百香果（Passiflora edulis Sims）是西番莲科西番莲属多年生草质藤本植物，又称为鸡蛋果、西番莲等[1]，其果实口感丰富，含有160多种水果的香气，享有“果汁之王”的美称[2]，食用后具有美容养颜、减脂瘦身等保健效果[3]。目前百香果加工产品，如果汁、果脯、果酱等越来越被消费者喜爱和追捧，经济效益显著。此外百香果还具有当年种植当年挂果，一年中多个采收期的特性，因此已成为我国广西、福建、四川等贫困地区的脱贫果、致富果[4-5]。
国内外研究表明百香果的果肉可提供多种维生素、矿物质、蛋白质，而枝叶则富含较多的次级代谢产物如挥发油、生物碱、三萜类和以槲皮素、牡荆素、木犀草素、芹菜素等为主的黄酮类成分[6-8]。这些成分具有预防癌症、抗氧化衰老、杀菌消炎等功效，特别是黄酮类成分能够清除人体过多的自由基，减轻机体氧化损伤，起着延年益寿，保持机体健康状态的作用[9]。与合成抗氧化剂相比，来自植物的黄酮类天然抗氧化剂副作用少，因此其作为外源性抗氧化剂的应用被广泛关注[10]。
随着我国百香果种植加工产业不断扩大，每年将产生大量果叶，而果园将果叶收集后一般做法是直接丢弃或堆埋[11]，这在一定程度上严重浪费了其中的次级代谢产物资源。已有文献报道百香果根、叶具有消炎止痛、降压、降血糖、治疗失眠和治疗焦虑等传统功效[12-13]，如果将其用于功能性食品开发、食品添加剂开发、化妆品行业等，将极大促进百香果产业副产物中的天然小分子化合物的开发利用[14]。
已有学者优化了单产地百香果叶总黄酮提取工艺[15]，但对于不同产地百香果叶总黄酮含量和活性的比较鲜有报道，而地域环境、气候、降水等因素会使植物中化合物含量及活性产生差异[16]，故本试验选择我国百香果主产地广西北流、福建南平和四川凉山的果叶为试验材料，采用正交设计的方法对其中总黄酮进行提取工艺优化，并考察其体外抗氧化活性，为增加天然抗氧化剂的优良来源，更为我国百香果产品的全面开发提供科学数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫皮百香果叶：分别于2019年3月采自广西北流、福建南平和四川凉山百香果种植园。无水乙醇、无水甲醇（均为分析纯）：现代东方（北京）科技发展有限公司；盐酸、醋酸钠、冰醋酸、氯化铁（均为分析纯）：北京化工厂；三氯化铝（纯度99%）：ACROS Organics公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，纯度96%）：日本东京化成工业株式会社；芦丁（纯度98%）、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ，纯度98%）：上海源叶生物科技有限公司；二丁基羟基甲苯 （butylated hydroxytoluene，BHT，纯度98%）：上海麦克林公司；96孔细胞培养板：美国Corning公司。
1.2 仪器与设备
高速粉碎机（600Y）：永康市铂欧五金制品有限公司；电子分析天平（BT224S）：北京赛多利斯仪器系统有限公司；超声波清洗器（KQ5200E）：昆山市超声仪器有限公司；精密数显恒温水浴锅（J-HH-6A）：上海胜卫电子科技有限公司；旋转蒸发仪（R-215）、循环水式真空泵（MZX-D）：北京精锐泽祥实验仪器有限公司；紫外分光光度计（V-750）：日本分光株式会所；EnSpire酶标仪：美国PerkinElmer公司。
1.3 方法
1.3.1 百香果叶前处理及总黄酮提取
新鲜无腐烂的紫皮百香果叶用蒸馏水清洗，置于阴凉通风处阴干，收集阴干的样品，粉碎，过60目筛，备用。
准确称取样品4 g，置于500 mL圆底烧瓶中，加入不同浓度乙醇，经超声萃取后，85℃水浴提取90 min。所得提取液进行抽滤和旋蒸处理，后置于通风橱吹干，得到总黄酮浸膏。
1.3.2 总黄酮含量的测定
1.3.2.1 芦丁标准曲线绘制
