我国是家禽养殖、屠宰加工大国，近年来家禽养殖业呈规模化、集约化方向发展，成为我国农业经济中最活跃的增长点和主要的支柱产业。家禽屠宰加工过程中产生大量的血液，是一种优质的蛋白资源，目前关于禽血精深加工与高值化利用研究较少。
氧化是人类衰老与疾病主要诱因，脂质与蛋白质氧化均可以产生自由基，自由基的形成与累积会进一步损伤生物大分子，导致细胞及组织的氧化损伤[1-2]。抗氧化剂可以有效抑制自由基的氧化反应，在减少细胞氧化、防止脂质过氧化、降低自由基生成速率等方面具有重要作用[3]。检测ABTS＋自由基、DPPH自由基、羟基自由基等自由基清除率是评价抗氧化活性常规方法[4-5]。通过酶解食源性蛋白质获得的多肽，可以具备与天然或合成类抗氧化剂同样甚至更好的抗氧化活性。国内外研究表明，活性肽具备抑制脂质过氧化、螯合金属离子、清除活性氧能力[6-7]。活性肽抗氧化能力与多肽的分子量、结构和疏水性有着密切的关系[8-9]。本研究以鸡血血红蛋白为原料，采用中性蛋白酶水解，结合离心、浓缩、冻干等方法制备血肽，应用葡聚糖凝胶色谱分离纯化，收集并测定不同分子量范围血肽体外抗氧化性，为实现禽血高值转化利用提供技术支撑与理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜鸡血：市售。三氟乙酸、过硫酸钾、ABTS、DPPH、邻二氮菲、硫酸亚铁、乙醇、双氧水、邻苯三酚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；中性蛋白酶（酶活≥100 U/mg，分析纯）：合肥博美生物科技有限公司；乙晴、细胞色素C、抑肽酶、杆菌酶、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（色谱纯）：北京安捷飞科技有限公司。
1.2 仪器与设备
GL-25MS高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；L5S紫外分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；Waters1525高效液相色谱仪（配2487紫外检测器和Empower工作站GPC软件）：美国Waters公司；SIM FDS-2.5E真空冷冻干燥机：美国SIM公司。
1.3 试验方法
1.3.1 原料处理
鸡宰杀时收集鸡血，添加0.2%乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，ED TA-2Na），搅拌均匀，置于冰盒中备用，离心处理（4000r/min，20 min），收集沉淀，冻干即为鸡血血红蛋白粉。以血红蛋白粉为酶解底物，选用中性蛋白酶酶解，根据单因素试验确定血肽酶解条件，即血红蛋白底物浓度、酶添加量与酶解时间，研究分析血肽相对分子质量分布、分离纯化方法及其抗氧化性研究。
1.3.2 氨基酸态氮含量的测定
酶解液中的氨基酸态氮含量采用中性甲醛滴定法测定[10]。
1.3.3 总氮含量的测定
总氮含量采用半微量凯氏定氮法测定[11]。
1.3.4 水解度（degree of hydrolysis，DH）测定
水解度计算公式如下[12]。
DH/%=AN/TN×100
式中：AN为氨基酸态氮的含量，g/L；TN为总氮量，g/L。
1.3.5 血肽相对分子质量分布检测
1）样品制备：称取样品10 mg于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤后供进样。
2）色谱条件：色谱柱TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相为乙腈、水、三氟乙酸体积比 45∶55∶0.1；检测波长220 nm；流速0.5 mL/min；柱温30℃。
1.3.6 血肽分离纯化试验
参考文献[13-14]的方法，称量SephadexG-154.5g，用蒸馏水加热溶胀，脱气，匀速倒入垂直放置的凝胶柱（16 mm×100 cm）中，置于4℃层析柜中。将柱的上端与恒流泵相连，0.5 mg/mL NaCl溶液洗脱12 h，使凝胶处于均匀紧实状态。将血肽样品配制成100 mg/mL溶液，过0.45 μm微孔滤膜，上样量1.0 mL，流动相为NaCl溶液，流速为0.5 mL/min，紫外检测波长260 nm，以时间为横坐标，洗脱液吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线，合并同一洗脱峰，洗脱液真空浓缩，冷冻干燥后得到纯化后血肽样品。
1.3.7 血肽抗氧化性试验
1.3.7.1 ABTS＋自由基清除率测定
