析
2.1 木薯叶总黄酮含量
各样品的总黄酮含量如图1所示，木薯叶总黄酮含量在植龄与品种间变异程度分析见表1。
图1 各品种不同植龄木薯叶中总黄酮含量
Fig.1 Total flavonoids contents in cassava leaves of different cultivars at different cultivation time
A.120 d；B.180 d；C.240 d。柱标相同字母表示差异不显著（P>0.05），柱标不同字母表示差异显著（P<0.05）。
表1 木薯叶总黄酮含量在植龄与品种间变异程度分析
Table 1 Variation degree analysis of total flavonoids contents in cassava leaves among cultivation times and cultivars
项目 编号 平均值/（mg/kg）标准偏差/（mg/kg）变异系数/%不同品种 SC06 42.27 7.61 18.01 SC07 47.95 10.03 20.92 SC08 54.69 8.76 16.02 SC09 53.08 10.14 19.11 SC10 50.30 6.56 13.05 SC12 59.81 6.44 10.77
续表1 木薯叶总黄酮含量在植龄与品种间变异程度分析
Continue table 1 Variation degree analysis of total flavonoids contents in cassava leaves among cultivation times and cultivars
项目 编号 平均值/（mg/kg）标准偏差/（mg/kg）变异系数/%SC13 54.74 4.71 8.60 SC205 51.50 6.69 12.98 BC 56.44 4.60 8.14不同植龄 120 d 59.43 4.65 7.82 180 d 52.40 5.50 10.49 240 d 45.10 6.25 13.86
由图1可知，木薯叶总黄酮含量存在显著差异，受品种和植龄共同影响。120 d植龄下品种SC12、BC、SC08、SC09、SC13、SC205间，180d植龄下品种 SC12、BC、SC08、SC09、SC13 间，240 d 植龄下品种 SC12、BC、SC13间，叶片总黄酮含量差别不显著（P>0.05），并显著高于同一植龄下的其它品种，总黄酮含量存在明显的基因型差异。其中，SC12、BC、SC13的叶片总黄酮含量均处于各个植龄下最高水平；其总黄酮含量随植龄的变异系数分别是10.77%、8.60%、8.14%，为各品种中最小，稳定性好，可进一步开发为富含黄酮的木薯品种。
由表1可知，随植龄增大，总黄酮含量平均值呈逐渐下降变化、各品种间的变异系数呈逐渐增大变化。这种变化规律与王伟等[15]、王琴飞等[17]的研究结果一致。这可能与木薯各生长阶段的生长策略有关。120 d处于木薯地上茎叶生长高峰期，各品种叶片生长茂盛、叶片中黄酮等成分大量积累；180 d处于木薯块根伸长膨大和淀粉积累充实时期，叶片合成的大量营养物质逐步被用于维持地下部生长，叶片中黄酮等成分累积减少；240 d处于木薯块根营养物质积累完成期，并且由于处于冬季，叶片代谢减弱，趋于变黄掉落，黄酮等成分累积更少。
2.2 提取物抗氧化活性表征
2.2.1 还原力测定结果
FRAP法通过测定化合物的还原能力来表征其抗氧化活性，FRAP值越大，抗氧化活性越强。图2为不同植龄下各品种木薯叶FRAP抗氧化能力测定结果。
由图2可知，不同植龄下同一品种的FRAP值差别不大，但不同品种的FRAP值差别显著，各植龄下各品种的FRAP值差别显著程度均为SC12、SC13＞BC、SC205＞SC06、SC07、SC08、SC09、SC10（P＜0.05）。说明木薯叶的FRAP抗氧化能力不受植龄影响，存在明显的基因型差异，品种SC12、SC13具有较强的FRAP抗氧化活性，达到20 mmol/g以上。
图2 不同植龄的木薯叶FRAP抗氧化活性测定结果
Fig.2 FRAP antioxidant activity of cassava leaves at different cultivation times
A.120 d；B.180 d；C.240 d。图中柱标相同字母表示差异不显著（P>0.05）；柱标不同字母表示差异显著（P<0.05）。
2.2.2 DPPH自由基清除结果
结合对DPPH自由基的清除率测定结果，计算50%清除率下的提取液浓度EC50值，表征抗氧化活性，EC50值越小，抗氧化活性越强，各样品的EC50值如图3所示。EC50值在植龄与品种间变异程度分析见表2。
由图3、表2可知，品种和植龄对EC50的影响程度不一，9个品种的EC50平均值在各植龄下分别是120 d（22.65%）≈180 d（22.33%）＞ 240 d（17.94%），EC50值的品种间变异系数分别是120 d（13.95%）、180 d（18.06%）、240 d（29.12%），DPPH 自由基的清除力较高（EC50小于20%）的样品数量分别是120 d和180 d下均为2个、240 d为4个，说明植龄越大，DPPH自由基清除能力与品种间的差别程度均增大，这与总黄酮含量变化规律一致。同一品种下，随植龄增大，各品种EC50的变异系数处于3.43%～29.79%，离散程度不一。植龄和品种共同影响木薯叶DPPH自由基的清除能力。其中，品种SC12、SC13在各植龄下，DPPH自由基清除能力均处于较高水平，但SC12随植龄的变异系数为7.68%，明显低于SC13随植龄的变异系数25.24%，DPPH自由基的清除能力，SC12比SC13稳定。
图3 不同植龄的木薯叶DPPH法抗氧化活性测定结果