采用调整后的比色法[17]绘制曲线，称取10 mg芦丁用70%乙醇定容至10 mL容量瓶中，得1 mg/mL芦丁母液，分别吸取芦丁母液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于5 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至5 mL，再分别移取不同浓度的芦丁溶液0.2 mL，及0.25 mol/L的AlCl3溶液0.8 mL于10 mL具塞比色管，用高纯水定容至10 mL，摇匀，静置30 min后，在273 nm处分别测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
1.3.2.2 百香果叶总黄酮含量测定
将样品总黄酮浸膏分别配制一定的浓度，移取0.5 mL样品于10 mL具塞比色管中，加入0.25 mol/L AlCl3溶液0.8mL，用高纯水定容至10mL，在273 nm下测定吸光度，计算得到样品的总黄酮含量，结果用每克百香果叶（干重）含有的芦丁当量表示，即为mg RT/g DW。
1.3.3 百香果叶总黄酮超声辅助提取单因素试验
1.3.3.1 液料比对百香果叶总黄酮含量的影响
固定乙醇含量60%，超声时间20 min，液料比分别取 30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g），按照 1.3.1 和1.3.2中的方法进行广西百香果叶总黄酮的提取和总黄酮含量测定。研究不同液料比与百香果叶总黄酮含量的变化关系。
1.3.3.2 超声时间对百香果叶总黄酮含量的影响
固定乙醇含量 60%，液料比 60∶1（mL/g），超声时间分别取 10、15、20、25、30 min，按照 1.3.1 和 1.3.2 中的方法进行广西百香果叶总黄酮的提取和总黄酮含量测定。研究不同超声时间与百香果叶总黄酮含量的变化关系。
1.3.3.3 乙醇含量对百香果叶总黄酮含量的影响
固定液料比 60∶1（mL/g），超声时间 25 min，乙醇含量分别取 20%、40%、50%、60%、70%，按照 1.3.1和1.3.2中的方法进行广西百香果叶总黄酮的提取和总黄酮含量测定。研究不同乙醇含量与百香果叶总黄酮含量的变化关系。
1.3.4 百香果叶总黄酮超声辅助提取正交试验
通过单因素试验，选取液料比、超声时间、乙醇含量的3个水平，并以总黄酮含量为正交试验结果考察指标，进行提取条件的进一步优化。因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 因素A液料比/（mL/g）B超声时间/minC乙醇含量/%1 50∶1 20 40 2 60∶1 25 50 3 70∶1 30 60
1.3.5 不同产地百香果叶体外抗氧化活性测定
1.3.5.1 DPPH自由基清除能力测定
参照Polatoglu等[18]的方法，并根据样品稍作调整，配制0.1 mmol/L的DPPH工作液，及0.25 mg/mL～0.80 mg/mL浓度梯度的样品溶液。分别吸取100 μL不同浓度的样品或BHT和100 μL的DPPH工作液加入96孔板中，混匀，室温25℃避光反应30 min后，于517 nm处测定吸光度值。将不同浓度BHT代替样品，按照上述方法进行测定。同时将甲醇代替样品，作为空白对照，测定其吸光度值，试验均重复3次。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
式中：A0为空白对照的吸光度；A1为样品的吸光度；A2为样品空白（甲醇＋样品溶液）的吸光度。
1.3.5.2 铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定
参照 Ozgen 等[19]，Kheirkhah 等[20]的方法，分别配制300 mmol/L的乙酸缓冲液（pH3.6），10 mmol/L的TPTZ溶液，20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液，并按照体积比 10∶1∶1混合得到 FRAP 工作液。配制 50 μmol/L～800 μmol/L梯度的FeSO4·7H2O标准品溶液吸取20 μL该溶液与180 μLFRAP工作液加入96孔板中混合均匀，37℃避光反应30 min后，于593 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。用样品代替标准品溶液，分别测定样品吸光值，其对应浓度与样品浓度的比值为FRAP值，用每克百香果叶（干重）含有的亚铁离子当量表示其还原能力，即 μmol Fe2＋/g。
