单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）被认为是全球四大食源性致病菌之一，易污染各类食品，并对恶劣环境具有较强的耐受能力，能够克服食品运输、贮藏、加工中的各种不利因素，在4℃冰箱、高盐环境以及pH 4.5的酸性条件中仍可缓慢生长[1]。该菌可引起人类罹患各种疾病，且具有很高的发病率和致死率[2]。根据受感染者的身体健康状况差异，表现出不同症状[3]：健康成年人感染该菌，表现为流感样症状，具有自限性；老年人、幼儿和免疫缺陷人群为该菌易感人群，受感染可能会引发致命性疾病，如脓毒症、菌血症和脑膜炎；围产期女性感染会导致早产或流产。防腐剂在食品工业中尤为重要，鉴于传统防腐剂（如山梨酸钾、苯甲酸钠等）长期大量摄入可能造成毒性累积，引起肠胃功能衰退，增加肝脏负担，还可能导致细菌的耐药性[4]。因此，从兼顾来源广、副作用小、抗菌谱广、耐药性低等优点的天然植物中寻找有价值的替代品，控制Lm，对于保障食品安全具有重要意义。
工业大麻（Cannabis sativa L.），为大麻科、大麻属，一年生草本植物，自古以来是纤维和食物的重要来源[5]。作为纤维来源，工业大麻茎秆可用作纸张、布匹、绳索、木炭等。作为食物来源，工业大麻籽油因丰富的多不饱和脂肪酸，可作为高端食用油或膳食补充剂，具有预防糖尿病、高血压和心脑血管疾病等功效[6]。此外，工业大麻籽蛋白含多种必需氨基酸，易于消化和低致敏性，因此是理想的食物蛋白来源[7]。近年来，大麻籽油、大麻蛋白粉、大麻牛奶、大麻啤酒、大麻汉堡等营养和功能性食品的需求不断增长，工业大麻的种植面积也随之增大。
工业大麻叶已被证明对多种细菌具有抑制作用，隽惠玲等[8]研究显示工业大麻叶对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌两种常见食源性致病菌有抑制作用。Mkpenie等[9]考察了萃取溶剂种类和提取条件对工业大麻叶的抗菌活性的影响，推测其活性差异可能与提取物中的多酚含量有关。郭孟璧等[10]认为工业大麻叶雌株花叶多糖对金黄色葡萄球菌具有抑菌效果，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为6.25 mg/mL。Marini等[11]证明工业大麻叶精油可能成为一种有效降低食品中Lm污染的天然防腐剂。前期研究确定了工业大麻叶乙酸乙酯萃取部位对Lm的MIC为15.63 mg/mL，且针对模拟食品体系的主要因素，如辐照杀菌、加热处理、蔗糖和氯化钠等食品调味剂的添加，仍表现出良好的抑菌稳定性[12]，但有关工业大麻叶对Lm的抑菌组成和抑菌机制尚不明确。
本研究通过对工业大麻叶萃取后硅胶柱分离，比较石油醚-乙酸乙酯不同比例组分对Lm的抑菌活性，采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS）分析高活性组分挥发性化合物组成，进一步从对细胞壁完整性、膜通透性、能量代谢、氧化损伤的影响角度分析工业大麻叶对Lm的作用机理，以期为以工业大麻叶成分为先导化合物开发新型天然防腐剂以及食品工业中防治Lm污染提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
工业大麻叶：采自黑龙江省大庆市东风农场；Lm标准菌株（ATCC19115）：上海鲁微科技有限公司；硅胶粉：青岛海洋生物有限公司；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；溶菌酶（20 000 U/mg）：上海吉至生化科技有限公司；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇（分析纯）：辽宁泉瑞试剂有限公司。
7890B-7000C气相色谱质谱联用仪：安捷伦科技有限公司；Epoch多功能酶标仪：美国Biotek公司；UV759紫外可见分光光度计：上海高致精密仪器有限公司；VFD-4560真空冷冻干燥机：上海博医康实验仪器有限公司；JSM7200F扫描电子显微镜：日本电子株式会社。
1.2 试验方法
1.2.1 工业大麻叶提取物的制备
