人参果是一种浆果类作物，其果肉清爽多汁，味道清甜，富含维生素和微量元素，特别是钙和硒含量高于大多数水果[1-2]，具有消炎、抗衰老、补钙、降血压、降血糖、美容等功效[3]。因此，将人参果加工成各类产品会有较大的市场潜力。铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我国传统名贵药材，在其种植过程中盛开的石斛花，不仅具有观赏价值，而且具有重要的开发价值[4]。铁皮石斛花作为一种新食品原料[5]，其含有丰富的多糖、氨基酸、黄酮等营养成分，具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等药理作用[6-7]。目前铁皮石斛花的相关产品还停留在初加工水平，造成了一定的资源浪费[8]，因而有必要开发其高附加值的产品。
复合型发酵酒是利用两种或多种富含可发酵性糖酿造而成的低酒精度饮品[9]，经过酿造工艺优化后能够综合几种原料的香味、风味物质及营养成分，使产品的口感、香气及滋味更加丰富[10-11]。基于此，在单因素试验的基础上运用响应面法，以人参果和铁皮石斛花为主要原料，探究人参果铁皮石斛花复合果酒感官评分和酒精度含量最高时的最优生产工艺，并检测其黄酮类物质的含量，为人参果和铁皮石斛花资源的开发利用提供一定的参考价值，为新型复合果酒的研发、酿造提供数据支撑和指导作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁皮石斛花：于2018年5月采自云南品斛堂生物科技有限公司云南龙陵石斛种植基地，采摘后烘干，粉碎后过40目筛，待用；新鲜人参果、白砂糖：市售；酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；鞣花酸、杨梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚、花旗松素：成都曼思特生物科技有限公司；偏重亚硫酸钾、维生素 C（vitamin C，VC）（均为食品级）：天津市大茂化学试剂厂；柠檬酸（食品级）：湖北鑫润德化工有限公司。
1.2 仪器与设备
CP214型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-S28S型数显恒温水浴锅；金坛市大地自动化仪器厂；JHBE-50T型闪式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；LRHS-250-II型生化培养箱：上海跃进器械有限公司；1200型高速液相色谱系统：美国Agilent公司。
1.3 试验方法
1.3.1 人参果铁皮石斛花复合果酒生产工艺流程
人参果→洗涤→榨汁→装瓶→添加铁皮石斛花粉→成分调整→巴氏灭菌→接种→主发酵→固液分离→低温贮存→过滤→成品
操作要点：选取新鲜的人参果去皮后放入闪式提取器中榨汁[料水比 1∶1（g/mL）]，并加入 0.08%VC用于护色，取100 mL加入250 mL的三角瓶内，按照一定比例添加铁皮石斛花粉，加糖调整到试验所需糖度并加入0.01%偏重亚硫酸钾，利用柠檬酸将果汁的pH值调整为4.0，巴氏灭菌（65℃、30 min）后待冷却按体积分数接入一定量经活化后的酵母菌悬液（在酿酒酵母粉中加入10倍质量30℃的纯净水，活化20 min），在一定温度条件下发酵，主发酵7 d结束；固液分离后15℃贮存3 d，4层纱布过滤后得到成品。
1.3.2 人参果铁皮石斛花复合果酒生产工艺单因素优化试验
参考刘琨毅等[12]的方法，在4%铁皮石斛花添加量、20.0%初始糖度、0.03%酿酒酵母接种量及22℃发酵温度的基础条件下，每次只改变4个因素中的1个因素，保持其他因素不变，分别设置铁皮石斛花添加量（0%、2%、4%、6%、8%）、初始糖度（15.0%、17.5%、20.0%、22.5%、25.0%）、酿酒酵母接种量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）及发酵温度（18、20、22、24、26℃），以感官评分及酒精度为指标，每组试验重复3次进行单因素试验。
1.3.3 人参果铁皮石斛花复合果酒生产工艺响应面优化试验
在单因素试验的基础上，以铁皮石斛花添加量（A）、初始糖度（B）、酿酒酵母接种量（C）、发酵温度（D）为4个因素，以感官评分（Y1）和酒精度（Y2）为考察指标设计进行响应面试验。
1.3.4 人参果铁皮石斛花复合果酒感官评价方法
