竹叶在我国拥有悠久的食用和药用历史，是国家认可并批准的药食两用植物[1]。古人对竹叶研究颇多，在食用方面，竹叶茶、竹叶酒等产品已有数百年历史。药用方面，古医书中关于竹叶的记载很多。《药性论》中记载竹叶主吐血热毒风，止消渴；《食疗本草》中记载竹叶主咳逆、消渴、痰饮、喉痹、除烦热；《本草纲目》中记载竹叶煎浓汁，漱齿中出血，洗脱肛不收[2]。现代研究表明，竹叶中含有黄酮及其甙类、活性多糖及其衍生物等活性物质，富含锰、锌、硒、锗、硅等多种能活化人体细胞的元素，以及醛、醇为主的芳香成分等[3-4]。
竹叶黄酮主要是碳苷黄酮，包括荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷4类[5]。天然来源黄酮具有抑菌、抗氧化、解毒、抗光敏及增强免疫力等作用[6-7]。因具有清除皮肤中自由基、避免细胞损伤、促进皮肤新陈代谢、提升皮肤弹性、减少色素沉着等功效，从而可以达到美白效果[7-9]。现阶段关于竹叶中黄酮的提取方法主要有溶剂提取法（水、乙醇、甲醇、丙酮等）、微波或超声波辅助提取法、超临界CO2萃取法、酶提取法等[9]。王紫薇等[10]利用超声波辅助乙醇提取淡竹叶中的黄酮类物质，提取率为2.11%。史娟等[11]采用超声波预处理-乙醇回流法提取汉中毛竹叶黄酮类物质，提取率最高为2.92%。王文渊等[12]采用纤维素酶辅助提取竹叶中黄酮，提取率可达4.21%。
方竹[Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino]笋肉质地脆嫩，味道鲜美，受到广大消费者欢迎。近年来方竹在贵州省内的种植面积不断增加，但关于方竹叶加工和方竹叶黄酮提取利用的研究较少。本研究以方竹叶为原料，通过对比乙醇提取法、纤维素酶提取法、超声辅助乙醇提取法、振荡辅助乙醇提取法4种不同提取方式对方竹叶黄酮提取率的影响，对比4种提取方式所得黄酮体外抗氧化能力，确定最优的方竹叶黄酮提取工艺，为方竹叶的进一步开发利用提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
方竹叶：贵州省林业科学研究院提供，在60℃烘箱中烘干 10 h，使含水量达到（12.0±0.5）%；芦丁标准品（≥98%）、纤维素酶（3 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸铝、三氯化铁、三氯醋酸、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
UV-6000型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；G-040s型超声波清洗机：深圳市歌能清洗设备有限公司；HHS型数显恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；HS-7型磁力搅拌器：德国IKA公司。
1.2 方竹叶黄酮提取方法
1.2.1 乙醇提取法
称取粉碎后的方竹叶粉1.0 g，按照如下条件确定乙醇提取法较优工艺条件。1）固定乙醇浓度70%，设定料液比为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）。2）固定料液比为 1∶25（g/mL），设定乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。制作好的样品在室温（25℃）条件下用磁力搅拌器搅拌提取60 min，用滤纸过滤，测定滤液中的黄酮含量，计算黄酮提取率。
1.2.2 纤维素酶提取法
称取粉碎后的方竹叶粉1.0 g，按照如下条件确定纤维素酶提取法较优工艺条件。1）固定纤维素酶添加量0.6%，设定料液比为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）。2）固定料液比为 1∶25（g/mL），设定纤维素酶添加量为0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。后续步骤同1.2.1。
1.2.3 超声辅助乙醇提取法
1.2.3.1 单因素试验
根据1.2.1中确定的较优乙醇提取工艺参数，分别考察超声时间、超声功率、超声温度对方竹叶黄酮提取率的影响。设置超声辅助乙醇提取的单因素试验条件如下。
1）固定超声温度40℃，超声功率40 W，设定超声时间为 20、40、60、80、100、120 min。
2）固定超声温度40℃，超声时间100 min，设定超声功率为 20、40、60、80、100 W。
3）固定超声功率40 W，超声时间100 min，设定超声温度为 30、35、40、45、50、55、60 ℃。
1.2.3.2 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，选择A超声时间、B超声温度、C超声功率进行响应面优化试验，优化超声辅助乙醇提取方竹叶黄酮的提取工艺。响应面因素水平见表1。
表1 响应面优化因素水平