参考张正海等[12]的方法，工业大麻叶经乙醇提取、乙酸乙酯萃取，减压浓缩后以1.5倍100目～200目硅胶拌样，200目～300目硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（1∶0、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1，体积比）梯度洗脱，结合薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）合并相似洗脱液，得到 Fr.1：0、Fr.50：1、Fr.20：1、Fr.10：1、Fr.5：1、Fr.1：1、Fr.0：1 共 7 个组分，减压浓缩后用10%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）调整浓度至10 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存，用于抑菌试验。
1.2.2 最低抑制浓度的测定
采用96孔板结合微量肉汤梯度稀释法，向96孔板中加入90 μL/孔菌悬液和10 μL/孔不同浓度的工业大麻叶提取物，使其终浓度分别为1 000、500、250、125、62.5、31.25、16、8、4 μg/mL，同时设 10%DMSO 作为对照，37℃静置培养24 h，肉眼直接观察，以不出现浑浊的最低浓度为MIC。
1.2.3 GC-MS化学成分分析
对Lm的活性筛选，选取活性最佳的组分进行GCMS 分析。GC 条件：HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），载气He，流速1.1 mL/min；升温程序：100℃保持1 min，以10℃/min升至280℃保持12 min，不分流；MS条件：四极杆温度150℃，电子轰击离子源70 eV，接口温度 240℃，扫描范围50.0 amu～500.0 amu。
1.2.4 菌悬液中AKP活性和电导率的测定
将对数生长期的菌悬液浓度调整为106CFU/mL，加入工业大麻叶提取物，使其终浓度分别为0 MIC、1/2 MIC、1 MIC，以0 MIC为对照组。37℃振荡培养，每间隔2 h取5 mL菌液，依照试剂盒说明书的步骤测定上清液AKP活性、去离子水稀释20倍后电导率仪测定各时间点电导率[13]。
1.2.5 胞内ATP含量和SOD活性的测定
菌液处理同 1.2.4，培养过程中分别于 0、2、4、6、8、10 h取1 mL菌液，以0 h为对照组。4℃离心后弃上清液，菌体用500 μL浓度为10 mg/mL的溶菌酶处理20 min，按各自试剂盒说明书测定菌体ATP含量[14]和SOD 活性[15]。
1.2.6 扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）观察及样品制备
参考Su等[16]的方法并稍作修改，将对数生长期的菌液浓度调整为107CFU/mL，取10 mL菌液加入工业大麻叶提取物使其终浓度分别为0 MIC、1 MIC，以0 MIC为对照组。于37℃，120 r/min振荡培养10 h。用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次，离心收集菌体，2.5%戊二醛溶液固定过夜。依次用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇梯度脱水，叔丁醇置换。-20℃预冻后真空冷冻干燥机干燥，喷金后SEM观察。
1.3 数据处理
试验重复3次，试验结果取平均值，GraphPad Prism 7软件绘图。
2 结果与分析
2.1 工业大麻叶不同组分对Lm的抑菌活性
10% DMSO 对照和 Fr.1：0、Fr.50：1、Fr.20：1、Fr.10：1、Fr.5：1各组孔内均出现明显浑浊，表现为供试浓度内对Lm的生长没有明显影响。工业大麻叶Fr.1：1和Fr.0：1对Lm的MIC值分别为62.5μg/mL和1000μg/mL，说明抑菌活性成分大部分富集于Fr.1：1。以此为依据，选择Fr.1：1分析其化学组成并探讨其抑菌机理。
2.2 工业大麻叶Fr.1：1组分的GC-MS结果
工业大麻叶Fr.1：1挥发性成分总离子流图见图1，工业大麻叶Fr.1：1 GC-MS鉴定结果见表1。
图1 工业大麻叶Fr.1：1挥发性成分总离子流图
Fig.1 Total ion current chromatograph of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves
表1 工业大麻叶Fr.1：1 GC-MS鉴定结果
Table 1 GC-MS identification of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves
