肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）是肉豆蔻科肉豆蔻属植物的成熟种仁，可除异味、增辛香，常作为调味料用于肉品的卤制和酱肉的加工中[1]。同时，肉豆蔻也是我国常用的中药材之一，其生理功能包括抑菌、抗癌、降血糖、抗衰老、保护肝脏等，而这些生理功能都与肉豆蔻含有的多种抗氧化活性物质有关[2-3]。
黄酮类化合物主要是指具有2-苯基色原酮结构的化合物，是一种多酚类植物次级代谢产物，因其具有多种较好的生理功能而备受关注[4-5]。黄酮类化合物的提取方式主要包括碱溶酸沉法、超声辅助提取法、酶解法等，其中超声辅助提取法是通过超声波产生的机械破碎作用、空化效应以及热效应破坏细胞结构，进而加快细胞内含物释放的一种提取技术，具有提取率高、耗时少、提取物结构不易被破坏等优点，被广泛运用于黄酮类化合物的提取中[6-8]。目前，国内外对于肉豆蔻的研究主要集中在对其挥发油[9]、木脂素[10]、多酚[11]等的提取及成分分析，关于肉豆蔻中总黄酮的提取及抗氧化活性的研究却鲜有报道。
本研究拟采用超声辅助法对肉豆蔻总黄酮进行提取，并以总黄酮得率为评价指标，利用单因素试验和响应面试验确定提取工艺的最佳参数。最后利用Fenton反应法、邻苯三酚自氧化法和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼比色法分别评价肉豆蔻总黄酮对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）和 DPPH 自由基的清除能力，以期为肉豆蔻的多方向利用和功能活性的研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
肉豆蔻：市售，4℃保藏备用。
芦丁标准品：苏州天可贸易有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝：邹平天鹿化工有限公司；无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、盐酸、邻苯三酚、氢氧化钠、无水碳酸钠（均为分析纯）：天津市德恩化学试剂有限公司；过氧化氢、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均为分析纯）：洛阳昊华化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（FA2004B型）：上海精密科学仪器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020型）：南京优丰干燥设备有限公司；高速多功能粉碎机（DFY-400C型）：温岭市林大机械有限公司；紫外分光光度计（756PC型）：湖南力辰仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线的制作
参考陈苏丹等[12]的方法，准确称取10 mg芦丁标准品，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。依次吸取上述标准液0、1、2、3、4、5 mL 于试管中，向其中加入 5%NaNO2溶液及10%Al（NO3）3溶液各0.5 mL，摇匀后反应6 min，随后加入4%NaOH溶液4 mL，混合均匀，并用70%乙醇定容至10 mL，在25℃下静置15 min后，于510 nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作芦丁标准曲线，所得标准曲线方程为y=0.180 2x-0.054 1（R2=0.974 7）。
1.3.2 肉豆蔻总黄酮提取及含量测定
精密称取10 g经干燥粉碎后的肉豆蔻粉末，按一定的乙醇浓度、超声温度、超声时间、料液比进行提取，抽滤后得到肉豆蔻总黄酮提取液，按标准曲线相同操作测定肉豆蔻总黄酮的吸光度，利用标准曲线方程计算出提取液中总黄酮的浓度，并利用下面公式计算肉豆蔻总黄酮的得率。
W/%=C×V/M×100
式中：W为肉豆蔻总黄酮得率，%；C为总黄酮的浓度，mg/mL；V为滤液体积，mL；M为肉豆蔻质量，mg。
1.3.3 单因素试验
以总黄酮得率为指标，采用控制变量法考察乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、超声温度（60、70、80、90、100 ℃）、超声时间（20、30、40、50、60 min）和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]对肉豆蔻总黄酮得率的影响。
