雪燕（tragacanth gum）为木髓分泌物，原产于地中海东部干旱地区、亚洲西南部、北部高原和沙漠[1]。因产品性状与燕窝相似而得名，并被引入中国。但是，目前对雪燕成分及功能性的认知和研究少有报道。随着大众对养生追求的不断提高，人们对雪燕产品的需求逐渐扩大。然而，雪燕质量良莠不齐，一方面由于缺乏专门的学者研究，另一方面市场没有与它相关的准则进行约束，因此，深入研究雪燕的营养成分及其功能性势在必行[2-3]。
多糖，又称多聚糖，是由10个以上的单糖分子通过糖苷键聚合而成的一类分子结构复杂且庞大的糖类物质[4]。在食物营养成分中，活性多糖是能够起到调节人体机能作用的生物活性物质种类中重要的一种[5]。根据多糖理化性质的不同，其提取方法通常包括传统的水提醇沉法、酸提法、碱提法，或是采用超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法等新兴技术手段，以提高其提取效率[6]。雪燕作为树髓分泌物，其多糖的溶出不受植物细胞壁的约束限制，因此，本研究关于雪燕多糖的提取采用成本低、污染少、安全的传统方法进行提取，并将提取工艺条件进行优化。
不同来源的多糖具有不同生物学功能。研究表明，植物多糖通常具有抗氧化、免疫调节、肿瘤抑制、治疗心脑血管系统疾病、抗病毒等多种生理功能[7-10]。其中，抗氧化作用体现在植物多糖可保护膜结构的完整性，防止超氧阴离子自由基的攻击；可与羟基自由基形成有关的金属离子相结合，抑制羟自由基的产生；能清除细胞内过多的自由基，减轻活性自由基对免疫系统的损伤或保护DNA、蛋白质、脂类等生物大分子免受直接攻击而起到抗癌的作用[11-14]。本试验对雪燕多糖的体外抗氧化效果进行分析评价，将为后续相关研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雪燕：印度BOZI购买，于40℃烘箱中烘干，含水量为5%，打粉机粉碎过60目筛后装于自封袋中，备用。
邻苯三酚：美国Sigma公司；葡萄糖、无水乙醇、苯酚、L-抗坏血酸（VC）（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；2，2’-连氮基-双-（3 乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS+）、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：北京索莱宝科技有限公司；鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸：源叶生物有限公司；三氯乙酸、甲醇、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、过硫酸钾（分析纯）：天津市百世化工有限公司；三氟乙酸、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1，2-dihydro-5-methyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-one ，PMP）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 试验仪器
S433D全自动氨基酸分析仪：德国Sykam；iCap Q电感耦合等离子体质谱仪（inductively coupled plasmamass spectrometry ，ICP-MS）：Thermo Fisher Scientific；1200 液相色谱仪：Agilen；SPECTROstarNano酶标仪：德国BMG；FW80型粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；HC-3018高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；HH-4水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 雪燕微量元素含量的测定
采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法[15-17]测定雪燕中微量元素的含量。称取样品0.3 g（精确到0.0001g），置于消化罐中，加入硝酸4.0mL，浸泡30min；加入双氧水1.0 mL浸泡过夜，装入消解装置，设定温度为165℃，时间为12 min启动仪器。计时完成后等待3 min～5 min即可把消解罐从微波炉中取出，冷却20 min后即可在通风橱内打开消解罐。将消解完成的样品试剂转移到25 mL比色管中定容，溶液静置澄清后上机测定，测定参数如表1所示。
表1 ICP-MS的仪器参数
Table 1 ICP-MS instrument parameters
参数名称 参数 参数名称 参数射频功率 1 500 W 雾化器 高盐/同心雾化器等离子体气流量 15 L/min 采样锥/截取锥 镍/铂锥载气流量 0.80 L/min 采样深度 8 mm～10 mm辅助气流量 0.40 L/min 采集模式 跳峰（Spectrum）氦气流量 4 mL/min～5 mL/min 检测方式 自动雾化室温度 2℃ 每峰测定点数 1～3样品提升速率 0.3 r/s 重复次数 2～3
