槟榔（Areca catechu L.）为棕榈科（Palmaceae）槟榔属（Areca）常绿乔木，其干燥的成熟种子称为槟榔（Semen Arecae），又名橄榄子、大腹子、青仔、榔玉等，广泛分布于我国南部热带、亚热带地区[1-2]。槟榔为我国“四大南药”之首，在我国中医药的应用已超过千年；《本草纲目》中记载，槟榔具有“下水肿、通关节、健脾调中、治心痛积聚”等功效；其味辛、苦，性温，归胃、大肠经，具有消积杀虫、行水降气等功效，是常用的驱虫消积的药物，主治人体肠道寄生虫、食积腹痛、水肿胀满等[3]。现代研究表明，槟榔含有多种活性成分，包括生物碱、黄酮、单宁、三萜、甾体、多糖、脂肪酸、氨基酸等多种成分[4]，具有促消化、降血糖、抗抑郁、抗氧化、抗炎、抗寄生虫、抑菌等活性[5]。
双水相提取是一种新型的用于提取、分离、纯化的技术，具有操作简单、条件温和、绿色环保等特点[6]。通过双水相提取的天然产物可获得较高的得率和纯度，尤其适用于活性要求高、产物浓度高的天然产物的分离。目前，研究采用超声波技术和微波技术与不同的双水相体系联合起来可快速、简便、高效萃取制备植物多糖，巫永华等[7]利用超声辅助双水相（NH4）2SO4-聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）6000提取牛蒡多糖，LIN等[8]利用微波辅助双水相（NH4）2SO4-乙醇提取香菇多糖，王鑫等[9]采用超声波辅助异丙醇-硫酸铵双水相体系分离甜玉米芯多糖，均取得了良好的效果。
目前，有关槟榔活性成分的研究主要集中于生物碱、多酚、单宁等方面，而多糖方面则鲜见报道；仅有唐敏敏等[10]采用响应面组合设计优化超声波辅助提取未成熟的槟榔籽多糖的工艺研究。超声波辅助双水相体系提取技术用于槟榔多糖的研究未见报道，本研究采用响应面优化超声辅助（NH4）2SO4-乙醇双水相体系提取槟榔多糖的提取参数，优化槟榔多糖的提取条件，并研究其体外抗氧化活性，以期为海南槟榔产业绿色可持续发展提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
槟榔：湖南口味王集团有限责任公司；DPPH试剂、ABTS试剂：上海麦克林生化试剂有限公司；无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；双氧水、过硫酸钾、抗坏血酸：国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。
KQ3200E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；R206旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；Scientz-12N型真空冷冻干燥机：德国CHRIST公司；TU-1810紫外分光光度计：北京普析通用有限公司；L550离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.2 方法
1.2.1 双水相体系的确定
本研究采用（NH4）2SO4-乙醇体系提取槟榔多糖，采用浊度滴定法确定双水相系统图，硫酸铵逐步加入一定体积的乙醇溶液中，记录滴加量[11]。制备30%乙醇溶液600 mL备用，准确称取硫酸铵100 g，按照硫酸铵比乙醇溶液为2∶1（g/mL）加入至30%乙醇中，在电磁搅拌器的作用下，快速溶解硫酸铵20 min，冷却至25℃，可观察到明显的分层现象，上相为乙醇和水，下相为硫酸铵饱和溶液。
1.2.2 槟榔多糖提取率计算
按照苯酚-硫酸显色法绘制葡萄糖标准曲线[12]，将100 mg/L葡萄糖标准溶液稀释为不同浓度的待测液，于490 nm处测定溶液的吸光值，绘制以吸光值为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标的标准曲线，得出的回归方程为y=8.405 7x+0.004 1，R2=0.992 8，线性关系良好。试验提取得到的槟榔多糖，加蒸馏水定容至100 mL，吸取1 mL稀释液，采用苯酚-硫酸法进行测定；利用标准曲线回归方程计算槟榔多糖含量。
1.2.3 超声辅助双水相体系提取槟榔多糖试验设计
1.2.3.1 单因素试验设计
1）不同料液比的提取试验：（NH4）2SO4-乙醇双水相体系组成质量为2∶1，固定超声时间30 min，超声温度 60 ℃，考察料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）对槟榔多糖提取率的影响。
