线叶金雀花是产于南非的一种开花灌木植物，其作为茶或药用在国外已有300多年的历史，2014年我国卫计委将其列为新食品原料[1]。因其制作的茶味道甜美、气味芬芳，不含咖啡因，鞣质少，具有较强的抗氧化性能，是一种草本植物饮品[2]。线叶金雀花的研究主要集中在抗炎[3]、缓解皮肤干燥[4]、降血糖[5]、抗疲劳[6]、抗癌症[7]等药理作用和含有的多酚类物质[8-9]等化学成分的研究，作为新食品原料的线叶金雀花与其他不少植物相似，同样含有丰富的天然色素，与合成色素相比，安全性较高，且具有一定的营养价值和药理作用，但目前对线叶金雀花色素的提取研究鲜见报道。
色素常用的提取方法有浸提法、碱法、超声波法、酶法等。浸提法[10-11]浸提时间长、效率低、分离效果不好。碱法[12]操作简便，但会产生大量腐蚀性较强的废液，对环境带来了较大的负面影响。酶法提取主要采用酶破坏细胞壁结构使色素释放，提取效率较高，但酶法提取后尚需后处理步骤[13]。同其他提取法相比，利用超声波技术在提取过程中产生的强烈振荡、空化作用等机械效应能使溶剂有效渗入植物细胞壁[14]中，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本、甚至还可以提高产品的质量和产量[15-16]。本文使用超声辅助提取方法，探索线叶金雀花色素的最佳提取工艺参数，为线叶金雀花中色素的提取及应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
线叶金雀花：Carmien公司（南非）；无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验用水为蒸馏水。
TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；UV1700PC紫外可见分光光度计：南京科捷分析仪器有限公司；超声波清洗器：宁波双嘉仪器有限公司；XL-10B中药微型粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机：上海浦东光学仪器厂；JA103PL电子天平：上海精密科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 原料处理
将线叶金雀花清洗后，置于60℃烘箱烘干，粉碎过40目筛后4℃保存备用。
1.2.2 线叶金雀花色素提取工艺
0.5 g线叶金雀花粉末加入乙醇溶液混匀→设置相应的超声温度和超声时间→提取液8 000 r/min离心10 min→过滤后得到线叶金雀花色素提取液。
1.2.3 线叶金雀花色素最大吸收波长的测定
在三角瓶中放入0.5 g线叶金雀花粉末按照料液比1∶50（g/mL），以50%乙醇溶液作为提取剂，设置提取温度40℃、超声时间30 min，然后将提取液以8 000 r/min离心10 min，过滤后，取0.5 mL置于50 mL容量瓶中，定容后，用紫外可见分光光度计在250 nm～800 nm的范围内进行，得到光谱曲线，确定线叶金雀花色素的最大吸收波长。
1.2.4 线叶金雀花色素提取单因素试验
通过测定并比较色素提取液吸光度大小，研究不同料液比[1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）]、提取温度（30、40、50、60、70℃）、提取时间（20、30、40、50、60 min）、提取液乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%）对线叶金雀花色素提取量的影响。
1.2.5 响应面法优化线叶金雀花色素提取工艺
使用Design-Expert软件根据单因素试验所获得的结果设计响应面模型[17-18]，在提取温度为60℃的条件下，以线叶金雀花色素的吸光度值为响应指标，设计三因素（提取时间、乙醇浓度、料液比）的响应面模型，对响应面模型得到的结果进行分析，研究超声时间、乙醇浓度以及料液比对线叶金雀花色素吸光度的影响。响应面因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels of the response surface analysis
水平提取时间/min乙醇浓度/%料液比/（g/mL）-1 30 40 1∶40 0 40 50 1∶50 1 50 60 1∶60
2 结果与分析
2.1 线叶金雀花色素吸收光谱特征
线叶金雀花色素吸收光谱特征见图1。
图1 线叶金雀花色素吸收光谱特征
Fig.1 Absorption spectral characteristics of pigment from rooibos
如图1所示，在250 nm～800 nm范围内，线叶金雀花色素在280 nm和320 nm处有明显的吸收峰，最大吸收峰为280 nm。因此选取280 nm作为测定线叶金雀花色素溶液吸光度的特定波长。