Table 1 Factors and levels of the response surface optimization
水平 因素A超声时间/min B超声温度/℃ C超声功率/W-1 80 50 60 0 100 55 80 1 120 60 100
1.2.4 振荡辅助乙醇提取法
1.2.4.1 单因素试验
根据1.2.1中确定的较优乙醇提取工艺参数，分别考察振荡时间、振荡温度、振荡频率对方竹叶黄酮提取率的影响。设置振荡辅助乙醇提取的单因素试验条件如下。
1）固定振荡温度40℃，振荡频率150 r/min，设定振荡时间为 30、60、90、120、150、180 min。
2）固定振荡温度40℃，振荡时间120 min，设定振荡频率为 100、150、200、250、300 r/min。
3）固定振荡频率150 r/min，振荡时间120 min，设定振荡温度为 30、35、40、45、50、55、60 ℃。
1.2.4.2 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，选择E振荡时间、F振荡温度、G振荡频率进行响应面优化试验，优化振荡辅助乙醇提取方竹叶黄酮的提取工艺。响应面因素水平见表2。
表2 响应面优化因素水平
Table 2 Factors and levels of the response surface optimization
水平 因素E振荡时间/minF振荡温度/℃G振荡频率/（r/min）-1 90 50 200 0 120 55 250 1 150 60 300
1.3 黄酮含量及提取率测定
用30%乙醇配制0.2 mg/mL芦丁标准溶液，分别移取 0、1、2、3、4、5 mL 上述芦丁标准溶液，依次加入到25 mL容量瓶中，用30%乙醇稀释至12.5 mL，加入1 mL 5%亚硝酸钠，摇匀并静置5 min；然后加入1 mL 10%硝酸铝，摇匀并静置6 min；最后加入10 mL 1 mol/mL氢氧化钠，用30%乙醇定容至刻度，摇匀后置于80℃水浴锅中水浴加热10 min，以空白溶液作为对照，在510 nm处测定样品溶液吸光值[13]。以芦丁标准溶液浓度为横坐标x，吸光值为纵坐标y，制作标准曲线为y=1.754x-0.005 1，r2=0.999 1。取方竹叶提取液1 mL，按照上述步骤操作，所有样品平行测定3次，取A510的平均值，代入标准曲线计算相应的黄酮含量。
方竹叶黄酮提取率按如下公式计算。
式中：W为方竹叶黄酮提取率，%；W1为方竹叶提取液中的黄酮质量，g；W2为方竹叶粉末质量，g。
1.4 抗氧化活性测定
1.4.1 DPPH自由基清除率测定
配制79 mg/L的DPPH-乙醇溶液，低温避光保存备用。将1.2中不同提取方法得到的方竹叶黄酮提取液用乙醇溶液配制成质量浓度分别为200、400、600、800、1 000 μg/mL的溶液。分别取0.5 mL不同质量浓度的样液，加入5.0 mL DPPH-乙醇溶液，摇匀后置于37℃水浴中反应1 h，以乙醇为空白对照（A空白），在波长为517 nm处测定样品溶液吸光值（A样品）[14-15]，DPPH自由基清除率按如下公式计算。
1.4.2 还原力测定
取2.5 mL的磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾混匀，分别移取1 mL 1.2中4种不同提取方法所得不同质量浓度的黄酮提取液加入反应体系内，摇匀后置于50℃水浴中20 min。流水快速冷却，然后分别加入2.5 mL 10%三氯醋酸终止反应，3 000 r/min离心10 min，离心后取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，摇匀后静置10 min，在波长700 nm处测定样品溶液吸光值[16-17]。
1.5 数据处理
采用Origin（Version 8.6）作图，Design-Expert（Version 8.0）进行响应面分析，SPSS（Version 17.0）进行统计学分析，p<0.05认为有统计学显著性差异，p<0.01认为有统计学极显著性差异。
2 结果与分析
2.1 乙醇提取工艺优化结果
不同料液比和乙醇浓度对方竹叶黄酮提取率的影响结果见图1。
图1 不同料液比和乙醇浓度对方竹叶黄酮提取率的影响
Fig.1 Effects of solid-liquid ratio and ethanol concenration on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves
