近年来，致病菌快速检测成为研究热点[1-2]。目前致病菌检测的方法很多，有经典生理生化法、16S rRNA检测法、多位点测序与扩增片段长度多态性技术等，而利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS/MS）蛋白鉴别微生物，是近几年发展起来的新方法[3-5]，该方法有不同的研究方向，其中利用核糖体蛋白保守性对微生物进行鉴别，是一种简单、快速的检测方法，但是该方法也面临诸多问题，主要是核糖体蛋白质谱检出率低，其蛋白检出数量很难达到鉴别微生物的要求[6-9]。
为达到MALDI-TOFMS/MS快速检测微生物要求，本文引入金属-有机骨架材料（metal organic framework，MOFs）对微生物和核糖体蛋白进行快速富集，提高质谱检测的灵敏性和分辨率，以达到微生物鉴别的目的。目前，在MOFs材料中MIL-101是最常用的富集介孔材料，而且具有优良的蛋白富集能力[10-11]。本文通过合成Fe3O4-COOH@MIL-101纳米粒子，利用其带电性和介孔的富集特性达到快速富集菌体和核糖体蛋白，并利用核糖体蛋白微生物鉴别数据库对Escherichia coli O157∶H7 进行鉴别。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、柠檬酸钠、乙二醇、Cr（NO3）3·9H2O、苯二甲酸（均为分析纯）：天津市光复精细化工研究所；α-腈基-4-羟基苯丙烯酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）：美国布鲁克·道尔顿公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（色谱纯）、乙腈（acetonitrile，ACN）（色谱纯）：美国杰帝贝柯公司。
Autoflex III型基质辅助激光解吸飞行时间质谱：美国布鲁克·道尔顿公司；BSP-100型振荡培养箱：上海博迅实业有限公司；DynaMag-2型磁性分离器：美国赛默飞世尔科技公司；TU-1901型紫外可见吸收分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JEM-2100F型透射电子显微镜：日本电子株式会社；Miniflex 600型X射线衍射仪：日本理学株式会社；VSM1100型振动探针式磁强计：美国兰道科技公司；TriStar 3000型比表面仪：美国麦克默瑞提克有限公司；Zetasizer Nano ZSP型纳米粒度电位仪：英国马尔文仪器有限公司。
1.2 Fe3O4-COOH@MIL-101合成
Fe3O4-COOH@MIL-101采用Bromberg等[12]的水热法进行合成。
1.3 Fe3O4-COOH@MIL-101表征
透射电镜图像（transmission electron microscope，TEM）是在200 kV加速电压下通过JEM-2100F TEM进行表征磁性MOFs复合物。磁性MOFs复合物的高分辨率的X射线衍射数据是由X射线衍射仪（CuKα射线源λ=1.541 8Å）完成，记录磁性MOFs复合物的晶体结构。磁性MOFs复合物的磁力分析是在25℃条件下通过振动样品磁强度计对材料的磁性进行表征。磁性MOFs复合物的表面积、孔体积、孔径分布的测量是在77 K，0.02 ≤ P/P0≤0.20（P 为氮气分压，P0为液氮温度下氮气的饱和蒸汽压）条件下，利用比表面仪采集磁性MOFs复合物的比表面积和孔径数据。
1.4 Fe3O4-COOH@MIL-101等电点测定
把Fe3O4-COOH@MIL-101加入到不同pH值的磷酸缓冲液中，利用纳米粒度电位仪测定Fe3O4-COOH@MIL-101等电点。
1.5 菌液培养
在 37°C 下，E.coli O157∶H7接种于 25 mL 灭菌胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，摇床120 r/min培养16 h后，1 mL 细菌菌悬液离心（12 000 r/min）5 min，倒出上清液，并用磷酸盐缓冲液清洗2次，然后利用紫外可见吸收分光光度计600 nm波长调整到所需的浓度，并利用活菌计数法对其进行计数。
1.6 Fe3O4-COOH@MIL-101富集与MALDI-TOF MS/MS检测
把20 μL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）配制 MIL-101磁性颗粒悬浊液（10 mg/mL）加入到1 mL含有致病菌悬浊液的离心管中，涡旋振荡5 min，使MIL-101磁性颗粒吸附到菌体表面，然后把离心管放入微波炉中，微波辐射30 s破壁，然后加入2 mmol/L十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS），振荡30 min富集蛋白，磁性分离5 min，去除上清液，加入 20 μL 乙腈与 0.1% 三氟乙酸（体积比 1∶1），涡旋振荡3 min洗脱菌体蛋白，磁性分离5 min，把1 μL上清液移到MALDI-TOF MS\MS靶盘待测，加入基质CHCA后，采用MALDI-TOF MS\MS线性模式进行分析。