1.3.2 雪燕中氨基酸含量测定
1.3.2.1 样品前处理
称取试样约100 mg（准确至0.1 mg）于20 mL安瓿瓶中，加入10.00 mL 6 mol/L盐酸溶液，摇匀，充氮气2 min，封管。将水解管放入110℃恒温干燥箱中水解22 h～24 h。冷却，混匀，过滤；取0.2 mL的滤液，60℃浓缩至干；用1 mL pH 2.2柠檬酸钠上机稀释液溶解残留物，0.45 μm滤膜过滤，上机测定。
1.3.2.2 上机测定
梯度洗脱程序见表2。
表2 梯度洗脱程序
Table 2 Gradient elution program
时间/min 缓冲液A/% 缓冲液B/% 再生液/%0 100 0 0 3.0 100 0 0 11.5 85 15 0 17.5 80 20 0 23.5 67 33 0 27.5 20 80 0 29.5 20 80 0 30.5 0 100 0 43.0 0 100 0 43.1 0 0 100 46.1 0 0 100 46.2 100 0 0 60.4 100 0 0 60.5 100 0 0
色谱柱：Na+磺基水杨酸柱（liquid chromatography under the limiting conditions of adsorptionL，CLCA）（K06/Na 4.6 mm×150 mm×7 μm）分离柱；流动相：缓冲溶液A为pH 3.4的柠檬酸钠，缓冲溶液B为pH 10.8的柠檬酸钠，再生液为氢氧化钠溶液和茚三酮溶液，均按照厂家要求配制。检测波长：570 nm；进样量：50 μL；缓冲泵流速：0.45 mL/min；试剂泵流速：0.25 mL/min；柱温程序：初始柱温 58 ℃；0～19.0 min，柱温58℃；19.0 min～24.0 min，柱温由58℃变化到74℃；24.0 min～49.0 min，柱温 74 ℃；49.0 min～54.0 min，柱温由74℃变化到58℃；54.0 min～59.0 min，柱温58℃；反应器温度：130℃。
1.3.3 雪燕多糖提取工艺优化
1.3.3.1 雪燕多糖提取单因素试验
取处理好的雪燕粉，以料液比为1∶200（g/mL），选择溶液pH值、提取时间和提取温度3个因素进行单因素试验[18-21]。其中 pH 值设置为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；提取时间 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h；提取温度 20、30、40、50、60、70、80、90、100℃。加4倍体积的无水乙醇，即浓缩液∶无水乙醇为1∶4的体积比进行沉淀，静置过夜后8 000 r/min的条件下离心10 min，弃去上清，沉淀部分即为雪燕多糖。采用苯酚-硫酸法[20]测定多糖含量，并最终确定各单因素中的最佳提取参数。
1.3.3.2 雪燕多糖提取正交试验
根据单因素试验结果，以多糖提取率为评价指标，按L9（33）进行正交试验（表3），确定雪燕多糖最优提取条件。
表3 L9（33）正交试验因素与水平设计
Table 3L9（33）Orthogonal experimental factors and level design
水平 pH值 提取时间/h 提取温度/℃1 2 2.5 50 2 3.0 60 3 4 3.5 70 3
1.3.4 单糖组成成分分析
1.3.4.1 糖的衍生化
完全酸水解：取适量样品于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸（trifluoroaceticacid，TFA）1 mL，于120℃烘箱中水解2 h。取出后，氮气吹干。
衍生化反应：向吹干后的样品中加1 mL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 （PMP）-甲醇溶液以及0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，70℃水浴60 min，冷却，加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液后，加入0.5 mL氯仿，振荡摇匀后静置20 min，弃去下层，萃取3次，取水层过膜上机。通过与标准品保留时间的比较，确定色谱峰所属的化合物种类，通过峰面积计算各种化合物含量。
1.3.4.2 色谱条件
SHISEIDO C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：A为0.1 mol/L KH2PO4（pH 6.8）；B为乙腈；A∶B=82∶18（体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温为 25℃；进样量 10 μL；波长为 245 nm。
1.3.5 雪燕多糖体外抗氧化能力测定