A.料液比；B.乙醇浓度；图中不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图 1A 可知，料液比由 1∶10（g/mL）变化到 1∶25（g/mL），黄酮提取率显著升高（p<0.05），在料液比为1∶25（g/mL）时达到最大值（2.07%），之后黄酮提取率随提取溶剂增加显著下降（p＜0.05）。当提取溶剂较少时，原料浸润不完全，从而导致提取率较低；而溶剂过多则会增加提取能耗，在同等提取能耗条件下黄酮类物质提取不充分导致提取率降低，且溶剂过多会造成资源浪费[18]。由图1B可知，随着乙醇浓度增加，黄酮提取率呈先显著升高后显著下降的趋势（p＜0.05），在乙醇浓度为80%时黄酮提取率达到最大值（2.41%）。张春娟[19]研究表明，方竹叶黄酮主要为荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷4种黄酮碳苷，易溶于70%～80%的乙醇溶液，当乙醇浓度超过80%时，某些醇溶性杂质、色素等成分溶出量增加，与4种黄酮碳苷竞争乙醇溶液结合部位，导致黄酮提取率下降。综上所述，方竹叶黄酮乙醇提取工艺较优的料液比为1∶25（g/mL），较优的乙醇浓度为80%。
2.2 纤维素酶提取工艺优化结果
不同料液比和纤维素酶添加量对方竹叶黄酮提取率的影响结果见图2。
图2 不同料液比和纤维素酶添加量对方竹叶黄酮提取率的影响
Fig.2 Effects of solid-liquid ratio and cellulase addition amount on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves
A.料液比；B.纤维素酶添加量；图中不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图2A可知，随着溶剂增加，黄酮提取率显著升高（p＜0.05），在料液比为 1∶25（g/mL）时达到最大值（1.51%），之后随着溶剂增加显著下降（p＜0.05）。由图2B可知，随着纤维素酶添加量增加，黄酮提取率显著升高（p＜0.05），在纤维素酶添加量为0.4%时黄酮提取率达到最大值（1.51%），之后随着纤维素酶添加量继续升高，黄酮提取率基本保持不变。纤维素酶能够破坏方竹叶细胞壁，使黄酮类物质溶出，当纤维素酶添加量较少时，酶与底物充分接触，黄酮提取率升高；当纤维素酶添加过量时，底物不足，所以黄酮提取率基本保持不变[20-21]。综上所述，方竹叶黄酮纤维素酶提取工艺较优的料液比为1∶25（g/mL），较优的纤维素酶添加量为0.4%。
2.3 超声辅助乙醇提取工艺优化结果
2.3.1 单因素试验结果
超声时间、超声温度和超声功率对方竹叶黄酮提取率的影响见图3。
图3 超声时间、超声温度和超声功率对方竹叶黄酮提取率的影响
Fig.3 Effects of ultrasonic time，ultrasonic temperature and ultrasonic power on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves
A.超声时间；B.超声温度；C.超声功率；图中不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图3A可知，随着超声时间延长，黄酮提取率显著升高（p<0.05），在超声时间为100 min时达到2.76%，之后随着超声时间继续延长黄酮提取率变化不显著。由图3B可知，超声温度在55℃时提取率最高（3.30%），超声温度过高或过低都会造成提取率降低。温度升高会加速方竹叶中黄酮类物质溶出，但过高的温度会造成方竹叶中活性成分被破坏，从而导致提取率降低[22-23]。由图3C可知，增大超声功率会使黄酮提取率显著升高（p<0.05），在超声功率为80 W时，黄酮提取率达到3.02%，之后随着超声功率继续增大提取率变化不显著。综上所述，超声辅助乙醇提取法较优的提取工艺条件为超声时间100 min，超声温度55℃，超声功率80 W。
2.3.2 响应面优化试验结果
2.3.2.1 响应面优化设计与结果
以Box-Behnken中心组合设计原则，选取超声时间（A）、超声温度（B）、超声功率（C）为自变量，以黄酮提取率为响应值，设计三因素三水平响应面试验优化超声辅助乙醇提取工艺，试验方案及结果如表3所示。
表3 响应面优化试验方案及结果
Table 3 Experimental scheme and results of response surface optimization
试验号 A超声时间/min Y黄酮提取率/%1 100 55 80 3.98 2 100 55 80 4.04 3 100 55 80 3.96 4 120 55 60 3.82 5 120 50 80 3.76 6 80 60 80 3.42 7 100 60 100 3.71 8 80 55 60 3.47 9 120 60 80 3.89 10 100 55 80 4.07 11 100 50 100 3.49 12 100 60 60 3.41 13 80 55 100 3.59 14 100 55 80 3.98 15 100 50 60 3.48 16 120 55 100 4.04 17 80 50 80 3.33 B超声温度/℃C超声功率/W
2.3.2.2 回归方程与显著性分析
利用Design-Expert 8.0软件对表3试验数据进行二次多项式逐步回归拟合，得回归模型方程为Y=4.01+0.21A+0.05B+0.08C+0.01AB+0.03AC+0.07BC-0.10A2-0.31B2-0.18C2。