感官评分由11名（6男5女）品酒师组成的感官评定小组参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]对人参果铁皮石斛花复合果酒从外观、香气、滋味、风格4个方面进行感官评分，满分100分，每个样品的感官评分取平均分，评分标准见表1。
表1 人参果铁皮石斛花复合果酒的感官评分标准
Table 1 Sensory score standards of pepino fruit and D.officinale′s flower compound fruit wine
指标 感官评分 标准外观 8～10 浅黄色、无明显悬浮物、有光泽5～7 黄色、较澄清、无夹杂物0～4 深黄色、浑浊、失光香气 21～30 香气协调、浓郁11～20 香气较协调，但不浓郁0～10 香气不协调、有异香滋味 31～40 口味纯正、细腻，酒体丰满，无异味21～30 酒体较丰满、较柔和0～20 口味不纯正，有一定的苦涩味风格 15～20 具有复合果酒独特的风格，品质优雅9～14 有典型性，不够怡雅0～8 酒体尚协调，有缺陷
1.3.5 人参果铁皮石斛花复合果酒黄酮类物质测定方法
按照前期建立的方法，应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 检测人参果铁皮石斛花复合果酒中黄酮类成分，并根据峰面积使用外标法进行定量分析[14]。
1.4 数据分析
以上每个试验重复3次，结果以平均值±标准差表示。采用OriginPro 12.1软件进行数据制图，应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，利用Design Expert 10.1软件进行响应面设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 人参果铁皮石斛花复合果酒单因素试验
不同铁皮石斛花添加量对人参果石斛花复合果酒品质的影响如图1所示。
图1 不同铁皮石斛花添加量对人参果石斛花复合果酒品质的影响
Fig.1 Effects of different addition of D.Officinale′s flower on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine
不同小写字母表示感官评分之间差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示酒精度之间差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，随着铁皮石斛花添加量的增加，人参果铁皮石斛花复合果酒的感官评分呈现先升后降的趋势。铁皮石斛花添加量为6%时，复合果酒感官评分达到最高，为84.7±0.8；当铁皮石斛花添加量继续增加后，复合果酒的感官评分显著下降（P＜0.05）。当铁皮石斛花添加量较低（＜6%）时，复合果酒香气较为寡淡，故造成复合果酒的感官评分不高；当铁皮石斛花添加量较高时（＞6%），人参果香气不突出且复合果酒的香气不愉悦。加之复合果酒的酒精度不随铁皮石斛花添加量的变化而显著变化（P＞0.05），由此，选择铁皮石斛花添加量为6%用于后续试验。
不同初始糖度对人参果石斛花复合果酒品质的影响如图2所示。
图2 不同初始糖度对人参果石斛花复合果酒品质的影响
Fig.2 Effects of different initial sugar content on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine
不同小写字母表示感官评分之间差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示酒精度之间差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，当初始糖度从15.0%增加至22.5%时，人参果铁皮石斛花复合果酒的感官评分呈上升趋势，其感官评分最高分为86.2±1.1；当初始糖度继续增加后，复合果酒的感官评分反而下降。初始糖度直接影响复合果酒的发酵过程，糖分是酵母发酵主要动力来源，在发酵过程中，糖分转化成乙醇、酸类、酯类等物质[15]。初始糖度过低，酵母发酵动力不足；初始糖度过高，导致复合果酒残糖过多影响感官品质[16]。虽然酒精度随着初始糖度的增加而增加，但是初始糖度从22.5%增加到25.0%时酒精度增加了3.4%，但感官评分却下降较多。综合考虑复合果酒感官评分和酒精度，选择初始糖度为22.5%进行后续试验。
不同酿酒酵母接种量对人参果石斛花复合果酒品质的影响如图3所示。