1.4 数据处理
本试验所有数据采用SPSS Statistics软件处理与分析，采用Microsoft Excel 2019和GraphPad Prism软件绘图。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线
以芦丁标准品浓度（μg/mL）为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图1。标准方程为y=0.046 3x＋0.098 8，R2=0.999 1，表明在 0.8 μg/mL～4.8 μg/mL内线性关系良好。
图1 芦丁标准曲线
Fig.1 The standard curve line of rutin
2.2 单因素试验结果
2.2.1 液料比对百香果叶总黄酮含量的影响
液料比对百香果叶总黄酮含量的影响如图2所示。
由图2可知，百香果叶总黄酮含量随着液料比的增加呈现先增加后减少的趋势，当液料比达到60∶1（mL/g）时，总黄酮含量最高，为10.78 mg RT/g DW，随后总黄酮含量稍有减少，这可能是因为前期提取溶剂不足，固液接触面积较少，得到总黄酮较少，而后过量的提取溶剂又抑制了总黄酮的提取[21]。因此选择液料比50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）这 3 个水平，继续进行正交试验。
图2 液料比对百香果叶总黄酮含量的影响
Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids in P.edulis Sims leaves
2.2.2 超声时间对百香果叶总黄酮含量的影响
超声时间对百香果叶总黄酮含量的影响如图3所示。
图3 超声时间对百香果叶总黄酮含量的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on total flavonoids in P.edulis Sims leaves
由图3可知，百香果叶总黄酮含量随着超声时间的增加呈现逐渐增加后减少的趋势，当超声时间为25 min时，总黄酮含量最高，为11.32 mg RT/g DW，超声25 min后，黄酮化合物化学结构可能由于长时间的空化作用和机械振动被破坏，造成提取的总黄酮减少[22]。因此选择20、25、30 min这3个水平继续进行正交试验。
2.2.3 乙醇含量对百香果叶总黄酮含量的影响
乙醇含量对百香果叶总黄酮含量的影响如图4所示。
由图4可知，30%～60%的乙醇含量下，百香果叶总黄酮含量变化不明显，当乙醇含量大于60%后，总黄酮含量急剧减少。这可能是由于提取溶剂乙醇的浓度增加，溶剂极性降低，导致某些物质发生沉淀，造成总黄酮含量下降[23]。因此选择50%、60%、70%这3个水平继续进行正交试验。
图4 乙醇含量对百香果叶总黄酮含量的影响
Fig.4 Effect of ethanol concentration on total flavonoids in P.edulis Sims leaves
2.3 正交试验结果及验证
按照正交表，以总黄酮含量为评价指标，优化百香果叶总黄酮提取工艺，结果见表2。
表2 百香果叶总黄酮含量正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment for total flavonoids content in P.edulis Sims leaves
A B C试验号 总黄酮含量/（mg RT/g DW）1 1 1 1 8.15 2 1 2 2 9.25 3 1 3 3 10.10 4 2 1 2 8.67 5 2 2 3 6.46 6 2 3 1 10.35 7 3 1 3 10.39 8 2 1 9.94 9 3 3 2 10.01 3 k1 9.165 9.107 9.514 k2 8.528 8.551 9.309 k3 10.148 10.183 9.018 R 1.620 1.632 0.496
