美藤果（Plukenetia volubilis Linneo），别名印加果、印奇果，是一种大戟科木质藤本植物，原生长在南美洲，其种植周期短、营养价值高，是一种高油脂、高蛋白的新型木本油料作物[1-2]。2006年，美藤果由中国科学院西双版纳热带植物园引种成功，2013年美藤果油获批为新资源食品。美藤果的主要成分有油脂、蛋白质、糖类、多酚类、维生素E以及Ca、P、K等矿物质元素[3-4]。
美藤果油的脂肪酸组成丰富，主要以不饱和脂肪酸为主，包括亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸等，且均为人体所需要的不饱和脂肪酸，其中亚麻酸含量高于40%，明显高于除亚麻籽油之外的植物油[5]。美藤果油中的活性成分还包括多酚、生育酚、甾醇、胡萝卜素等，其中生育酚含量约为1.6 g/kg[6]、多酚含量约为62 mg/kg[7]。研究表明，美藤果油具有降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、降低收缩血压和舒张血压、提高高密度脂蛋白水平的作用。其含有的多不饱和脂肪酸、维生素、多酚类物质具有较强的抗氧化作用，并且抗氧化效果优于橄榄油、茶油、亚麻籽油和紫苏油[8]。同时美藤果油中的亚油酸和亚麻酸还具有调节免疫机能的作用[9]。本文采用响应面优化萃取美藤果油，利用大鼠高强度运动，研究其对大鼠腓肠肌功能恢复和ATP酶的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
美藤果：昆明彩云之南生物科技有限公司；正己烷（分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；过氧化物酶（peroxidase，POD）试剂盒、乳酸（lactic acid，LA）试剂盒、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）试剂盒：南京建成生物科技公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）试剂盒：上海索宝生物科技有限公司。
SPF级雄性SD大鼠50只，体重（120±5）g，广州市白云区龙归兴科动物养殖场，许可证号SCXK（粤）2017-0042。
1.2 仪器与设备
ZW-CLJ-5型超临界萃取仪：泽望自动化设备（上海）有限公司；RV-211M型旋转蒸发仪：上海一恒科学仪器有限公司；YJ-GS-300型电子天平：上海亚津电子科技有限公司；CK-CWYCJ型粉碎机：永康市圣象电器有限公司；TG-16W型高速离心机：济南欧莱博科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 美藤果油的制备
首先将美藤果去皮，挑选饱满的美藤果仁，并将其粉碎过60目筛，放在40℃真空干燥箱干燥4 h，称取适量的美藤果仁粉，将美藤果仁粉装入萃取釜中，在不同萃取压力、萃取温度、萃取时间等条件下进行超临界萃取。萃取结束，收集美藤果油[10-11]。
Y/%=m/M×100
式中：Y为美藤果油得率，%；m为美藤果油质量，g；M为美藤果仁粉末质量，g。
1.3.2 单因素试验
在萃取温度55℃、萃取时间100 min条件下，设定不同萃取压力为 10、15、20、25、30 MPa，考察萃取压力对美藤果油得率的影响；在萃取压力为20 MPa、萃取时间100 min条件下，设定不同萃取温度为40、45、50、55、60℃，考察萃取温度对美藤果油得率的影响；在萃取压力20 MPa、萃取温度55℃条件下，设定不同萃取时间为 60、80、100、120、140 min，考察萃取时间对美藤果油得率的影响。
1.3.3 响应面法优化美藤果油提取工艺
在单因素试验的基础上，以美藤果油得率（Y）为指标，选取对美藤果油得率影响较大的3个因素进行试验，以萃取压力（X1）、萃取温度（X2）和萃取时间（X3）为考察因素，进行三因素三水平响应面试验设计，试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平
Table 1 Box-Behnken design factor level
水平 X1萃取压力/MPa X2萃取温度/℃ X3萃取时间/min-1 15 50 80 0 20 55 100 1 25 60 120
1.3.4 分组及运动方案
选取SPF级雄性SD大鼠50只，体重（120±5）g，自由饮食，饲养环境（23±2）℃。分成5组，每个小组10只大鼠，分成对照组、运动组和低、中、高剂量美藤果油组。低、中、高剂量美藤果油组每天灌胃10、15、20 mg/g美藤果油，运动组灌胃15 mg/g生理盐水。其中对照组不进行任何运动，其它4组进行游泳训练，实验时间6周。将大鼠放入游泳池内，大鼠的尾部负重其体重8%的铅丝，从大鼠进入到游泳池开始，到大鼠力竭的这段周期，沉入水中8 s不能浮到水面停止实验。大鼠在6周实验结束之后，所有大鼠进行腹腔麻醉（10%的水合氯醛），处死后取腓肠肌，放入液氮以备指标测定，并对相关指标POD、SDH、ATP酶、乳酸等指标根据酶学试剂盒的说明书检测分析[12]。