由图3可知，随着酿酒酵母接种量的逐渐增加，复合果酒的感官评分与酒精度均呈先上升后下降的趋势。在酿酒酵母接种量为0.04%时，感官评分与酒精度均达到最高值，分别为 88.7±0.7、（11.7±0.1）%vol。酿酒酵母是主要的产酒精的微生物，在发酵过程中生成酒精及其他的香气成分[17]。酵母接种量较低时，不能充分发酵糖分，导致糖分过剩，酒精度过低；而过高的酵母接种量，并不能提高复合果酒的酒精度，反而使发酵不完全[18]。综合考虑，选择酿酒酵母接种量为0.04%进行后续试验。
图3 不同酿酒酵母接种量对人参果石斛花复合果酒品质的影响
Fig.3 Effects of different inoculation of S.cerevisiae on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine
不同小写字母表示感官评分之间差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示酒精度之间差异显著（P＜0.05）。
不同发酵温度对人参果石斛花复合果酒品质的影响如图4所示。
图4 不同发酵温度对人参果石斛花复合果酒品质的影响
Fig.4 Effects of different fermentation temperature on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine
不同小写字母表示感官评分之间差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示酒精度之间差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，发酵温度直接影响复合果酒的品质，当发酵温度从18℃上升至26℃时，复合果酒感官评分呈现出先升高后降低的趋势。当发酵温度为22℃时，复合果酒感官评分达到最高分，为88.7±0.7。复合果酒的酒精度随着发酵温度的升高而增加，当发酵温度从24℃升高至26℃时，酒精度增加不再显著（P＞0.05）。当发酵温度为18℃时，酵母菌生长相比22℃时受到一定的抑制，酒体发酵不充分，复合果酒酒精度偏低进而影响感官品质；当发酵温度从22℃升高至26℃时，酵母菌的生长速度逐渐加快、代谢活跃，导致酒体整体风味不佳进而促使感官评分显著降低[18]。综合考虑，选择发酵温度为22℃进行后续试验。
2.2 人参果铁皮石斛花复合果酒响应面法试验
人参果铁皮石斛花复合果酒生产工艺优化响应面试验设计及结果见表2。
表2 人参果铁皮石斛花复合果酒生产工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine
试验号A铁皮石斛花添加量/%B初始糖度/%C酿酒酵母接种量/%D发酵温度/℃Y1感官评分Y2酒精度/%vol 1 1（8） 1（25.0） 0（0.04） 0（22） 79.1 11.2 2 -1（4） 1 0 0 78.5 11.1 3 1 0（22.5） -1（0.03） 0 82.7 11.7 4 0（6） 0 0 0 86.7 12.3 5 0 0 0 0 87.2 12.4 6 0 1 -1 0 79.3 11.2 7 -1 0 1（0.05） 0 79.9 11.3 8 -1 0 0 1（24） 81.3 11.5 9 1 0 0 1 81.6 11.6 10 0 -1（20.0） -1 0 80.1 11.3 11 1 -1 0 0 86.5 12.2 12 0 0 -1 1 79.3 11.2 13 0 0 0 0 87.8 12.4 14 1 0 0 -1（20） 85.4 12.1 15 0 1 0 1 81.4 11.5 16 -1 0 0 -1 81.7 11.6 17 0 0 1 1 82.5 11.7 18 0 -1 0 -1 84.3 11.9 19 1 0 1 0 81.0 11.5 20 0 0 0 0 88.2 12.4 21 0 0 -1 -1 85.9 12.2 22 -1 -1 0 0 78.8 11.2 23 0 1 0 -1 85.8 12.1 24 0 -1 0 1 78.0 11.0 25 0 1 1 0 79.0 11.2 26 0 0 0 0 88.8 12.2 27 0 0 1 -1 79.6 11.3 28 0 -1 1 0 78.6 11.1 29 -1 0 -1 0 79.0 11.2
对试验数据进行方差分析[19]，结果如表3所示。