1.3.4 响应面试验设计
以单因素试验为基础，以肉豆蔻总黄酮得率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6.1软件设计四因素三水平响应面试验，优化肉豆蔻总黄酮提取工艺，试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平 A乙醇浓度/%D料液比/（g/mL）-1 70 70 40 1∶30 0 80 80 50 1∶40 1 90 90 60 1∶50 B超声温度/℃C超声时间/min
1.3.5 抗氧化活性试验
分别配制浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的肉豆蔻总黄酮提取液，以相同浓度的VC作为阳性对照，采用Fenton反应法[13]、邻苯三酚自氧化法[14]和DPPH比色法[15]测定其对·OH、O2-·和DPPH 自由基的清除率，从而评价肉豆蔻总黄酮的抗氧化活性。
1.4 数据分析
采用Office2010对所得数据进行处理，利用Design-Expert 8.0.6.1软件进行响应面分析，每组试验重复3次并取平均值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对肉豆蔻总黄酮得率的影响
选取乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%，分析乙醇浓度对肉豆蔻总黄酮得率的影响，结果如图1所示。
图1 乙醇浓度对肉豆蔻总黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg
由图1可知，肉豆蔻总黄酮得率随着乙醇浓度的升高先增大后缓慢减小，且当乙醇浓度为80%时，肉豆蔻总黄酮的得率最高。这是由于总黄酮类物质的溶出与提取溶剂的极性有关，随着乙醇浓度的升高，肉豆蔻总黄酮与乙醇的极性逐渐接近，总黄酮类物质溶出增多。但是乙醇浓度过高，溶剂极性减小，阻碍了部分黄酮苷的溶解，并且造成其它醇溶性杂质及色素等物质的大量溶出，从而加速了其它物质与总黄酮类物质的溶出竞争[16]，总黄酮得率有所下降。因此乙醇的最适浓度为80%。
2.1.2 超声温度对肉豆蔻总黄酮得率的影响
选取超声温度为 60、70、80、90、100 ℃，分析超声温度对肉豆蔻总黄酮得率的影响，结果如图2所示。
图2 超声温度对肉豆蔻总黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg
由图2可知，随着超声温度的增加，肉豆蔻总黄酮得率先增大后减小，且当超声温度为80℃时，总黄酮得率最高。这是因为温度的升高加快了分子间的运动，总黄酮类物质在提取溶剂中的扩散、溶解能力增强，溶出量增多。然而温度过高时，提取溶剂挥发加剧，乙醇浓度降低，影响提取效果。此外，过高的温度容易破坏总黄酮物质结构，同时加速了黄酮醇类等物质的分解速率及其它黄酮类化合物的氧化、缩合、降解等反应[17-18]，总黄酮得率下降。因此最佳超声温度为80℃。
2.1.3 超声时间对肉豆蔻总黄酮得率的影响
选取超声时间为 20、30、40、50、60 min，分析超声时间对肉豆蔻总黄酮得率的影响，结果如图3所示。
图3 超声时间对肉豆蔻总黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg
由图3可知，肉豆蔻总黄酮的得率随着超声时间的延长先增大后减小，且当超声时间为50 min时，总黄酮得率最高。这可能是黄酮类化合物大多存在于肉豆蔻的细胞膜中，在超声波的作用下，植物细胞结构被破坏，分子运动速率加快，总黄酮类物质不断溶出，总黄酮得率增加[19]。但是超声时间过长，其产生的机械作用和空化效应会对总黄酮结构造成一定程度的破坏，从而导致总黄酮得率下降[20]。因此，超声时间以50 min为宜。
2.1.4 料液比对肉豆蔻总黄酮得率的影响
选取料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL），分析料液比对肉豆蔻总黄酮得率的影响，结果如图4所示。
图4 料液比对肉豆蔻总黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg
由图4可知，随着溶剂用量的增加，肉豆蔻总黄酮的得率逐渐增加，且当料液比为1∶40（g/mL）时达到最高，之后逐渐趋于稳定。这是由于增大溶剂用量，肉豆蔻粉末与提取溶剂能够充分接触，有利于总黄酮类物质从肉豆蔻内部向溶剂中扩散，总黄酮得率提高。但是当料液比达到一定程度时，总黄酮类物质已基本溶出，此时若继续增加溶剂用量，不仅容易造成杂质的溶解，还会增加溶剂成本[21]。因此，最佳的料液比为1∶40（g/mL）。
2.2 响应面优化结果与分析
2.2.1 响应面优化试验结果
结合单因素试验结果，以肉豆蔻总黄酮得率为响应值，利用响应面试验对肉豆蔻总黄酮的提取工艺进行优化，其试验设计与结果如表2所示，在此基础上进一步对回归模型进行方差分析，结果如表3所示。
表2 响应面试验结果
Table 2 Response surface test results
试验号 A B C D 总黄酮得率/%1 0 -1 0 1 1.34 2 0 0 0 0 2.47 3 1 0 0 1 1.94 4 -1 1 0 0 1.84 5 0 0 -1 1 1.49 6 -1 0 0 1 1.35 7 0 1 1 0 1.92 8 0 1 1 0 2.07 9 1 0 1 0 2.43 10 0 0 -1 -1 1.91 11 1 1 0 0 1.64 12 0 1 0 -1 1.76 13 0 -1 1 0 1.32 14 1 0 0 -1 0.87 15 -1 0 -1 0 1.91 16 0 -1 0 -1 1.23 17 1 0 -1 0 1.86 18 1 -1 0 0 1.45 19 0 1 -1 0 1.27
续表2 响应面试验结果
Continue table 2 Response surface test results
试验号 A B C D 总黄酮得率/%20 0 -1 -1 0 1.62 21 -1 0 0 -1 2.36 22 0 0 0 0 2.31 23 0 0 1 -1 1.42 24 0 0 0 0 2.45 25 0 1 0 1 1.14 26 0 0 0 0 2.48 27 -1 -1 0 0 1.59 28 0 0 1 1 2.03 29 -1 0 1 0 1.95
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
注：**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 5.25 14 0.38 20.16 <0.000 1 **A 0.11 1 0.11 6.13 0.026 7 *B 0.087 1 0.087 4.66 0.048 *C 0.035 1 0.035 1.89 0.190 6 D 5.633×10-3 1 5.633×10-3 0.30 0.590 9 AB 9.000×10-4 1 9.000×10-40.048 0.829 1 AC 7.225×10-3 1 7.225×10-3 0.39 0.543 3 AD 1.08 1 1.08 58.11 <0.000 1 **BC 0.23 1 0.23 12.12 0.003 7 **BD 0.13 1 0.13 7.16 0.018 1 *CD 0.27 1 0.27 14.25 0.002 0 **A2 0.40 1 0.40 21.25 0.000 4 **B2 2.22 1 2.22 119.54<0.000 1 **C2 0.42 1 0.42 22.56 0.000 3 **D2 1.59 1 1.59 85.62 <0.000 1 **残差 0.26 14 0.019失拟项 0.24 10 0.024 5.12 0.064 7不显著纯误差 0.019 4 4.700×10-3总和 5.51 28
使用响应面分析软件对表2试验数据进行回归拟合，得到以总黄酮得率为响应值的回归方程：Y=2.43-0.097A+0.085B+0.054C-0.022D-0.015AB+0.042AC+0.52AD+0.24BC-0.18BD+0.26CD-0.25A2-0.59B2-0.25C2-0.50D2。
由表3可知，模型极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），说明该模型误差小。R2值为 0.952 7，R2adj值为0.905 5，CV为7.69%，说明模型拟合度良好，进一步说明该模型的可靠性，并可将其用于肉豆蔻总黄酮得率的预测和分析。显著性分析检验结果显示，AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2项对总黄酮得率均有极显著影响，A、B、BD 项对肉豆蔻总黄酮得率影响显著，C、D、AB、AC项对肉豆蔻总黄酮得率影响不显著。根据F值可知，4个因素对肉豆蔻总黄酮得率的影响顺序为乙醇浓度（A）>超声温度（B）>超声时间（C）>料液比（D）。