编号 化合物名称 保留时间/min相对含量/%匹配度/%1 12-甲基十三烷酸甲酯 11.216 1.45 93.0 2 5，6，7，7a-四氢-7-羟基-4，4，7a-三甲基-2（4H）-苯并呋喃酮12.035 0.59 91.2新植二烯 12.428 3.30 88.0 4叶绿醇 12.680 2.89 88.0 5 9-十八烯-1-醇 12.876 4.38 87.2 6棕榈油酸甲酯 13.095 0.63 83.7 7反-棕榈油酸甲酯 13.277 1.59 91.1 8十六酸甲酯 13.360 13.12 88.5 9 邻苯二甲酸异丁酯 13.706 2.99 74.7 10 2-甲基丁酸戊酯 14.376 0.79 76.9 11 3，3，5，5-四甲基环己醇 14.657 2.34 72.1 12 γ-亚麻酸甲酯 14.813 0.72 93.9 13 硬脂酸甲酯 14.875 0.79 93.5 14 9-顺式，11-反式癸二烯酸甲酯 14.981 4.55 94.1 15 亚麻酸甲酯 15.112 40.79 94.0 16 异硬脂酸甲酯 15.268 4.42 87.8 17 花生酸甲酯 17.016 1.90 75.8 18 大麻色原烯 17.526 0.97 86.8 19 DELTA-8-四氢大麻酚 18.531 0.05 96.3 20 20-甲基环己酸甲酯 18.647 1.11 84.6 21 Δ9-四氢大麻酚 18.724 1.26 93.2 22 大麻酚 19.248 1.43 92.9 23 木蜡酸甲酯 20.315 0.52 79.8 24 油酸酰胺 20.901 1.78 81.5 3
结合图1和表1可知，经GC-MS共鉴定出24种挥发性化合物，占相对含量的96.36%，其中酯类14种（75.37%），醇类3种（9.61%），酚类3种（4.74%），烯烃类 2种（4.27%），酮类 1种（0.59%），酰胺类 1种（1.78%）。主要化合物有亚麻酸甲酯（40.79%）、十六酸甲酯（13.12%）、9-顺式，11-反式癸二烯酸甲酯（4.55%）、异硬脂酸甲酯（4.42%）、9-十八烯-1-醇（4.38%）和新植二烯（3.3%）等。
2.3 工业大麻叶Fr.1：1组分的抑菌机理
2.3.1 工业大麻叶Fr.1：1组分对菌体细胞壁的影响
工业大麻叶Fr.1：1组分对Lm的AKP含量的影响见图2。正常情况下AKP仅存在于细菌的细胞壁和细胞膜之间，菌悬液AKP含量的变化可间接反映菌体细胞壁完整性。
图2 工业大麻叶Fr.1：1组分对菌悬液AKP含量的影响
Fig.2 Effect of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves on the AKP content of Lm suspension
由图2所示，对照组AKP含量始终处于较低水平（0.807 U/L～1.028 U/L）。1/2 MIC工业大麻叶提取物处理后，菌液在6 h达到最大值（3.527 U/L）。当Fr.1：1浓度从1/2 MIC升高至1 MIC时，上清液AKP水平在2 h内迅速上升至7.811 U/L，之后趋于平稳状态。其它抑菌药物如对苯二酚也有类似发现[17]。这表明工业大麻叶Fr.1：1组分短时间内能有效破坏Lm细胞壁的完整性，其中1 MIC的Fr.1：1的破坏程度较1/2 MIC更为明显。
2.3.2 工业大麻叶Fr.1：1组分对细胞膜通透性的影响
当细胞膜遭到破坏，通透性增加，内部的电解质会外泄至胞外，进而使培养液电导率改变，因此菌液电导率的变化反映了细胞膜通透性的变化[16]。工业大麻叶Fr.1：1组分对细胞上清液电导率的影响见图3。
图3 工业大麻叶Fr.1：1组分对细胞上清液电导率的影响
Fig.3 Effect of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves on electric conductivity of culture supernate
由图3所示，0 h添加抑菌物质的菌液电导率较对照组有一定程度的下降，可能是药物与外泄离子发生静电结合，从而导致离子浓度降低，电导率下降。随着培养时间的延长，对照组电导率呈现上升趋势并趋于平衡，但变化幅度较小，这可能与细菌适应外界环境的变化有关。而经1 MIC工业大麻叶提取物作用后2 h培养液电导率急剧上升36.70%，且始终高于1/2 MIC组。表明工业大麻叶Fr.1：1可对Lm细胞膜造成破坏，其破坏程度与其浓度成正相关。
2.3.3 工业大麻叶Fr.1：1组分对菌体能量代谢的影响