表3 响应面结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface results
注：*表示对结果影响显著（P＜0.05），**表示对结果影响极显著（P＜0.01），N表示差异不显著。
images/BZ_68_654_419_668_446.pngimages/BZ_68_903_419_917_446.pngimages/BZ_68_1208_419_1222_446.pngimages/BZ_68_1569_419_1582_446.pngimages/BZ_68_1930_419_1943_446.png方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性Y1 Y2 Y1 Y2 Y1 Y2 Y1 Y2 Y1 Y2 Y1 Y2模型 303.12 5.52 14 14 21.65 0.39 8.59 8.48 0.000 1 0.000 1 ** **A 24.37 0.48 1 1 24.37 0.48 9.67 10.32 0.007 7 0.006 3 ** **B 0.85 0.01 1 1 0.85 0.01 0.34 0.29 0.569 9 0.600 8 N N C 2.71 0.04 1 1 2.71 0.04 1.07 0.88 0.317 6 0.364 7 N N D 28.83 0.61 1 1 28.83 0.61 11.44 13.06 0.004 5 0.002 8 ** **AB 12.60 0.20 1 1 12.60 0.20 5.00 4.35 0.042 2 0.055 7 * N AC 1.69 0.02 1 1 1.69 0.02 0.67 0.48 0.426 6 0.498 1 N N AD 2.89 0.04 1 1 2.89 0.04 1.15 0.86 0.302 4 0.369 5 N N BC 0.36 0.01 1 1 0.36 0.01 0.14 0.21 0.711 2 0.650 0 N N BD 0.90 0.02 1 1 0.90 0.02 0.36 0.48 0.559 2 0.498 1 N N CD 22.56 0.49 1 1 22.56 0.49 8.95 10.53 0.009 7 0.005 9 ** **A2 64.50 0.99 1 1 64.50 0.99 25.59 21.30 0.000 2 0.000 4 ** **B2 99.46 1.90 1 1 99.46 1.90 39.46 40.79 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ** **C2 115.97 1.99 1 1 115.97 1.99 46.01 42.70 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ** **D2 19.66 0.27 1 1 19.66 0.27 7.80 5.77 0.014 4 0.030 8 * *残差 35.29 0.65 14 14 2.52 0.05失拟项 32.58 0.62 10 10 3.26 0.06 4.80 7.74 0.071 9 0.031 7 N N纯误差 2.71 0.03 4 4 0.68 0.01总离差 338.41 6.17 28 28
分别以感官评分（Y1）和酒精度（Y2）为响应值，经回归拟合后，得到相应的回归方程：Y1=87.74＋1.43A-0.27B-0.47C-1.55D-1.78AB-0.65AC-0.85AD+0.30BC＋0.48BD＋2.38CD-3.15A2-3.92B2-4.23C2-1.74D2；Y2=12.34＋0.20A-0.03B-0.06C-0.23D-0.23AB-0.08AC-0.10AD＋0.05BC＋0.08BD＋0.35CD-0.39A2-0.54B2-0.55C2-0.20D2。
根据方差分析，模型极显著（P＜0.01），且失拟项不显著（P＞0.05），表明未知因素对试验结果的干扰较小（表3），可以通过模型确定以感官评分与酒精度为响应值时人参果铁皮石斛花复合果酒酿造的最佳工艺条件[20-21]。感官评分的相关系数R2=0.8957、R2adj=0.7914，酒精度的相关系数R2=0.894 5、R2adj=0.788 9，说明感官评分和酒精度的试验值与预测值之间有较好的拟合度；感官评分与酒精度的变异系数（C.V.）分别为1.93%、1.85%，均小于5.00%，表明模型重现性较好。4个因素对复合果酒感官评分的影响次序为D＞A＞C＞B，即发酵温度对复合果酒感官评分的影响最为显著，其次是铁皮石斛花添加量，再次是酿酒酵母接种量。一次项 A、D，交互项 CD，二次项 A2、B2、C2对复合果酒感官评分的影响极显著（P＜0.01）；交互项AB，二次项D2对复合果酒感官评分的影响达到了显著水平（P＜0.05）。各因素交互作用对人参果铁皮石斛花复合果酒感官评分影响的响应曲面结果见图5。