1.3.5.1 羟自由基清除能力测定
取1 mL 0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液，加入2.5 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液（样液的空白组和阳性对照组的空白组加1 mL无水乙醇）和1 mL 8.8 mol/L的过氧化氢溶液置于离心管中混合均匀，37℃下反应30 min，随后在4 000 r/min条件下离心10 min，在510 nm处测量溶液上清液的吸光度。溶液样品进行3组平行，样品对羟自由基的清除率按式（2）计算[22-23]。
式中：A为不加样品组的吸光度（即用蒸馏水代替样品）；B为试验组的吸光度；B0为与试验组对应的空白组的吸光度。
1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力
将0.2 mL浓度为7.4 mmol/L ABTS溶液和0.2 mL浓度为2.6 mmol/L过硫酸钾等体积混合。室温黑暗条件下反应12 h～16 h。得到ABTS工作液母液后用乙醇稀释40倍～50倍，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液将该溶液在734 nm处吸光度调节为0.7～0.8之间，得到工作液备用。取0.1 mL 0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液[24-25]，加入1.9 mL调配好的稀释工作液，在37℃避光反应1h后于734 nm下测定其吸光度。平行测定3次，取平均值。
式中：A对照为0.1mL乙醇+1.9 mL ABTS工作液的吸光度；A样品为0.1 mL样品+1.9 mL ABTS工作液的吸光度。
1.3.5.3 DPPH自由基清除能力测定
称取一定量的DPPH试剂，用无水乙醇配制成0.2 mmol/L DPPH溶液。取0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液2 mL+1 mL DPPH溶液（空白组用甲醇代替DPPH）混合均匀后在室温黑暗处静置30min，在517nm处测吸光度值。以抗坏血酸作为阳性对照，样品对DPPH自由基的清除率按式（4）计算。
式中：A为不加样品组的吸光度（即用蒸馏水代替样品）；B为试验组的吸光度；B0为与试验组对应的空白组的吸光度。
1.4 数据处理
试验数据采用Excel和SPSS 19.0进行统计分析，数据用均数±标准差（
±s）表示，组间比较并进行Duncan’s检验，P＜0.05表示具有显著差异。
2 结果与分析
2.1 雪燕中微量元素含量
电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）拥有低检出限、宽动态线性范围、干扰少、分析精密度高、分析速度快、可进行多元素同时测定以及可提供精确的同位素信息等分析特性。采用该方法对雪燕中的微量元素进行评价分析，结果如表4所示。
表4 微量元素测定结果
Table 4 Trace element determination results
注：ND表示未检出该种微量元素。
images/BZ_31_1312_1420_1787_1816.png微量元素含量/（g/100 g）锌 3.04×10-4砷 ND锶 1.06×10-2银 ND镉 ND铅 ND
雪燕中铅、镉、砷均未检出，镍、铬含量均符合国家安全标准限量，说明该雪燕产品安全性高，不存在重金属超标问题。同时雪燕中含有人体必需微量元素锶、钴、铜、锌，以及元素镍和锰。其中锶（1.06×10-2g/100 g）、锰（2.87×10-3g/100 g）含量丰富，锶是人体牙齿及骨骼的正常组成部分，在人体内的代谢与钙极为相似，能促进骨骼的发育生长，在骨骼中，约占人体锶总量的90%。缺锶会引起龋齿、骨质疏松、阻碍新陈代谢、产生牙齿和骨骼发育不正常等症状。而锰有促进骨骼的正常生长和发育，维持正常的糖代谢和脂肪代谢，预防贫血和癌症，维持正常脑功能等作用。
2.2 雪燕中氨基酸含量
雪燕中氨基酸含量见表5。
酸水解样品后测定雪燕中氨基酸的种类丰富且较为齐全。共含有16种氨基酸，其中人体必需氨基酸含有 7 种 （Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val），总量达21.1 g/100 g，占总氨基酸比例为42.93%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为43∶57。雪燕中天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最为丰富，分别达到 9.28、7.01、5.49 g/100 g。
表5 雪燕中氨基酸含量
Table 5 Amino acid content in tragacanth gum