2）不同超声时间的提取试验：固定料液比 1∶30（g/mL），超声温度 60℃，考察超声时间（10、20、30、40、50 min）对槟榔多糖提取率的影响。
3）不同超声温度的提取试验：固定料液比1∶30（g/mL），固定超声时间 30 min，考察超声温度 40、50、60、70、80℃对槟榔多糖提取率的影响。
1.2.3.2 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，选择超声温度、超声时间、料液比为自变量，以多糖提取率为响应值，根据Box-Behnken设计原理，采用响应面分析法进行试验设计，优化超声辅助双水相提取槟榔多糖的工艺，因素与水平设计见表1。
表1 响应面试验设计
Table 1 Independent variables and their levels of response surface design
水平A超声温度/℃B超声时间/minC料液比/（g/mL）-1 50 20 1∶20 0 60 30 1∶30 1 70 40 1∶40
1.2.4 槟榔多糖体外抗氧化活性试验
1.2.4.1 DPPH自由基清除试验
根据Ji等[13]的方法，并稍作修改。用无水乙醇配制0.2 mol/L的DPPH溶液，吸取2 mL不同浓度的槟榔多糖溶液与2 mL DPPH溶液混匀，置于避光处静置30 min，在517 nm处测吸光值，以VC作为阳性对照。按公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（As-Ab）/Ac]×100
式中：As为2 mL样品液与2 mL DPPH溶液的吸光值；Ab为添加2 mL槟榔多糖样品与2 mL 50%乙醇的吸光值；Ac为2 mL去离子水和2 mL DPPH溶液的吸光值。
1.2.4.2 ABTS+自由基清除试验
参照李旭东等[14]的方法，略作修改。配制7.00mol/L的ABTS溶液与2.45 mol/L的过硫酸钾溶液，将两者等体积混合后，置于避光处静置16 h，将其稀释至732 nm处的吸光值为（0.7±0.02）。吸取400 μL不同浓度的样品溶液，与3 mL稀释好的ABTS溶液混匀，置于避光处静置30 min，在732 nm处测吸光值，以VC作为阳性对照。按式计算ABTS+自由基清除率。
ABTS+自由基清除率/%=[1-（As/A0）]×100
式中：As为样品组的吸光值；A0为去离子水代替样品的空白组吸光值。
1.2.4.3 羟基自由基清除试验
参照Chen等[15]的方法，略作修改。取1 mL不同浓度的槟榔多糖溶液于试管中，向各管中加入2 mL硫酸亚铁溶液（3 mmol/L）和1.5 mL水杨酸溶液（1.8 mmol/L）。混匀后，加入0.03%双氧水0.1 mL启动反应，混匀。37℃水浴30 min，在波长510 nm下测定吸光值。以去离子水代替多糖溶液做空白，不同浓度的VC替代多糖样品作为阳性对照。按公式计算羟基自由基清除率。
羟基自由基清除率/%=（A0-Aa）/A0×100
式中：A0为去离子水代替样品的空白组吸光值；Aa为样品组的吸光值。
1.3 数据处理
所有数据均为3次重复试验的平均值，并表示为平均值±标准差，单因素试验数据运用Origin 7.0软件绘制趋势曲线图；响应面试验采用Design-Expert 8.0.6软件进行方差分析，并优化出最佳提取工艺。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 料液比对槟榔多糖提取率的影响
料液比对槟榔多糖提取率的影响见图1。
图1 料液比对槟榔多糖提取率的影响
Fig.1 Effects of material-to-solvent ratio on polysaccharide yield
由图 1 可知，在料液比为 1∶10（g/mL）时，由于提取溶剂相对较少，溶液黏度较高而不利于植物多糖的扩散，多糖提取率较低；随着提取溶剂含量的增加，细胞内外多糖浓度出现较大差异，内高外低，槟榔多糖不断向外扩散，提取率显著提高。随着提取溶剂的进一步增大，在超声作用下多糖的凝聚作用减弱，多糖开始部分降解，提取率出现下降趋势，提取溶剂过多还会增加后期浓缩和醇沉的能耗与工作量，增加槟榔多糖的提取成本。因此，选择料液比为1∶30（g/mL）进行响应面优化。
2.1.2 超声时间对槟榔多糖提取率的影响
超声时间对槟榔多糖提取率的影响见图2。
图2 超声时间对槟榔多糖得率的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic power time on polysaccharide yield