由表2可知，影响百香果叶总黄酮含量的因素主次为B＞A＞C，即超声时间＞液料比＞乙醇含量。最佳提取方案为 A3B3C1，即液料比 70∶1（mL/g），超声时间 30 min，乙醇含量40%。
采取最佳提取条件，重复3次提取广西北流百香果叶总黄酮，测得总黄酮含量平均值为11.55mgRT/gDW，均高于9组正交试验结果，且与乙醇提取法[15]相比，本提取方法的总黄酮含量增加，表明该工艺具有可靠性。同时以最佳工艺提取福建南平和四川凉山的百香果叶总黄酮，计算其总黄酮含量，结果如表3所示。
表3 百香果叶总黄酮含量
Table 3 Total flavonoids content in P.edulis Sims leaves
产地原料/g浸膏得率/%总黄酮含量/（mg RT/g DW）广西北流 4 17.37 11.55福建南平 4 7.50 13.67四川凉山 4 14.98 14.86
2.4 抗氧化活性结果
2.4.1 百香果叶对DPPH·清除能力测定
三产地百香果叶总黄酮对DPPH·清除能力见图5。
图5 百香果叶DPPH·清除能力
Fig.5 Scavenging ability of total flavonoids in P.edulis Sims leaves on DPPH·
由图5可知，DPPH·清除率随着三产地样品与阳性对照BHT浓度的增加而增加，且三产地样品浓度在0.80 mg/mL后的DPPH·清除能力与BHT相差不大，邹江冰等[24]也发现百香果叶对DPPH·具有清除能力。四川凉山的百香果叶总黄酮在0.20 mg/mL时，DPPH·清除率已经达到了50%以上，表现了在3个产地样品中相对较强的DPPH·清除能力，而广西北流的样品则相对较弱。以上结果说明三产地百香果叶总黄酮具有DPPH·清除能力，且不同产地样品具有差异性。
2.4.2 百香果叶亚铁离子还原能力测定
以 Fe2＋标准品浓度（mmol/L）为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图6。标准方式为y=0.980 2x＋0.062，R2=0.999 1，表明在 0.05 mmol/L～0.8 mmol/L线性关系良好。
图6 Fe2+标准曲线
Fig.6 The standard curve line of Fe2+
在FRAP试验中，通过Fe2＋浓度来反映抗氧化能力，所得数值越大说明其抗氧化能力越强。三产地样品的亚铁离子还原能力见表4。
表4 百香果叶亚铁离子还原能力
Table 4 Fe2+reduction ability of total flavonoids in P.edulis Sims leaves
产地FRAP值/（μmol Fe2＋/g）广西北流 12.08福建南平 61.81四川凉山 78.11
如表4所示，三产地样品中，四川凉山样品抗氧化能力最强，数值约为 78.11 μmol Fe2＋/g，广西北流样品FRAP值最低，显示最弱的亚铁离子还原能力。
3 结论
本研究采用超声辅助乙醇提取法，分别考察了液料比、超声时间和乙醇含量对百香果叶总黄酮含量的影响，在单因素的基础上采用三因素三水平正交试验优化百香果叶总黄酮提取工艺。最佳提取工艺：液料比 70∶1（mL/g），超声时间 30 min，乙醇含量 40%，在此条件下广西北流、福建南平和四川凉山的百香果叶总黄酮含量分别为11.55、13.67、14.86 mg RT/g DW，同时体外抗氧化试验表明，三产地百香果叶有不同的抗氧化能力，其中四川凉山样品抗氧化能力最强，福建南平次之，这可能与其总黄酮含量具有一定的相关性，但仍需后续试验进一步探究作用机制，以明确总黄酮含量与抗氧化活性的关系。
百香果口感独特，味美多汁，备受人们青睐，其副产物百香果叶是黄酮类化合物的重要来源，但在整体产业加工过程中，果叶却被堆埋，造成了天然化合物的浪费。本研究证明百香果叶中确实存在较丰富的黄酮类化合物，并显示出抗氧化活性，且因地理位置的不同三产地样品总黄酮含量和抗氧化活性均存在差异。研究结果对高效利用百香果天然植物资源，合理开发功能性产品具有一定的意义，符合当今绿色食品、持续发展的要求。
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