1.4 统计学分析
使用SPSS 20.0软件进行数据分析，数据均使用平均值±标准差来表示，采取组间进行对比，P＜0.05表示具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 萃取压力对美藤果油得率的影响
萃取压力对美藤果油得率的影响见图1。
图1 萃取压力对美藤果油得率的影响
Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of Rattan oil
由图1可知，随着萃取压力的逐渐增加，美藤果油得率逐渐提高，当萃取压力达到20 MPa时，美藤果油得率达到最高，继续增加萃取压力，美藤果油得率呈下降趋势。这是因为过高的萃取压力可以使流体的扩散性和对流性有所下降，传质速率降低，使得美藤果油得率降低，并且增加萃取压力会使实际操作增加危险性。综上，选择萃取压力为20 MPa。
2.1.2 萃取温度对美藤果油得率的影响
萃取温度对美藤果油得率的影响见图2。
图2 萃取温度对美藤果油得率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of Rattan oil
由图2可知，随着萃取温度的逐渐增加，美藤果油得率逐渐提高，当萃取温度达到55℃时，美藤果油得率达到最高；继续增加萃取温度，美藤果油得率呈下降趋势。这是因为温度升高可以增加油脂分子的扩散运动，使得美藤果油更容易萃取出来，得率提高。但是萃取温度过高，会发生氧化反应破坏美藤果油的结构。综上，选择萃取温度为55℃。
2.1.3 萃取时间对美藤果油得率的影响
萃取时间对美藤果油得率的影响见图3。
图3 萃取时间对美藤果油得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of Rattan oil
由图3可知，随着萃取时间的延长，美藤果油得率逐渐提高，当萃取时间达到100 min时，美藤果油得率达到最高，继续延长萃取时间，美藤果油得率几乎不变，说明此时美藤果油已经几乎完全被萃取。综上，选择萃取时间为100 min。
2.2 响应面法试验结果与分析
在单因素试验的基础上，确定各因素最佳水平值范围，以美藤果油得率（Y）为指标，设计Box-Behnken试验中心组合试验。响应面分析方案与结果见表2。
表2 Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Box-Behnken experimental design and results
序号 X1 X2 X3 Y得率/%1 0 0 0 49.96 2 0 1-1 45.11 3 0 50.12 4-1 -1 0 44.82 5 1-1 0 45.71 0 0 6 0 50.06 7-1 0 -1 45.41 8 1 0 1 48.55 0 0-1 45.92 10 0 0 0 49.92 11 -1 0 1 47.36 12 0 0 0 50.15 13 1 1 0 46.11 14 0 1 1 47.83 15 0 -1 1 46.97 16 -1 1 0 45.81 17 0 -1 -1 44.78 9 1 0
采用Design-Expert 8.0软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到多元回归方程：Y=50.04+0.36X1+0.32X2+1.19X3-0.15X1X2+0.17X1X3+0.13X2X3-1.90X12-2.53X22-1.34X32。
该模型回归分析见表3。模型P=0.000 1<0.01极显著，失拟项P=0.300 6>0.05不显著，证明失拟处理不显著，实验误差较小。相关系数R2=0.998 7，调整系数
也表明上述模型拟合程度较好，该模型可用于萃取美藤果油。对美藤果油得率影响顺序依次为萃取时间>萃取压力>萃取温度。并且萃取时间、萃取压力和萃取温度影响都达到了极显著水平（P<0.01）；X1X2达到显著水平（P<0.05）、X1X3达到显著水平（P<0.05）；上述各因素的二次项均对得率影响极显著（P<0.01）。萃取压力与萃取温度的响应面分析、萃取压力与萃取时间的响应面分析见图4和图5。
表3 响应面回归模型ANOVA分析结果
Table 3 ANOVA analysis results of response surface regression model
注：*表示有显著差异（P<0.05）；**表示有极显著差异（P<0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 68.42 9 7.60 586.05 <0.000 1 **X1 1.04 1 1.04 80.48 <0.000 1 **X2 0.83 1 0.83 64.14 <0.000 1 **X3 11.26 1 11.26 867.82 <0.000 1 **X1X2 0.087 1 0.087 6.71 0.035 9 *X1X3 0.12 1 0.12 8.91 0.020 4 *X2X3 0.070 1 0.070 5.41 0.052 9 X12 15.14 1 15.14 1 166.81<0.000 1 **X22 27.03 1 27.03 2 083.37<0.000 1 **X32 7.52 1 7.52 579.35 <0.000 1 **残差 0.091 7 0.013失拟项 0.051 3 0.017 1.72 0.300 6纯误差 0.040 4 0.009 92总和 68.51 16