由图2可知，在10 min～30 min之间，槟榔多糖的提取率随着超声时间的延长快速升高，30 min之后多糖的提取率逐渐下降。这可能是在刚开始提取时，槟榔多糖没有充分溶解在提取溶剂中；随着超声时间的延长，槟榔与提取溶剂接触面积逐步变大，且超声波的空穴效应促进槟榔多糖的快速传递，促使提取率快速上升[16]。但提取一定时间后，槟榔多糖基本溶出完全，提取率不再变化，较长时间的超声处理，使得部分多糖糖苷键断裂和降解，提取率出现一定的下降趋势[17]。因此，选择超声时间为30 min进行响应面优化。
2.1.3 超声温度对槟榔多糖提取率的影响
温度过低时，分子运动速度较慢，植物多糖无法充分溶出；当温度升高，分子运动速率加快，植物多糖溶解度增加[18]。超声温度对槟榔多糖提取率的影响见图3。
图3 超声温度对槟榔多糖提取率的影响
Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on polysaccharide yield
由图3可知，槟榔多糖的提取率随着超声温度的升高呈现先增加后略降低的趋势。这是因为随着超声温度的升高，使槟榔多糖溶出的速度加快，提取率显著提高。但当超声温度过高时，槟榔多糖糖苷键结构遭到部分破坏，产生降解作用，槟榔多糖提取率出现略下降趋势[19]。因此，选择超声温度为60℃进行响应面优化。
2.2 槟榔多糖提取工艺条件的优化
2.2.1 模型方程建立与显著性检验
利用Design-Expert软件对超声温度（A）、超声时间（B）、料液比（C）3个因素对槟榔多糖提取率（Y）为响应值进行试验设计，得到的响应面试验设计分析结果如表2所示（实测值为3次平行试验结果的平均值），利用Design-Expert 8.0.6软件分析处理试验数据，可以得到回归方程为Y=3.79-0.007A+0.12B+0.037C+0.20AB+0.007 5AC-0.32BC+0.26A2+0.019B2+0.074C2。
表2 响应面试验设计及试验结果
Table 2 Experimental design and results of the response surface methodology
试验 A超声温度 B超声时间 C料液比 提取率/%1 0 0 0 3.51 2 4.08 3 1 -1 0 3.64 4 0-1 1 4.13 5 0 1 1 3.68 0 0 0 6 -1 0 -1 4.16 7 0 0 0 3.63 8 -1 -1 0 4.20 9 0-1 -1 3.44 10 0 0 0 3.84 11 1 0 -1 3.99 12 -1 1 0 4.10 13 1 1 0 4.35 14 0 0 0 4.89 15 1 0 1 4.11 16 -1 0 1 4.25 17 0 1 -1 4.28
根据回归模型方程进行方差分析结果见表3。
表3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equations
注：P<0.05差异显著；P<0.01差异极显著。
变异来源 平方和SS 自由度 均方（MS） F值 P值模型 1.10 9 0.12 4.09 0.038 4 A超声温度 0.048 1 0.048 1.61 0.244 6 B超声时间 0.12 1 0.12 4.20 0.079 7 C料液比 0.011 1 0.011 0.38 0.558 2 AB 0.16 1 0.16 5.51 0.051 3 AC 0.000 225 1 0.000 225 0.007.556 0.933 2 BC 0.42 1 0.42 13.97 0.007 3 A2 0.29 1 0.29 9.84 0.016 5 B2 0.001 480 1 0.001 480 0.050 0.829 9 C2 0.023 1 0.023 0.77 0.409 6残差 0.21 7 0.030失拟项 0.007 853 3 0.002 617 0.052 0.982 1纯误差 0.20 4 0.050总值 1.30 16
由表3方差分析可以看出，该回归模型P=0.038 4<0.05），说明回归模型具有统计学差异，失拟项P=0.9821>0.05，差异不显著，因此试验中未知因素对试验结果干扰较小，残差均由随机误差所引起。该模型的相关系数R2=0.840 2，表明有84.02%的试验值可用预测值来代替，说明该模型拟合度好，试验误差小，可以用于响应值的预测。根据F值可看出，影响因子的主效应主次顺序为超声时间>超声温度>料液比。交互项BC、二次项A2对试验结果有影响（P<0.05），说明各工艺条件与提取率之间不是简单的线性关系，而是一种非线性关系。综上所述，该模型拟合度高，可用该回归模型来描述各工艺参数与响应值之间的真实关系。