2.2 单因素试验的数据分析
2.2.1 提取时间对线叶金雀花色素提取效果的影响
提取时间对线叶金雀花色素提取效果的影响见图2。
图2 提取时间对线叶金雀花色素提取效果的影响
Fig.2 The effect of extraction time on the pigment from rooibos
如图2所示，超声提取时间在20 min～40 min范围内，线叶金雀花色素的吸光度值随着超声提取时间的延长而增加，超声时间超过40 min后，线叶金雀花色素的吸光度值不仅没增加反而减小，这可能是因为线叶金雀花粉末与乙醇充分接触，传质达到饱和[19]，线叶金雀花色素已充分溶出，继续延长时间，在超声波作用下，部分色素遭到破坏[20]，从而使提取液的吸光度值下降，因此，本研究把提取时间30 min～50 min作为响应面法的考察范围。
2.2.2 乙醇浓度对线叶金雀花色素提取效果的影响
乙醇浓度对线叶金雀花色素提取效果的影响见图3。
图3 乙醇浓度对线叶金雀花色素提取效果的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on pigment from rooibos
如图3所示，乙醇浓度在30%～50%范围内，线叶金雀花色素的吸光度伴随着乙醇浓度的增大而增大，这可能是由于随着乙醇浓度的增加，使色素加速溶解在提取剂中，导致吸光度值增加。乙醇浓度超过50%之后，线叶金雀花色素的吸光度值逐渐减小，这可能是由于随着乙醇浓度的继续增加，导致溶剂极性降低，进而降低水溶性色素的溶出，吸光度值降低[21]。本研究把提取液的乙醇浓度40%～60%作为响应面法的考察范围。。
2.2.3 提取温度对线叶金雀花色素提取效果的影响
提取温度对线叶金雀花色素提取效果的影响见图4。
图4 提取温度对线叶金雀花色素提取效果的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on pigment from rooibos
如图4所示，提取温度在30℃～60℃范围内，线叶金雀花色素的吸光度值伴随着提取温度的升高而逐渐增大，这是由于提取温度升高，加速了分子间的热运动，使色素分子加速溶出[22]，溶液中色素的含量增加，所以线叶金雀花色素溶液的吸光度变大。当提取温度超过60℃后，提取的色素溶液的吸光度有所下降，这可能温度过高，部分色素被破坏，所以本研究将线叶金雀花色素的提取温度设为60℃。
2.2.4 料液比对线叶金雀花色素提取效果的影响
料液比对线叶金雀花色素提取效果的影响见图5。
图5 料液比对线叶金雀花色素提取效果的影响
Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on pigment from rooibos
如图 5 所示，在 1∶40（g/mL）到 1∶80（g/mL）范围内，随着提取溶剂的增加，线叶金雀花色素的吸光度值呈先增大后减小的趋势，这可能是由于料液比的增大使色素分子与溶剂的接触面积变大，色素分子在溶剂中溶解增加，所以吸光度值增大[23]。但当料液比增大至1∶50（g/mL）以后，由于溶剂将色素相对稀释，使提取液的吸光度值减小。料液比过大也会增加浓缩的成本[24]，因此综合考虑及提取效率，本研究将料液比设定为1∶40（g/mL）～1∶60（g/mL）作为响应面法的考察范围。
2.3 响应面优化结果分析
2.3.1 响应面优化设计及结果
利用Design-Expert软件，在提取温度为60℃条件下，设计三因素（提取时间、乙醇浓度、料液比）的17次试验（中心点试验要重复5次），将线叶金雀花色素的吸光度作为响应指标，来优化线叶金雀花色素的提取工艺，模型设计及结果见表2，回归方差分析见表3。
表2 线叶金雀花色素的响应面试验设计及结果
Table 2 Test design and the results of response surface of pigment from rooibos
试验编号 A提取时间/min B乙醇浓度/%C料液比/（g/mL） 吸光度1-1 -1 0.798 2 0 0 0 0.821 0 3 1 0.716 4-1 0 1 0.709 5-1 1 0 0.747 6 0 0 0 0.815 1 0 7 0 0.818 8 0 0 0 0.824 1 1-1 0.823 10 0 1 1 0.751 11 -1 0 -1 0.831 12 0 -1 1 0.681 13 1 -1 0 0.737 14 0 1 -1 0.789 15 -1 -1 0 0.783 16 0 0 0 0.824 17 0 0 0 0.804 9 1 0
2.3.2 模型建立及显著性分析