参照WANG等[15]的方法。取2.45 mmol/L K2S2O8溶液和7 mmol/L ABTS溶液等体积混合，室温25℃避光放置12h～16h制得ABTS＋自由基反应液，用0.2mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液将0.8 mL ABTS＋自由基反应液进行稀释，使其在734 nm下吸光值为0.68～0.72，备用。配制3.0 mg/mL样液，取0.04 mL样液与4 mL ABTS＋自由基反应液混合均匀，常温避光反应1 h，测定其在734 nm下的吸光值（A1），用去离子水做空白对照测定在734 nm下的吸光值（A2），按下式计算ABTS＋自由基清除率。
1.3.7.2 DPPH自由基清除率测定
参照BAEA S H等[16]的方法。取2 mL样液（3.0 mg/mL），加入2 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液（用95%的乙醇溶解），混匀后在室温25℃条件下避光反应30 min，在517 nm波长处测吸光度（A1），空白组为2 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液，加入2 mL样液混合，在517 nm波长处测定吸光度（A2），对照组为2 mL DPPH溶液加2 mL 95%的乙醇溶液，在517 nm处测定其吸光度（A0）。按下式计算DPPH自由基清除率。
1.3.7.3 羟基自由基清除率测定
参照马赛蕊等[17]的方法。取0.6 mL 5 mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液，加入0.4 mL 0.15 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.40）和0.6 mL 0.75 mmol/L的硫酸亚铁，加入2 mL样液（3.0 mg/mL），加入0.4 mL 0.1%双氧水，37℃条件下水浴60 min，在波长536 nm波长处测其吸光度（A1）；以去离子水代替样液和双氧水溶液重复以上操作，在536 nm波长处测其吸光度（A2）；以去离子水代替样液来重复以上操作，在536 nm波长处测定其吸光度（A3）。按下式计算羟基自由基清除率。
1.3.7.4 O2-自由基清除率测定
参照张金豫等[18]的方法。取样液0.1 mL（3.0 mg/mL），加入2.8 mL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.2）缓冲溶液振荡混匀，在25℃水浴10 min后加入0.1 mL 3 mmol/L的邻苯三酚溶液（25℃预热），在322 nm波长测定吸光度，每隔30 s读取吸光度，4 min后结束；以去离子水0.1 mL加 2.8 mL 0.1 mol/L的 Tris-HCl（pH 8.2）缓冲溶液调零；空白对照管以去离子水代替样液。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按下式计算O2-自由基清除率。
式中：V对照为邻苯三酚自氧化速率，即自氧化曲线斜率；V样品为加入血肽氧化曲线斜率。
1.4 数据处理
试验数据采用平均值±标准差表示，试验重复3次，使用Excel、Origin 8.0进行数据处理和制图。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验
不同底物浓度、酶添加量、酶解时间对血红蛋白水解度的影响见图1。
图1 不同酶解条件下鸡血血红蛋白水解度
Fig.1 Degree of hydrolysis of hemoglobin in chicken blood at different enzymatic hydrolysis conditions
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图1可知，底物浓度为5%～6%时，水解度变化不明显，表明底物浓度大于5%时趋于饱和；随着酶添加量增加，血红蛋白水解度呈缓慢增加趋势，酶添加量大于1.5%后，水解度趋于稳定值；随着酶解时间的延长，水解度缓慢增加。水解度直接关系到血红蛋白水解程度，随着水解度的增加，酶解产物的分子质量分布表现出大分子肽含量逐渐减少，小分子肽含量逐渐增多[19-20]。综合考虑原辅料成本、生产周期、能耗等问题，确定血肽酶解制备条件：底物浓度5%，酶添加量1.5%，酶解时间5 h。
2.2 血肽相对分子质量分布
血肽高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）图以及相对分子质量分布见图2和表1。
表1 血肽相对分子质量分布