由图5可知，4个因素的两两相互作用中，因素C与因素D所形成的响应面曲面坡度最为陡峭与方差分析中交互项CD对复合果酒感官评分的影响极显著（P＜0.05）的结论相吻合。
图5 各因素交互作用对人参果铁皮石斛花复合果酒感官评分影响的响应曲面
Fig.5 Response surface plot of interactive of various factors on sensory evaluation of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine
由表3知，发酵温度对复合果酒酒精度的影响最为显著，其次是铁皮石斛花添加量，再次是酿酒酵母接种量，最后是初始糖度。一次项A、D，交互项CD，二次项A2、B2、C2对复合果酒酒精度的影响极显著（P＜0.01）；二次项D2对复合果酒酒精度的影响达到了显著水平（P＜0.05）。各因素交互作用对人参果铁皮石斛花复合果酒酒精度影响的响应曲面结果见图6。
由图6可知，4个因素的两两相互作用中，因素C与因素D所形成的响应面曲面坡度最为陡峭，表明酿酒酵母接种量与发酵温度的交互作用对复合果酒酒精度的影响最为显著。
图6 各因素交互作用对人参果铁皮石斛花复合果酒酒精度影响的响应曲面
Fig.6 Response surface plot of interactive of various factors on alcohol content of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine
通过响应面软件分析，复合果酒在铁皮石斛花添加量6.84%、初始糖度22.03%、酿酒酵母接种量0.04%、发酵温度为20.42℃的条件下，感官评分可获得最高的理论值89.749 6；在铁皮石斛花添加量6.97%、初始糖度21.95%、酿酒酵母接种量0.04%、发酵温度为20.00℃的条件下，酒精度可获得最高的理论值12.530 7%vol。后续在铁皮石斛花添加量7%、初始糖度22%、酿酒酵母接种量0.04%、发酵温度为20℃的条件下进行3组平行试验，其感官评分与酒精度分别为 90.1±0.8 与（12.5±0.1）%vol，测定结果稳定与理论值相差不大，证明该结果合理可靠。
2.3 人参果铁皮石斛花复合果酒黄酮类物质分析
测定人参果铁皮石斛花复合果酒在经响应面优化后的工艺条件下黄酮类物质的含量，结果如表4所示。
表4 人参果铁皮石斛花复合果酒黄酮类物质含量
Table 4 The Content of flavonoids in pepino fruit and D.Officinale′s flower compound fruit wine μg/mL
花旗松素 芦丁 鞣花酸 杨梅素7.3±0.7 147.1±11.6 12.6±1.0 1.1±0.1
在复合果酒中检测出4种黄酮类物质，分别为花旗松素、芦丁、鞣花酸和杨梅素，其总含量为（168.1±13.4）μg/mL。研究表明，上述4种物质均具有重要的生物活性，如花旗松素具有抗氧化、抗炎、抑制肿瘤等生理功能[22]；芦丁对痛风、心血管疾病和糖尿病的治疗有一定作用[23]；鞣花酸能够预防人类骨肉瘤[24]；杨梅素可以改善由免疫应答引起的炎症反应[25]。
3 结论
经过响应面试验得到人参果铁皮石斛花复合果酒的最优酿造条件：在鲜榨的人参果汁中添加7%铁皮石斛花，并加入0.08%VC，调整初始糖度为22%与pH值为4.0，随后加入0.01%偏重亚硫酸钾，巴氏灭菌后接入0.04%酿酒酵母，于20℃条件下发酵7 d，固液分离，液体15℃贮存3d。在此条件下可获得浅黄透明、酒香和谐、滋味爽口，感官评分为90.1±0.8，酒精度（12.5±0.1）%vol和黄酮类物质含量（168.1±13.4）μg/mL的人参果铁皮石斛花复合果酒，其中发酵温度对复合果酒感官评分与酒精度的影响最为显著，其次是铁皮石斛花添加量，再次是酿酒酵母接种量，最后是初始糖度。试验结果为拓宽人参果与铁皮石斛花的应用范围提供了理论依据。
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