1.7 微生物鉴别
利用Flexanalysis软件（version 3.0；Bruker Daltonics）对质谱数据进行基线校正、平滑和标峰。然后利用 Tagident搜索工具（http：//web.expasy.org/tagident/）对质谱峰进行数据库检索 （UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL）确定蛋白。利用得到的核糖体蛋白搜索微生物快速鉴别数据库（Rapid Microorganism Identification Database；http：//rmidb.org）确定致病菌菌株水平归属。
Tagident搜库参数为数据库：Swiss-Prot/TrEMBL；质量差：±3 Da；pI=0～14；生物类别：Escherichia coli O157∶H7
1.8 模拟样本E.coli O157∶H7分析与鉴别
从超市中购买碳酸饮料，加入活菌计数完毕的E.coli O157∶H7的菌悬液，然后利用MIL-101磁性颗粒富集与辅助微波破壁，MALDI-TOF MS\MS检测，并利用数据库进行菌株鉴别。
2 结果与讨论
2.1 Fe3O4-COOH@MIL-101表征
Fe3O4-COOH@MIL-101合成完之后，利用透射电子显微镜、X射线衍射、磁滞回线和N2吸附-解吸等温曲线对Fe3O4-COOH@MIL-101合成效果进行表征，以证明其成功合成，表征结果如图1所示。
图1 Fe3O4-COOH@MIL-101的表征
Fig.1 Characterization of Fe3O4-COOH@MIL-101
A.透射电镜图；B.X-射线衍射；C.磁滞回线；D.N2吸附-解吸等温曲线与孔径分布。
透射电镜图直观表征了Fe3O4-COOH@MIL-101的大小和表面特征。图1A证实了Fe3O4-COOH纳米粒子的非均匀黏附在MIL-101晶体的表面，表明MIL-101晶体成功被磁化。为进一步证实磁性MOFs材料的存在，X射线衍射用来研究Fe3O4-COOH@MIL-101合成是否成功。从图1B可以看出，Fe3O4-COOH纳米粒子与Fe3O4-COOH@MIL-101的衍射角在30°～70°范围内相匹配；而模拟的MIL-101晶体的衍射角2θ数据在0°～10°范围内与Fe3O4-COOH@MIL-101相匹配，这证明Fe3O4-COOH@MIL-101被成功合成。磁滞回线显示了Fe3O4-COOH@MIL-101磁化性能，从图1C可以看出，Fe3O4-COOH@MIL-101磁化值为10.1emu/g，虽然其磁化值较Fe3O4-COOH低，但是其磁化值足够从水溶液中快速分离Fe3O4-COOH@MIL-101。利用氮气吸附来证实Fe3O4-COOH@MIL-101介孔性质，由图1D可知，所制备的Fe3O4-COOH@MIL-101复合材料具有的表面积为592.7 m2/g，孔体积为0.256 cm3/g，其孔径长约2.2 nm。氮气吸附数据表明Fe3O4-COOH@MIL-101可以足够用来吸附蛋白。
2.2 Fe3O4-COOH@MIL-101富集能力和MALDI-TOF MS/MS检测限
Fe3O4-COOH@MIL-101的富集能力是提高MALDITOF MS/MS检测微生物灵敏性的关键，常规MALDITOF MS/MS溶剂法检测微生物的浓度限值在105CFU/mL～106CFU/mL。图2是利用Fe3O4-COOH@MIL-101对不同浓度大肠杆菌富集的质谱检测结果，以此来验证Fe3O4-COOH@MIL-101富集能力和MALDI-TOF MS/MS的检测限。
由图2A可知，未利用Fe3O4-COOH@MIL-101富集的方法检测E.coli O157∶H7的浓度为6.0×105CFU/mL时，几乎没有质谱信号出现；而当添加Fe3O4-COOH@MIL-101（浓度为10 mg/mL）时，质谱信号显著增强，质谱峰的数量明显增加（图2B），这主要是因为Fe3O4-COOH@MIL-101带正电，纳米粒度电位仪测定Fe3O4-COOH@MIL-101等电点为8.0，因此带正电的纳米粒子和带有负电的大肠杆菌细胞快速结合，当利用微波破壁时，蛋白可以快速的释放到含有2 mmol/LSDS溶液中，SDS可以提高蛋白的溶解性；另外Fe3O4-COOH@MIL-101比表面积大，富集能力强，能吸附大量溶液中的蛋白，因此利于质谱检测。
但是当溶液中的菌体浓度逐渐降低时，MALDITOF MS/MS的检测能力逐渐下降（图2C），这主要是溶液中可溶解的蛋白降低的缘故，因为SDS的浓度不能添加过多，当SDS的浓度超过5 mmol/L时，SDS就会明显压制质谱信号。因此当大肠杆菌菌体浓度达到6.0×103CFU/mL时，质谱信号变得微弱，而且质谱峰的数量也大大减少，但是MALDI-TOF MS/MS仍能检测到蛋白信号，只是其蛋白数量不能用来鉴别微生物，因此Fe3O4-COOH@MIL-101富集后能鉴别微生物的检测限为6.0×104CFU/mL。