氨基酸种类含量/（g/100 g）占总氨基酸比例/%亮氨酸（leucine，Leu） 7.01±0.47 14.16±0.62缬氨酸（valine，Val） 4.29±0.85 8.78±1.65赖氨酸（lysine，Lys） 3.49±0.48 7.05±1.07苯丙氨酸（phenylalanine，Phe） 1.82±0.93 3.59±1.81苏氨酸（threonine，Thr） 2.36±0.25 4.84±0.23异亮氨酸（isoleucine，Ile） 1.81±0.31 3.49±0.23蛋氨酸（methionine，Met） 0.32±0.32 1.02±0.48天冬氨酸（aspartic acid，Asp） 9.28±1.07 18.50±0.71丝氨酸（serine，Ser） 2.23±0.31 4.55±0.35谷氨酸（glutamic acid，Glu） 5.49±0.65 11.09±0.57甘氨酸（glycine，Gly） 1.99±0.38 3.99±0.46丙氨酸（alanine，Ala） 2.41±0.65 4.64±0.53半胱氨酸（cysteine，Cys） 1.83±0.36 3.84±0.76酪氨酸（tyrosine，Tyr） 1.06±0.60 2.14±1.18组氨酸（hlstidine，His） 2.02±0.43 4.28±0.98精氨酸（argnine，Arg） 2.23±0.27 4.41±0.39
天冬氨酸在雪燕中含量最高，占总氨基酸的18.5%，天冬氨酸对于高血压、心脏病等疾病有较好的治疗效果[26]。食品领域中可用来添加到保健食品中起到缓解疲劳的作用，在饮料配制时添加天冬氨酸，对口感和风味有一定的提升[27]；化工领域中可作为高分子材料的原材料，也能够作为营养添加剂添加到化妆品中[28]。
谷氨酸为雪燕中含量较高的氨基酸，占总氨基酸含量的11.09%，有助于蛋白质的合成，参与肠道改善功能、提高肠道阻挡能力、使肠道细胞活性增强、促使肠道生长发育、提高抗氧化功能[29]。
2.3 多糖提取工艺优化试验结果
2.3.1 单因素试验结果
2.3.1.1 提取温度对雪燕多糖提取率的影响
温度对雪燕多糖提取率的影响见图1。
由图1可知，随着提取温度的升高，雪燕多糖提取率呈先上升后下降的变化趋势，当提取温度升至60℃时，多糖提取率达最大值（3.63%）。温度较低时，多糖成分溶解速率缓慢，在相同时间内多糖提取率较低；随着温度的升高，多糖溶解度提高，利于多糖的提取；但温度过高易引起多糖水解或分子链破坏而生成小分子糖类物质，使多糖含量下降，同时，温度过高也会导致水气化的出现，若水气化现象持续时间较长，则会引起溶剂体积增大，料液比下降，影响多糖的溶出率，降低多糖的提取率[30]。因此，提取温度为60℃时，雪燕多糖的提取效果最佳。
图1 温度对雪燕多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
2.3.1.2 pH值对雪燕多糖提取率的影响
pH值对雪燕多糖提取率的影响见图2。
图2 pH值对雪燕多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of pH on the extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
结果如图2所示，当pH值为3.0时，雪燕多糖提取率最大（6.58%）。pH值较高与过低时，雪燕多糖提取率均较低，该现象出现的原因可能是酸环境和碱环境均导致了雪燕中的一些大分子多糖降解为小分子多糖，导致雪燕多糖的彻底溶解。因此，提取液pH 3为最适pH值。
2.3.1.3 提取时间对雪燕多糖提取率的影响
提取时间对雪燕多糖提取率的影响见图3。
从图3可以看出，提取时间对雪燕多糖提取率存在一定影响，从0.5 h开始随着时间的增加呈上升趋势，到达最高点后提取率又随着时间的增加而下降。当提取时间为3.0 h时，多糖的提取率最高（8.73%）。在酸性环境下提取时间过长会增加多糖的水解程度，影响其提取率。同时达到一定时间后，细胞内、外渗透压逐步趋于平衡，多糖提取率不再上升，加热状态下过长的时间可能导致多糖链结构发生变化，使多糖提取得率下降[31]。
图3 提取时间对雪燕多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
2.3.2 正交试验结果
正交试验结果见表6。
雪燕多糖提取率正交试验所选3种因素的主次顺序为：提取时间>提取温度>pH值，即提取时间对雪燕多糖提取率影响最大，其次是提取温度，最后为pH值。雪燕多糖的最佳提取工艺条件为：提取温度60℃、pH 2.0、提取时间 3.5 h。
为验证正交试验工艺组合提取温度60℃、pH 2.0、提取时间3.5 h，进行3次平行验证试验。结果表明，在该组合工艺条件下，雪燕多糖平均提取率为13%，证明该正交试验结果可靠准确。
2.4 单糖组成成分分析
不同种类的单糖因在糖柱中的保留时间不同而依次出峰。在1.3.4测试条件下鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸标准混合溶液的液相谱图见图4，雪燕多糖水解液的液相色谱见图5。
图4 混合标准单糖PMP衍生物的HPLC色谱图