Table 1 Relative molecular mass distribution of hemepeptide
组分 分子量范围/Da数均分子量重均分子量峰分子量 峰面积 相对峰面积/%1 ＞10 000 15 611 17 329 10 196 9 951 0.03 2 5 000～10 000 6 660 6 972 5 000 14 480 0.04 3 3 000～5 000 3 602 3 671 3 005 64 609 0.19 4 2 000～3 000 2 404 2 440 2 004 161 529 0.48 5 1 000～2 000 1 252 1 299 997 910 301 2.69 6 500～1 000 601 623 510 8 101 730 23.97 7 180～500 279 304 240 22 329 243 66.07 8 ＜180 50 100 179 2 202 136 6.52
图2 血肽高效液相色谱图
Fig.2 HPLC of hemepeptide
鸡血血红蛋白经中性蛋白酶酶解后，酶解液中肽的相对分子质量主要分布在1 000 Da以下，1 000 Da～2 000 Da的肽含量较低，仅为2.69%，500 Da～1 000 Da的肽含量为 23.97%，180 Da～500 Da的肽含量为66.07%，低于180 Da的肽含量为6.52%，属于氨基酸或其残基。根据氨基酸平均相对分子质量180 Da，可以推断酶解液中肽大部分由2个～6个氨基酸组成，属于小肽（或寡肽）范畴。由此可以说明，采用上述的酶解工艺条件可以得到含量超过90%以上小肽样品。
2.3 血肽SephadexG-15分离纯化
根据表1血肽大部分相对分子质量小于1000Da，而Sephadex G-15分离的分子质量范围是＜1 500 Da，因此选择采用交联葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离纯化血肽粗品，洗脱峰见图3。
图3 血肽葡聚糖凝胶层析图谱
Fig.3 Dextran gel chromatography of hemepeptide
P1、P2、P3、P4 为不同分子量血肽组分。
凝胶层析过程中多肽按照分子量大小先后被洗脱出来，共分离出P1、P2、P3与P4共4个组分，分子量大小顺序依次为P1＞P2＞P3＞P4，根据各组分峰面积，4个组分含量与HPLC相对应，分别收集P2、P3组分，冷冻干燥后研究其抗氧化活性。
2.4 血肽抗氧化活性
血肽粗品、P2组分、P3组分的 ABTS＋自由基、DPPH自由基、羟基自由基、O2-自由基的清除率结果见图4。
图4 血肽粗品与Sephadex G-15分离组分抗氧化活性
Fig.4 Antioxidant activities of crude hemepeptides and Sephadex G-15 isolated components
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
鉴于多肽抗氧化活性存在剂量-效应关系，因此在抗氧化活性测定试验中，确定血肽粗品及各组分质量浓度为3 mg/mL。结果表明，血肽粗品经Sephadex G-15的分离纯化后，多肽组分的抗氧化活性增加，且分子量越低的组分ABTS＋自由基、DPPH自由基、羟基自由基、O2-自由基的清除率越高，分离纯化得到的血肽P3组分具有最强的抗氧化性能。肽的抗氧化活性与其分子量之间存在相关性，其活性可能随着肽分子量的降低而增加，另外，肽的氨基酸组成、序列以及重要氨基酸所在肽链中位置也与多肽抗氧化性相关[21-22]。
3 结论
鸡血血红蛋白通过中性蛋白酶酶解，血红蛋白底物浓度5%，酶添加量1.5%，酶解时间5 h，酶解液离心冻干获得血肽粗品，血肽相对分子质量大部分集中在1 000 Da以下，主要分布于500 Da～1 000 Da与180 Da～500 Da，含量分别为23.97%、66.07%，由此可以推断，在此酶解工艺条件下，可以获得2个～5个氨基酸组成的血肽分子。经交联葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离得到4个洗脱峰，与高效液相色谱分析结果一致。分子量180 Da～500 Da的血肽ABTS＋自由基、DPPH自由基、羟基自由基、O2-自由基的清除率分别为81.28%、52.45%、23.86%与18.14%，高于血肽粗品与500 Da～1 000 Da的血肽，表明纯化后的血肽的抗氧化活性增加，且分子量小的血肽抗氧化活性较高。
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