2.2.2 响应面交互作用影响结果
等高线图、响应面图可以直观地反映两因素之间的交互作用。响应面图越陡说明两自变量的交互作用对响应值影响程度越大；相反，越平缓交互作用影响越不显著。等高线图越偏离圆形，交互影响越强；反之，越接近圆形，交互影响越弱。通过Box-Behnken试验得到的多元回归模型所作的响应曲面图见图4。
图4 各因素交互作用的响应面和等高线图
Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of different extraction parameters on the yield
从图4可知，主次因素顺序为超声时间＞超声温度>料液比；且交互项BC作用显著，这与方差结果一致。
2.2.3 最优条件的确定与回归模型的验证
通过试验分析，确定超声辅助双水相提取槟榔多糖的最佳提取工艺为当超声温度为69.54℃，超声时间为 40.54 min，料液比为 1∶19.96（g/mL）时，此条件下槟榔多糖提取率为4.67%。考虑到实际操作的简便性和可行性，将提取条件调整为超声温度70℃，超声时间为 40 min，料液比为 1∶20（g/mL），此工艺条件下进行超声辅助双水相提取槟榔多糖，试验重复3次取平均值，得率为（4.52±0.25）%。结果与预测值误差较小，表明优化后的工艺条件准确可靠，具有一定的应用价值。
2.3 体外抗氧化试验结果与分析
2.3.1 DPPH自由基清除能力
槟榔多糖的DPPH自由基清除能力见图5。
图5 槟榔多糖的DPPH自由基清除能力
Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of ACPs
由图5可知，槟榔多糖及VC对DPPH自由基清除能力随浓度增加而增强，并且呈现一定的剂量效应关系，在浓度为1.0 mg/mL时，槟榔多糖的DPPH自由基清除率达到35.14%，低于1.0 mg/mL VC91.75%的清除率；当槟榔多糖浓度为2.5 mg/mL时，自由基清除率达到50.86%，这高于蔡延渠等[20]提取的桃胶多糖的抗氧化能力。在本试验测试的浓度范围内，尽管槟榔多糖的DPPH自由基清除率不如VC强，但仍具有一定的清除能力，可作为天然抗氧化剂应用。
2.3.2 ABTS+自由基清除能力
ABTS+·是一种稳定的有机自由基，通过ABTS原液与过硫酸钾在室温（25℃）黑暗中反应12 h～16 h产生，在外来抗氧化剂存在的情况下，ABTS+·将会减少。通过测定反应液在732 nm波长处吸光值的变化，可得到植物多糖对ABTS+·的清除效果[21]。
由图6可知，在浓度0～2.0 mg/mL范围内，槟榔多糖和VC随着溶液浓度的增加，对ABTS+自由基的清除率先增大后趋于稳定，其中当浓度大于2.0 mg/mL槟榔多糖对ABTS+自由基的清除率趋于平缓，基本保持在40%左右。
图6 槟榔多糖的ABTS+自由基清除能力
Fig.6 ABTS+free radical scavenging ability of ACPs
2.3.3 羟基自由基清除能力
·OH是活性最强、毒性最大的自由基，可以与活细胞中分子发生反应造成损害，且反应速度快，被破坏的分子涉及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等[22]。槟榔多糖的对羟基自由基清除能力见图7。
图7 槟榔多糖对羟基自由基清除能力
Fig.7·OH free radical scavenging ability of ACPs
由图7可知，在浓度0～2.0 mg/mL范围内，槟榔多糖随着浓度的增加，·OH清除率逐渐增强；槟榔多糖溶液浓度从0.5 mg/mL增加到2.5 mg/mL，·OH的清除率从20.32%增加到46.86%。
3 结论
采用超声辅助双水相体系结合响应面优化法建立了槟榔多糖提取率的二次多项式数学模型，在（NH4）2SO4乙醇的质量比为2∶1时，双水相体系最佳；优化出槟榔多糖提取的最佳工艺条件为料液比1∶20（g/mL），超声温度 70℃，超声时间 40 min，槟榔多糖的提取率达到（4.52±0.25）%。3种体外抗氧化试验的结果均显示槟榔多糖具有较好的抗氧化活性，可作为潜在的天然抗氧化剂应用于功能性食品等领域，但槟榔多糖体内抗氧化活性的相关机制有待于进一步研究。
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