回归模型方差分析见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of items of regression equation
注：*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr>F 显著性模型 1.08 9 0.12 78.23 <0.000 1 **A 0.36 1 0.36 236.44 <0.000 1 **B 0.017 1 0.017 11.20 0.012 3 *C 0.053 1 0.053 34.57 0.000 6 **AB 0.000 4 1 0.000 4 0.26 0.624 6 AC 0.003 1 0.003 1.64 0.241 6 BC 0.021 1 0.021 13.76 0.007 6 **A2 0.041 1 0.041 27.15 0.001 2 **B2 0.40 1 0.40 259.31 <0.000 1 **C2 0.13 1 0.13 86.09 <0.000 1 **残差 0.011 7 0.002失拟项 0.002 3 0.000 7 0.30 0.823 6 不显著误差项 0.009 4 0.002总和 1.09 16 R2=0.990 2
由表4可知，模型F值为78.23，模型差异极显著（p<0.01），失拟项 F 值为 0.30（p>0.05），结果表明该模型可以对超声波辅助乙醇提取法工艺条件进行预测和分析。R2=0.990 2，说明黄酮提取率的变化有99.02%来源于超声时间、超声温度和超声功率的影响。方差分析结果中 A、C、BC、A2、B2、C2各项差异均极显著（p<0.01），一次项B差异显著（p<0.05）。3个因素对黄酮提取率具有交互影响，其影响大小依次为A>C>B。
回归模型预测得到超声辅助乙醇提取最优工艺条件为超声时间112.2 min，超声温度56.8℃，超声功率85.2 W。在此条件下黄酮提取率的预测值为4.10%，考虑到实际操作的可行性，将最优提取工艺修正为超声时间112 min，超声温度57℃，超声功率85 W。在该条件下测定黄酮提取率的平均值为（4.05±0.03）%，与预测值基本一致。该模型可以较好地反映最优的超声辅助乙醇提取工艺条件。
2.4 振荡辅助乙醇提取法优化结果
2.4.1 单因素试验结果
振荡时间、振荡温度和振荡频率对方竹叶黄酮提取率的影响见图4。
图4 振荡时间、振荡温度和振荡频率对方竹叶黄酮提取率的影响
Fig.4 Effects of oscillation time，oscillation temperature and oscillation frequency on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves
A.振荡时间；B.振荡温度；C.振荡频率；图中不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图4A可知，随着振荡时间延长，黄酮提取率显著升高（p<0.05），在振荡时间为120 min时达到2.52%，之后随着振荡时间延长黄酮提取率变化不显著（p>0.05）。由图4B可知，随着振荡温度升高，黄酮提取率显著升高（p<0.05），在温度为55℃时提取率达到最大值（3.04%），当振荡温度超过55℃时提取率显著降低（p<0.05）。由图4C可知，黄酮提取率随振荡频率增加显著升高（p<0.05），在振荡频率为250 r/min时，黄酮提取率达到2.76%，之后黄酮提取率随着振荡频率增加变化不显著。综上所述，振荡辅助乙醇提取法较优的提取工艺条件为振荡时间120 min，振荡温度55℃，振荡频率250 r/min。
2.4.2 响应面优化试验结果
2.4.2.1 响应面优化设计与结果
根据单因素试验结果，以Box-Behnken中心组合设计原则，选取E振荡时间、F振荡温度、G振荡频率为自变量，以黄酮提取率为响应值，设计三因素三水平响应面试验优化振荡辅助乙醇提取工艺，试验方案及结果如表5所示。
表5 响应面优化试验方案及结果
Table 5 Experimental scheme and results of response surface optimization
试验号 E振荡时间/min Y黄酮提取率/%1 120 55 250 3.73 2 120 50 200 3.31 3 150 55 300 3.78 4 120 55 250 3.81 5 90 60 250 3.25 6 150 55 200 3.46 7 90 55 300 3.41 8 90 50 250 3.28 9 120 50 300 3.43 10 120 55 250 3.75 11 120 55 250 3.76 12 120 60 300 3.65 13 120 55 250 3.79 14 150 60 250 3.58 15 120 60 200 3.17 16 90 55 200 3.24 17 150 50 250 3.51 F振荡温度/℃G振荡频率/(r/min）