Fig.4 HPLC chromatogram of a mixed standard monosaccharide PMP derivative
表6 正交试验结果
Table 6 Orthogonal test results
试验号 因素 多糖提取率/% pH值 提取时间 提取温度1 1 1 1 1.93 2 1 2 2 10.93 3 1 3 3 12.97 4 2 1 2 4.74 5 2 2 3 7.38 6 2 3 1 5.87 7 3 1 3 4.58 8 3 2 1 8.31 9 3 3 2 12.56 k18.61 3.75 5.37 k26.00 8.87 9.41 8.48 10.47 8.31 R 2.62 6.72 4.05主次顺序 提取时间>提取温度>pH值优水平 pH 2.0，提取时间3.5 h，提取温度60℃优组合 pH 2.0，60℃下提取时间3.5 h k3
通过保留时间可对单糖进行定性分析，在液相色谱图中，峰面积与质量浓度呈正比关系，因此通过峰面积可对单糖进行定量分析，雪燕多糖中的单糖组成成分主要是鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、它们的相对质量分数分别为22.1%、20.0%、5.66%、1.64%。王森等[32]研究印度树胶水解后可获得L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和D-半乳糖醛酸，与本研究所得单糖组成有所不同，由此可得同一种类天然食用树胶不同树种（种源）之间，单糖含量不同。
2.5 体外抗氧化结果与分析
自由基（free radical，FR）是指带有未成对电子的原子或基团。机体在受到各种因素（环境温度、机械、病原）的影响下会在短时间内大量产生。机体内大量自由基的产生是机体应激、亚健康和文明病形成的主要原因。机体内的自由基分为两类：活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）。活性氧（ROS）不仅包括氧中心自由基，而且包括氧的反应衍生物的非自由基（如H2O2）。活性氮（RNS）是指氮自由基和其他反应分子。在活性氧自由基中，·OH具有强氧化性和强反应性。·OH能损害与其紧密接触的分子，是对生物物质最具破坏性的ROS。·NO是代表性的活性氮自由基，能结合过渡态金属，·NO与Fe的结合是·NO发挥作用的重要机制，同时通过结合血红蛋白中的铁使其在失活和消除的过程中发挥重要作用。
图5 雪燕多糖水解PMP衍生物的HPLC色谱图
Fig.5 HPLC chromatogram of tragacanth gum polysaccharide hydrolyzed PMP derivative
本研究以抗坏血酸为阳性对照，采用ABTS+自由基清除法与DPPH法分析雪燕多糖体外清除活性氮自由基的抗氧化能力，同时以·OH为对象，评价了雪燕多糖对其清除能力。雪燕多糖体外抗氧化结果见图6。
结果如图6所示，雪燕多糖羟自由基清除能力与ABTS+自由基清除率分别为7.39%与4.34%，显著低于阳性对照，说明雪燕多糖对·OH和ABTS+自由基的清除能力有限；与此相反，DPPH试验中，雪燕多糖显示了良好的抗氧化能力，DPPH自由基清除率为23.841%，其抗氧化效果均与阳性对照VC相似。说明雪燕多糖具有较高的清除氮自由基能力。多糖属于高分子物质，易溶于水，而不溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，即使在含有部分水的DPPH与ABTS工作溶液中，多糖也很容易析出，造成溶液浑浊[33]。因而本试验仅对浓度为0.2 mg/mL的低浓度多糖溶液进行了抗氧化试验。
图6 雪燕多糖体外抗氧化结果
Fig.6 Antioxidant results of tragacanth gum polysaccharide in vitro
在蔡延渠等[24]、李凤月等[25]的研究中证实了相同浓度下，与VC相比，桃胶多糖作用较弱，与本试验结果中雪燕多糖羟自由基清除能力与ABTS+自由基清除率低于VC清除能力的结果一致。
3 结论
雪燕作为一种新兴的食品，具有较高的营养价值，含有丰富的微量元素和氨基酸，其中锶、锰、天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最为丰富。作为生物活性成分，雪燕多糖提取条件优化将为雪燕产品开发提供重要依据，本研究确定雪燕多糖的最佳提取条件为提取温度60℃、pH 2.0、提取时间3.5 h，多糖提取率可达13%。经HPLC法分析测定，确定雪燕多糖中的单糖组成主要含有鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、岩藻糖，其中鼠李糖和半乳糖含量较高，相对质量分数为22.1%、20.0%。提取的雪燕多糖具有一定的抗氧化能力，对活性氮自由基的清除能力较高。雪燕及雪燕多糖具有丰富的营养价值和生物学功能，是化妆品、保健食品和药品领域的一种良好的天然营养食品及抗氧化剂，具有较高的研究与开发价值。
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