图2 Escherichia coli O157∶H7的富集与检测限
Fig.2 Enrichment and detection limit of Escherichia coli O157∶H7
A.未富集菌体浓度 6.0×105CFU/mL；B.用富集菌体浓度 6.0×105CFU/mL；C.用富集菌体浓度 6.0×104CFU/mL；D.用富集菌体浓度 6.0×103CFU/mL。
2.3 模拟样本检测
为验证该方法在实际检测中的效果，把碳酸饮料中添加不同浓度的E.coli O157∶H7构成模拟实际样本。通过模拟实际样本，检验Fe3O4-COOH@MIL-101在实际检验中的富集能力，如图3所示。
图3 模拟样本中Escherichia coli O157∶H7的检测
Fig.3 Detection of E.coli O157∶H7 in simulation samples
图3显示利用Fe3O4-COOH@MIL-101富集后，模拟样本中能鉴别微生物的检测限为6.0×105CFU/mL。这主要是因为随着菌体浓度降低，可溶解在溶液中的蛋白减少，而且碳酸饮料中杂质离子对质谱信号的压制非常显著。虽然在菌体富集后，利用去离子水对其进行清洗，但是效果仍不明显，可能是有些菌体被洗脱掉，而造成检测结果不理想。
在模拟样本中，当菌体浓度为6.0×105CFU/mL时，MALDI-TOF MS/MS检测信号强，核糖体蛋白数量多，如表1所示，根据Swiss-Prot/TrEMBL数据库搜索结果，E.coli O157∶H7有更多的核糖体蛋白被检测。这样利于微生物鉴别数据库检索，提高了E.coli O157∶H7鉴别的准确性，经微生物鉴别数据库检索可以确认模拟样本中的微生物为E.coli O157∶H7。
表1 大肠杆菌O157∶H7蛋白Swiss-Prot/TrEMBL数据库搜索结果
Table 1 Search results of E.coli O157∶H7 protein in Swiss-Prot/TrEMBL database
测量值（m/z） 理论值（m/z） 数据库入口名 蛋白质名称9 526 9 525 Q8X8U6 toxin of the YeeV-YeeU toxin-antitoxin system（耶耶夫毒素-抗毒素系统毒素）9 193 9 191 B5YTP0 30S ribosomal protein S16（30S核糖体S16蛋白）9 051 9 051 A0A0H3JFK6 partial high-affinity L-arabinose transport system membrane protein,1（部分高亲和力L-阿拉伯糖转运系统膜蛋白，1）7 870 7 871 B5YTN5 50S ribosomal protein L31（50S核糖体L31蛋白）7 273 7 273 B5YT15 50S ribosomal protein L29（50S核糖体L29蛋白）7 146 7 145 C4TIG3 DNA binding protein（DNA 结合蛋白）6 241 6 240 RL33_ECO57 50S ribosomal protein L33（50S核糖体L33蛋白）5 383 5 380 P0A7L2 50S ribosomal protein L34（50S核糖体L34蛋白）5 096 5 096 A0A5Q2EMC8 30S ribosomal protein S22（30S核糖体S22蛋白）4 363 4 364 P0A7W0 50S ribosomal protein L36（50S核糖体L36蛋白）
由表1可知，其主要质谱峰中，共有7个核糖体蛋白，它们的分子量分别是 9 193、7 870、7 273、6 241、5 383、5 096、4 363 Da，它们分别是核糖体大小亚基蛋白。利用Fe3O4-COOH@MIL-101富集后可得到更多的核糖体蛋白，通过利用核糖体蛋白的保守性，可以对微生物进行鉴别，这主要是因为核糖体蛋白不仅为菌体中高峰度蛋白，而且为碱性蛋白，其等电点大都在10.0以上，当控制溶液pH 9.0时，Fe3O4-COOH@MIL-101带负电（等电点为8.0），核糖体蛋白带正电，Fe3O4-COOH@MIL-101不仅可以利用孔径吸附蛋白，而且可以利用带电性对核糖体蛋白进行富集，因此提高核糖体蛋白检出率，从而利于微生物的鉴别。
3 结论
本文通过合成Fe3O4-COOH@MIL-101纳米材料，利用该材料的带电性和介孔的富集能力，通过Fe3O4-COOH@MIL-101对菌体和蛋白的两次富集，提高了MALDI-TOFMS/MS检测的灵敏性，使其对E.coliO157∶H7的检测限达到6.0×104CFU/mL，而利用模拟样本对其 E.coli O157∶H7 的检测限达到 6.0×105CFU/mL，同时利用核糖体蛋白搜索微生物快速鉴别数据库完成对 E.coli O157∶H7 的鉴别。
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