利用Design-Expert软件对响应面模型进行ANOVA处理，得到回归方差分析表以及得到了提取线叶金雀花色素的二次模型方程：吸光度=0.82＋3.000×10-3A＋0.013B-0.048C＋0.029AB＋3.75×10-3AC＋0.02BC-0.016A2-0.031B2-0.032C2。由表3可以看出此模型的显著（P＜0.05），失拟项不显著（P＞0.05），决定系数为R2为0.970 1，信噪比为15.151，说明该模型试验结果可信度高，可以用来对线叶金雀花色素的提取工艺条件的预测。其中，A、B、C 3个因素，因素A不显著（P＞0.05），因素 B 和 C 显著（P＜0.05），二次项 A2、B2、C2均显著（P＜0.05）。根据表3可以看出，3个因素影响大小依次为C料液比＞B乙醇浓度＞A提取时间。其中料液比对线叶金雀花色素的提取影响最大（P＜0.000 1）。
表3 回归方差分析表
Table 3 Regression simulation analysis of variance
注：*表示显著（P＜0.05）；**表示高度显著（P＜0.01）；P＞0.05为不显著。
方差来源 平方和 自由度 均方和 F值 P值 显著性模型 0.035 9 3.921×10-325.27 0.000 2 **A提取时间 7.20×10-5 1 7.200×10-50.46 0.517 7 B乙醇浓度 1.404×10-3 1 1.404×10-39.05 0.019 7 *C料液比 0.018 1 0.018 118.78＜0.000 1 **AB 3.422×10-3 1 3.422×10-322.05 0.002 2 **AC 5.625×10-5 1 5.625×10-50.36 0.566 1 BC 1.560×10-3 1 1.560×10-310.06 0.015 7 *A2 1.035×10-3 1 1.035×10-3 6.67 0.036 4 *B2 3.962×10-3 1 3.962×10-325.53 0.001 5 **C2 4.359×10-3 1 4.359×10-328.09 0.001 1 **残差 1.086×10-3 7 1.552×10-4失拟项 8.010×10-4 3 2.670×10-43.74 0.117 3 不显著纯误差 2.85×10-4 4 7.130×10-5总离差 0.036 16决定系数R2 Radj2信噪比C.V.0.970 1 0.931 7 15.15 1 1.60%
在提取温度为60℃时，根据响应面优化选择线叶金雀花色素的最佳提取条件为超声提取时间39.56min、乙醇浓度 49.5%、料液比 1∶42.35（g/mL），理论预测的吸光度值为0.836。
2.3.3 响应面结果分析
利用Design-expert软件通过响应面优化结果，得到A提取时间、B乙醇浓度、C料液比这3个因素之间的交互作用对线叶金雀花色素吸光度的影响大小的3D面线图以及等高线图如图6所示。
分析响应曲面图和等高线可以说明各因素对响应值的贡献，等高线的形状也可直观看出交互效应的大小，等高线为椭圆形时，说明两因素的交互作用较强[25]。
由图6a、b、e、f所示，图形明显呈现为椭圆，说明A提取时间和B乙醇浓度两个因素及B乙醇浓度和C料液比交互作用显著，料液比和提取时间的交互作用不显著。沿着A提取时间向峰值方向的等高线密度比沿着B乙醇浓度向峰值方向的等高线密度低，说明B乙醇浓度对线叶金雀花色素的吸光度值大小影响更大。当料液比为1∶50（g/mL）时，B乙醇浓度在40%～60%范围内和A超声时间在30 min～50 min范围内时，随着乙醇浓度的增加，线叶金雀花色素的吸光度值大小先增大后减小。沿着B乙醇浓度向峰值方向的等高线密度比沿着C料液比向峰值方向的等高线密度低，说明C料液比对线叶金雀花色素的吸光度值影响更大。当提取时间为40 min时，B乙醇浓度在40%～60%范围内和 C 料液比在 1∶40（g/mL）～1∶60（g/mL）范围内时，随着乙醇浓度的增大，线叶金雀花色素的吸光度值先增大后减小。
图6 各种因素对线叶金雀花色素提取效果的交互作用及其响应面图
Fig.6 Interaction of various factors on pigment from rooibos and its response surface diagram
2.4 最佳工艺验证试验
在验证试验中，将线叶金雀花色素提取条件设置为提取温度60℃，乙醇浓度50%，提取时间40 min，料液比1∶40（g/mL），进行3次平行试验测得线叶金雀花色素的平均吸光度值为0.824，与理论预测值相接近。
3 结论
本研究通过响应面试验确定超声提取线叶金雀花色素的最佳工艺条件：提取温度为60℃，乙醇浓度设定为 50%，提取时间为 40 min，料液比为 1∶40（g/mL），在此条件下，提取液中线叶金雀花色素的吸光度值为0.824。3个因素对色素提取的影响大小依次为料液比＞乙醇浓度＞提取时间。下一步应对线叶金雀花色素的成分进行进一步分析研究，为今后更好地利用线叶金雀花资源提供理论依据。
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