2.4.2.2 回归方程与显著性分析
利用Design-Expert 8.0软件对表5试验数据进行二次多项式逐步回归拟合，得回归模型方程为Y=3.77+0.14E+0.02F+0.14G+0.03EF+0.04EG+0.09FG-0.14E2-0.22F2-0.16G2。
回归模型方差分析见表6。
表6 回归模型方差分析
Table 6 Variance analysis of items of regression equation
注：*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr>F 显著性模型 0.80 9 0.089 90.92 <0.000 1 **E 0.17 1 0.17 169.55 <0.000 1 **F 0.002 1 0.002 1.85 0.216 4 G 0.15 1 0.15 152.32 <0.000 1 **EF 0.003 1 0.003 2.56 0.153 3 EG 0.006 1 0.006 5.77 0.047 3 *FG 0.032 1 0.032 33.23 0.000 7 **E2 0.084 1 0.084 86.16 <0.000 1 **F2 0.21 1 0.21 216.20 <0.000 1 **G2 0.10 1 0.10 105.43 <0.000 1 **残差 0.007 7 0.001失拟项 0.002 3 0.000 6 0.49 0.709 8 不显著误差项 0.005 4 0.001总和 0.80 16 R2=0.991 5
由表6可知，模型F值为90.92，差异极显著（p<0.01），失拟项F值为0.49（p>0.05），从而该模型可以对振荡辅助乙醇提取法工艺条件进行预测和分析。R2=0.991 5，说明黄酮提取率的变化有99.15%来源于振荡时间、振荡温度和振荡频率的影响。方差分析结果中E、G、FG、E2、F2、G2各项差异均极显著（p<0.01），交互项EG差异显著（p<0.05），3个因素对黄酮提取率具有交互影响，其影响大小依次为E>G>F。
回归模型预测得到振荡辅助乙醇提取最优工艺条件为振荡时间150.0 min，振荡温度56.6℃，振荡频率273.6 r/min。在此条件下黄酮提取率的预测值为3.82%，考虑到实际操作的可行性，将最优提取工艺修正为振荡时间150 min，振荡温度57℃，振荡频率274 r/min。在该条件下测定黄酮提取率的平均值为（3.76±0.05）%，与预测值基本一致。该模型可以很好地反映最优的振荡辅助乙醇提取法工艺条件。
2.5 不同提取方法提取率和抗氧化能力对比
不同提取方法提取率及不同浓度下DPPH自由基清除能力和Fe3+还原能力对比见图5。
图5 不同提取方法提取率及不同提取液清除DPPH自由基能力和Fe3+还原能力对比
Fig.5 Extraction rate of different extraction methods and DPPH radical scavenging capacity of different extracts and Fe3+reduction ability
A.不同提取方式提取率；B.不同提取方式DPPH自由基清除率；C.不同提取方式Fe3+还原能力；图中不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图5A可知，超声辅助乙醇提取法所得方竹叶黄酮提取率为（4.06±0.06）%，显著高于其它3种方法（p<0.05）。由图5B可知，随着质量浓度的增加，4种提取方法提取的方竹叶黄酮DPPH自由基清除率逐渐增强，表明其抗氧化能力逐渐增强。在超声辅助乙醇处理下，提取的方竹叶黄酮在不同质量浓度下DPPH自由基清除率都是最高的，其抗氧化能力也最强。由图5C可知，4种提取方法下方竹叶黄酮Fe3+还原力同样随着质量浓度的增加而增强。在超声辅助乙醇处理下，方竹叶黄酮Fe3+还原能力强于其它提取方式。综上所述，超声辅助乙醇提取法黄酮提取率高，提取到的黄酮抗氧化能力强，因此选择超声辅助乙醇提取法为最优的方竹叶黄酮提取方法。
3 结论
以方竹叶为原料，通过对比乙醇提取、纤维素酶提取、振荡辅助乙醇提取、超声辅助乙醇提取4种不同提取方式对方竹叶黄酮提取率的影响，比较4种提取方式所得提取物体外抗氧化活性，确定了最优的方竹叶黄酮提取工艺。通过对不同提取方法得到的黄酮提取率进行比较，结果表明超声辅助乙醇提取法黄酮提取率最高，为（4.06±0.06）%，最优工艺条件为超声时间112 min，超声温度57℃，超声功率85 W。随着质量浓度的增加，不同提取方法所得提取物的DPPH自由基清除率和Fe3+还原力均逐渐增强，超声辅助乙醇提取法所得提取物的DPPH自由基清除能力和还原力最强。对比黄酮提取率和抗氧化活性，确定最优的方竹叶黄酮提取方法为超声辅助乙醇提取法。该方法黄酮提取率高、便于操作、应用成本较低，为方竹叶资源的开发利用提供技术支撑。
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