图4 萃取压力与萃取温度的响应面分析
Fig.4 Response surface analysis of extraction pressure and temperature
图5 萃取压力与萃取时间的响应面分析
Fig.5 Response surface analysis of extraction pressure and extraction time
从图4分析得出，萃取压力与萃取温度对得率的影响较为明显。由于3D曲面较为陡峭，同时两者之间交互作用较为明显，等高线为椭圆形；从图5分析得出，萃取压力与萃取时间对得率的影响较为明显。由于3D曲面较为陡峭，同时两者之间交互作用较为明显，等高线为椭圆形。
通过上述分析得美藤果油最佳萃取条件为萃取压力20.56MPa、萃取温度55.36℃、萃取时间109.08min时，此时美藤果油得率为50.34%。考虑到实际操作情况，修正成萃取压力为21 MPa、萃取温度为55℃、萃取时间为109 min，选取该组合做3次平行试验，得出美藤果油的平均得率为50.15%。与预测值相近，证明该工艺可以用来萃取美藤果油。
2.3 美藤果油对高强度大鼠腓肠肌功能恢复和ATP酶的影响
美藤果油对高强度大鼠腓肠肌功能恢复和ATP酶的影响见表4。
表4 美藤果油对高强度大鼠腓肠肌功能恢复和ATP酶的影响
Table 4 Effect of Rattan oil on functional recovery and ATPase of gastrocnemius muscle in high-intensity rats
注：各组与对照组相比，#表示有显著差异（P<0.05）；与运动组相比，*表示有显著差异（P<0.05）。
组别POD/（U/mg）SDH/（U/mL）乳酸/（mmol/g）ATP酶/（mg/mL）对照组 1.51±0.31 10.76±1.29 1.91±0.14 1.62±0.22运动组 0.62±0.15# 6.35±0.92# 3.45±0.74# 0.79±0.13#低剂量组 0.81±0.19 8.52±1.11 2.94±0.62 1.08±0.15中剂量组 1.24±0.20 9.25±1.15 2.43±0.47 1.33±0.17高剂量组 1.40±0.25* 10.46±1.25* 1.88±0.32* 1.51±0.19*
从表4可知，运动组与对照组相比POD活性显著降低（P<0.05），低、中、高剂量美藤果油组POD活性呈上升趋势，高剂量组的POD活性与运动组相比显著提高（P<0.05）；运动组与对照组相比SDH水平显著降低（P<0.05），低、中、高剂量美藤果油组SDH水平呈上升趋势，高剂量组的SDH水平与运动组相比显著提高（P<0.05）；运动组与对照组相比乳酸含量显著提高（P<0.05），低、中、高剂量美藤果油组乳酸含量呈下降趋势，高剂量组的乳酸含量与运动组相比显著降低（P<0.05）；运动组与对照组相比ATP酶水平显著降低（P<0.05），低、中、高剂量美藤果油组ATP酶水平呈上升趋势，高剂量组的ATP酶水平与运动组相比显著提高（P<0.05）。POD是机体内抗氧化酶之一，担负着体内氧自由基的清除作用，使超氧离子维持在正常水平，实验结果显示高强度运动后，运动组大鼠腓肠肌POD活性明显降低，说明高强度运动后机体相对缺氧，腓肠肌内的细胞质中的钙离子浓度增加，机体耗氧量水平增加，产生大量自由基，机体抗氧化能力降低，进而影响健康[13]。而SDH是糖在有氧氧化过程中的关键酶，是腓肠肌内线粒体的一种标志酶[14]。乳酸是高强度运动中产生的产物，在缺氧条件下，糖酵解能量代谢产生大量乳酸，乳酸会导致腓肠肌的收缩能力下降，使糖酵解供能速率下降，减少了ATP酶合成，最终导致运动能力下降[15]。大鼠灌胃美藤果油后，由于其具有较强的抗氧化能力，可以提高POD活性和SDH水平，减少乳酸的产生，提高ATP酶合成能力，清除机体内产生的自由基，避免了脂质过氧化，缓解运动性疲劳，进而使得大鼠腓肠肌功能恢复。
3 结论
通过超临界CO2得美藤果油最佳萃取条件为萃取压力20.56MPa、萃取温度55.36℃、萃取时间109.08 min时，美藤果油得率50.34%。考虑到实际操作情况，修正成萃取压力为21 MPa、萃取温度为55℃、萃取时间为109 min，选取该组合做3次平行试验，得出美藤果油的平均得率为50.15%。与预测值相近，证明该工艺可以用来萃取美藤果油。大鼠实验表明，灌胃美藤果油后，由于其具有较强的抗氧化能力，可以提高POD活性和SDH水平，减少乳酸的产生，提高ATP酶合成能力，清除机体内产生的自由基，避免脂质过氧化，缓解运动性疲劳，进而使得大鼠腓肠肌功能恢复，为以后美藤果油的研究提供了宝贵经验。
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