2.2.2 各因素交互作用的响应面图分析
为考察各因素交互作用对肉豆蔻总黄酮得率的影响，通过Design-Expert 8.0.6.1软件绘制相应的响应面图，结果如图5所示。
图5 各因素交互作用对肉豆蔻总黄酮得率影响的响应面图
Fig.5 Response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg
响应曲面的陡峭程度可以反映各因素值的变化对于响应值的影响大小。由图5可知，交互项AD（图5c）、CD（图 5f）、BC（图 5d）和 BD（图 5e）的响应曲面坡度较为陡峭，且等高线呈椭圆形或马鞍形，说明乙醇浓度与料液比、超声时间与料液比、超声温度与超声时间、超声温度与料液比的交互作用均显著，对肉豆蔻总黄酮得率的影响较大；而其它项的响应曲面图坡度较平缓，表明其交互作用不显著，这与表3中回归方程的方差分析结果一致。
2.2.3 验证性试验
根据响应面回归模型预测可得肉豆蔻总黄酮的最佳提取工艺参数为乙醇浓度73.73%，超声温度81.25℃，超声时间 49.11 min，料液比 1∶36.03（g/mL），此时肉豆蔻总黄酮得率预测值为2.466%。为方便试验操作，确定其最终提取工艺条件为乙醇浓度74%，超声温度81 ℃，超声时间 49 min，料液比 1∶36（g/mL），并在此最优组合下进行3次平行验证试验，得到肉豆蔻总黄酮得率平均值为2.503%，与预测值相近，进一步证明了该模型的可信性。
2.3 肉豆蔻总黄酮的抗氧化活性
2.3.1 肉豆蔻总黄酮对·OH的清除作用
以VC为阳性对照，肉豆蔻总黄酮对·OH的清除率结果如图6所示。
图6 肉豆蔻总黄酮对·OH的清除率
Fig.6 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for·OH
由图6可知，肉豆蔻总黄酮对·OH的清除率随着其浓度的增加呈上升趋势，当肉豆蔻总黄酮浓度达到0.5 mg/mL时，其对·OH的清除率为85.78%，略低于同浓度下的VC对·OH的清除能力。这是由于黄酮化合物含有具备供氢及供电子能力的酚羟基、C4酮羰基等结构，其提供的氢原子能与·OH结合，终止自由基的氧化损伤反应，从而达到清除·OH的效果[22]。
2.3.2 肉豆蔻总黄酮对O2-·的清除作用
O2-·活泼性较强，与机体的氧化损伤有着密切的联系，是评价抗氧化活性的一项重要指标。不同浓度的肉豆蔻总黄酮与VC对O2-·清除率的测定结果如图7所示。
图7 肉豆蔻总黄酮对O2-·的清除率
Fig.7 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for O2-·
由图7可知，随着肉豆蔻总黄酮浓度的增加，其对O2-·的清除率也不断增加，且0.5 mg/mL的肉豆蔻总黄酮对O2-·的清除率为88.31%，与同浓度的VC相比，其清除能力略低。然而由于VC本身是一种强氧化剂，因此可认定肉豆蔻总黄酮具有较好的清除O2-·的能力。
2.3.3 肉豆蔻总黄酮对DPPH自由基的清除作用
不同浓度的肉豆蔻总黄酮和VC对DPPH自由基的清除率结果如图8所示。
图8 肉豆蔻总黄酮对DPPH自由基的清除率
Fig.8 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for DPPH free radical
由图8可知，肉豆蔻总黄酮对DPPH自由基的清除率随着其浓度的升高而不断增加，且0.5 mg/mL的肉豆蔻总黄酮对DPPH自由基的清除率为92.31%，与等浓度的VC对DPPH自由基的清除能力相近，可见肉豆蔻总黄酮对DPPH自由基具有较强的清除能力。
3 结论
本研究探讨了肉豆蔻总黄酮的最佳超声辅助提取工艺参数及其抗氧化活性。结果表明，肉豆蔻总黄酮的最佳提取工艺参数为乙醇浓度74%、超声温度81 ℃、超声时间 49 min、料液比 1∶36（g/mL），在此工艺条件下，肉豆蔻总黄酮的得率为2.503%。此外，抗氧化试验结果显示，0.5 mg/mL的肉豆蔻总黄酮对·OH、O2-·和DPPH自由基的清除率分别为85.78%、88.31%和92.31%，略低于同浓度的VC的抗氧化能力，但仍表现出较好的抗氧化活性。然而本试验也有不足之处，如试验得到的肉豆蔻总黄酮仅为粗提物，还需进一步的纯化才能发挥更好的功效，提取物中具体的组成成分及其它的功能活性也需深入研究。
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