Fig.3 DPPH free radicals scavenging ability of cassava leaves at different cultivation times
A.120d；B.180d；C.240d。柱标相同字母表示差异不显著（P>0.05）；柱标不同字母表示差异显著（P<0.05）。
2.3 木薯叶乙醇提取物样品聚类分析
为进一步挖掘木薯品种间的差异，根据木薯叶总黄酮含量和抗氧化活性指标，通过聚类分析法对其进行分类，采用组间平均联结法，以欧氏距离作为测度方法，结果见图4。
表2 EC50值在植龄与品种间变异程度分析
Table 2 Variation degree analysis of EC50 in cassava leaves among cultivation times and cultivars
项目 编号 平均值/% 标准偏差/% 变异系数/%不同品种 SC06 23.83 1.65 6.93 SC07 25.78 1.83 7.10 SC08 25.42 2.60 10.23 SC09 19.14 5.21 27.24 SC10 22.66 0.78 3.43 SC12 15.44 1.19 7.68 SC13 16.67 4.21 25.24 SC205 19.57 4.14 21.17 BC 20.26 6.03 29.79不同植龄 120 d 22.65 3.16 13.95 180 d 22.33 4.03 18.06 240 d 17.94 5.22 29.12
由图4可知，所有样品被分成5类：Ⅰ类包括SC08-240、SC10-240、SC06-180、SC06-120、SC07-180、SC10-180、SC205-180、SC09-180、SC09-240、SC205-240；Ⅱ类包括 SC06-240、SC07-240；Ⅳ类包括 SC07-120、SC08-180、SC10-120、BC-180、SC08-120、SC09-120、SC205-120、BC-120；Ⅴ类包括 SC12-240、BC-240、SC13-240、SC13-120、SC12-180、SC13-180；Ⅵ类包括SC12-120。同一植龄的样品没有都处于一个聚类之中，说明不同品种的样品具有一定的内在相似性。结合图1、图2、图3可知，总黄酮含量高、抗氧化活性大的样品基本处于一个类别里，5类样品总黄酮含量与抗氧化活性大小排序为：Ⅴ类、Ⅵ类＞Ⅳ类＞Ⅰ类＞Ⅱ类，Ⅴ类、Ⅵ类中所含样品可做为进一步开发为抗氧化剂的对象。进一步从品种筛选考虑，SC12、SC13在各个植龄均具有较高的总黄酮含量及抗氧化活性，这两个品种作为天然植物抗氧化剂开发的潜力最大。这与前文分析结果一致，这也预示着建立统一的基准，用于评价不同品种抗氧化活性是可行的。
2.4 总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析
为进一步明确不同品种木薯叶抗氧化活性与其总黄酮含量的关系，对不同植龄的木薯叶乙醇提取物中总黄酮含量与抗氧化活性进行相关性分析，结果见表3。
由表3可知，总黄酮含量与铁离子还原能力FRAP值在240 d植龄和全植龄下存在显著正相关关系（P<0.05），相关系数分别为 0.797、0.423；总黄酮含量只有在240 d植龄下与DPPH自由基清除力的EC50值存在显著负相关关系（P<0.05），相关系数为-0.748；其他植龄下，总黄酮含量与抗氧化活性指标之间不存在显著相关关系。分析原因是：1）本研究采用的120、180 d植龄的木薯叶乙醇提取物中，总黄酮类物质并不是唯一起抗氧化作用的物质，可能存在黄酮以外具有抗氧化效果的多酚类物质；2）木薯叶中黄酮类物质存在多样性，不同成分的抗氧化作用机理不一，多种黄酮类化合物的抗氧化作用效果相互抵消。由以上分析，240 d植龄下，总黄酮是木薯叶乙醇提取物的主要抗氧化活性成分，并且各黄酮成分抗氧化作用效果表现出协调正作用。但木薯叶乙醇提取物中的其他抗氧化活性成分及其抗氧化相互作用机理，仍需进一步研究。
图4 9个品种3个植龄的木薯叶样品的聚类分析结果
Fig.4 Cluster analysis result of cassava leaf samples from 9 cassava cultivars at three cultivation times
表3 不同植龄木薯叶总黄酮含量与抗氧化活性的Pearson相关分析
Table 3 Pearson correlation analysis of total flavonoids content and antioxidant activity of cassava leaves at different cultivation times
注：*为0.05水平下有显著性，P<0.05。
项目 EC50值 FRAP值120 d植龄 -0.535 0.468 180 d植龄 -0.159 0.623 240 d植龄 -0.748* 0.797*全植龄 0.020 0.423*
3 结论
木薯叶乙醇提取物中总黄酮含量、抗氧化活性受品种、植龄的影响不一。在各植龄下，品种SC13、SC12的总黄酮含量最高，FRAP值最大、DPPH自由基清除率的EC50值最小，抗氧化活性最强，是天然抗氧化剂的良好来源。
聚类分析将不同品种不同植龄的样品分为5类，揭示了不同品种之间具有内在的相似性，与总黄酮含量水平、抗氧化活性评价结果一致，预示着建立统一的基准，用于评价不同品种抗氧化活性是可行的。
240 d植龄下，木薯叶乙醇提物抗氧化能力与其中总黄酮物质有显著的相关性，但乙醇提取物中抗氧化组分及其其抗氧化相互作用机理仍需进一步研究。
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