细胞内ATP水平是评价微生物可用能量的重要参数[14]，不同浓度的Fr.1：1作用后Lm胞内ATP水平的变化见图4。
图4 工业大麻叶Fr.1：1组分对Lm的ATP含量影响
Fig.4 Effect of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves on the ATP content of Lm
由图4可知，对照组细胞内ATP随时间变化呈上升趋势，而在1/2 MIC和1 MIC Fr.1：1存在的情况下，细胞内ATP含量在2 h升高，并在10 h分别降低至12.115 μmol/L 和 9.250 μmol/L，较 0 h 分别降低了79.26%和84.50%。这可能是由于添加抑菌物质对菌体产生了刺激，而细胞为维持正常生理功能出现应激，ATP含量在2 h内上升。最终细菌因电解质的损失，导致质子动力的降低，影响还原氢的利用，从而使ATP的合成受到抑制[18]。Su等[16]提出膜通透性的增加也可能导致胞内ATP浓度的降低。另外，细胞内ATP含量的降低也可能是细胞过度消耗ATP造成的。因此，工业大麻叶Fr.1：1会抑制Lm能量代谢。
2.3.4 工业大麻叶Fr.1：1组分对菌体氧化损伤的影响
研究表明，促氧化作用可能是化合物发挥抑菌活性的机制之一[15]。自由基能攻击生物膜并引起细胞损伤，形成丙二醛等过氧化物，SOD是细胞中重要的抗氧化保护酶，工业大麻叶Fr.1：1组分对菌体氧化损伤的影响见图5。
图5 工业大麻叶Fr.1：1组分对Lm的SOD活性影响
Fig.5 Effect of Fr.1：1 fractions from hemp leaves on the SOD activity of Lm
由图5可知，对照组SOD活力相对稳定且维持在较低水平，说明细胞生物膜未受明显损伤。不同浓度Fr.1：1处理后，前期SOD活力增加，1/2 MIC和1 MIC组分别在6 h和8 h达到最大值0.333 U和0.403 U，较对照组分别提高25.19%和46.55%，推测提取物参与了Lm的促氧化过程，导致细胞内氧自由基的增加，诱导SOD基因的表达，但后期由于膜脂过氧化的加重等导致保护酶水平的降低，使菌体自身防御能力下降，在持续提取物逆境胁迫下，Lm生长受到抑制。
2.3.5 工业大麻叶提取物对细胞显微特征的影响
工业大麻叶提取物处理前后Lm的扫描电镜结果见图6。
图6 工业大麻叶提取物处理前后Lm的扫描电镜图
Fig.6 SEM plot of Lm before and after treatment of industrial cannabis leaf extracts
A1～A3.0 MIC×5 000、0 MIC×10 000、0 MIC×20 000 电镜图；B1～B3.1 MIC×5 000、1 MIC×10 000、1 MIC×20 000 电镜图。
如图6所示，对照组Lm（A1～A3）细胞表面光滑、外观饱满且形态较完好；经1 MIC提取物处理10 h后（B1～B3），菌体表面粗糙不平整，可见明显破溃的菌体（箭头处）。
3 讨论与结论
为探索以工业大麻叶成分为先导化合物开发抗Lm新型防腐剂，以活性为导向筛选工业大麻叶抑菌活性组分，乙酸乙酯萃取组分经体积比为1∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱后所得组分Fr.1：1对Lm抑菌效果最好，MIC值为62.5 μg/mL；共鉴定出24种挥发性化合物，其中含量最高的两种化合物是亚麻酸甲酯和十六酸甲酯，相对含量分别占到40.79%和13.12%。据报道，亚麻酸甲酯也是香青菜挥发油抑菌活性化合物中的主要成分[19]，而棕榈酸甲酯被证实是核桃壳中杀螨[20]和有效控制香蕉中根结线虫的生物活性化合物[21]，但工业大麻叶对Lm的抑菌活性也可能是其中的微量化合物或是不同化合物之间的协同作用[22]。Appendino等[23]比较了工业大麻叶中多种大麻素的结构及抑菌活性差异，发现大麻素的异戊二烯基对抗菌作用影响较小，而大麻素羧基的酯化和酚羟基的甲基化、乙酰化都不利于抗菌活性，但其研究对象仅限于大麻素且活性机制尚不明确。经Fr.1：1处理后，Lm培养液中AKP活性升高，培养液电导率增大，结合SEM，表明细胞完整性遭到破坏；胞内ATP含量和SOD活性最终下降，说明菌体能量代谢受到影响并造成质膜氧化损伤，最终使Lm生长受到抑制。本研究为工业大麻叶在抑菌和食品保鲜方面的应用提供了理论依据。
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