黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是青藏高原特色资源多棘刺灌木植物，其果实具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血压和保肝等生理活性[1]。黑果枸杞汁中酶促褐变的关键酶多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）能催化酚类羟基转化为邻苯二酚，再催化邻苯二酚转化为有色醌类物质，最终造成褐变[2]，而且多酚氧化酶能促进黑果枸杞汁中关键抗氧化活性物质多酚类和花青素的降解[3]，导致其保健功能和生理作用的减弱。由于酶是一类具有催化作用的蛋白质，它的功能活性与结构密切相关。近年来，相关学者为研究酶活性变化的相关机理，对其蛋白高级结构也进行了相关探究。相关研究都表明可以在分子水平探讨酶活性变化的机理，从而为减缓黑果枸杞汁氧化褐变提供有效思路。
超高压（ultra-high pressure，UHP）技术是一种在食品行业中极具发展潜力的食品加工方法，能在较低或者常温条件下，不改变小分子物质及共价键结构，却能改变生物体中高分子物质的非共价结构[4]，所以超高压技术在有效钝化酶活性的同时能更好地保证食品营养成分和感官性能。目前少有关于青藏特色资源黑果枸杞汁的加工与贮藏的研究。黑果枸杞活性物质花青素的极不稳定和内源酶导致的氧化褐变都会影响其果汁的加工，将超高压技术应用于黑果枸杞汁的加工，有利于内源酶的钝化和延缓活性成分的流失。目前鲜有关于超高压对于黑果枸杞汁中多酚氧化酶活性影响的研究，对酶结构影响及作用机理研究则更少。
故本文研究在不同压力（200 MPa～500 MPa）条件下，黑果枸杞汁中的关键性内源酶多酚氧化酶活性、结构以及形态特征的变化，以期改善黑果枸杞汁品质，探索黑果枸杞汁的加工新技术。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑果枸杞：采于青海省诺木洪地区。
聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、8-苯胺基-1-萘磺酸铵（ammonium 8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：北京索莱宝科技有限公司；多酚氧化酶试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
HHP600/5L超高压处理设备：包头科发高压科技有限公司；ZD-LZ-0.5螺旋榨汁机：靖江市中德机械制造厂；Nicolet6700傅立叶红外光谱仪：美国热电公司；DSC-200F3差示扫描量热仪：德国耐驰仪器制造有限公司；JSM-6610扫描电子显微镜：日本电子公司；RF-6000荧光分光光度计：岛津企业（中国）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黑果枸杞汁中PPO提取
PPO的提取参照林波等[5]的方法，并稍作修改。将黑果枸杞榨汁后与磷酸盐缓冲液（pH6.5，0.1 mol/L）和4%PVPP等体积混合，4℃条件下静置1 h，10 000 r/min离心20 min，得到上清液即为黑果枸杞汁PPO粗提液。
1.3.2 超高压处理
将得到的黑果枸杞汁PPO粗提液分别罐装于耐压塑料瓶中，用封口膜密封。采用超高压设备分别于200、300、400、500 MPa 压力下处理 10 min，不做任何压力处理的作为空白对照[6]。
1.3.3 PPO活性测定
PPO活性的测定采用试剂盒法[7]，在420 nm处测定吸光度，计算酶活性。
1.3.4 差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）分析
参考朱玉兵等[8]的方法，采用差示扫描量热仪对黑果枸杞PPD进行分析，加热速率为5℃/min，温度范围为25℃～85℃。使用DSC分析软件（TA Universal Analysis 2000）估算DSC热谱图中的峰值温度和峰面积，分别定义为热变性温度（T）和热变性焓（ΔH）。
1.3.5 表面疏水性分析
参考余晶梅等[9]的方法，采用ANS荧光探针法测定黑果枸杞汁PPO的表面疏水性。使用ANS作为荧光探针，用0.01 mol/L PBS与0.15 mol/L NaCl混合液将样品稀释至 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，分别加入80μLANS，20℃避光平衡1h，设置激发波长390nm，发射波长470nm，狭缝宽度5nm，扫描速率1200nm/min，以荧光强度对其浓度作图，图线的初始斜率即为酶蛋白表面疏水性指数S0。
1.3.6 傅立叶红外光谱（Fourier infrared spectroscopy，FT-IR）分析
参照ZHU等[10]的方法，将处理得到样品冷冻干燥，在400 cm-1～4 000 cm-1波长范围进行傅立叶红外光谱的测定。
1.3.7 内源荧光光谱分析
参考周雅琪等[11]的方法，将1.3.1中制得的PPO粗提液放入荧光比色皿中，设置激发波长为295nm，扫描范围为200nm～600 nm，激发和发射缝宽为5 nm，扫描速率为1 200 nm/min。
1.3.8 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）分析
用扫描电子显微镜分析黑果枸杞PPO的形态特征[12]，将样品冷冻干燥后用扫描电子显微镜进行扫描，观察其形态特征。
1.3.9 统计与分析
所有试验数据用SPSS Statistics 20.0统计软件进行数据处理和分析，采用Prism 8作图。
2 结果与分析
2.1 超高压处理对黑果枸杞汁PPO活性的影响
超高压处理对黑果枸杞汁PPO活性的影响见图1。
图1 不同压力下黑果枸杞汁PPO活性
Fig.1 PPO activity of Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures
不同字母表示显著性差异，p＜0.05。
如图 1所示，经超高压（200 MPa～500 MPa）处理的黑果枸杞汁PPO活性分别为（25.83±1.12）、（28.29±0.88）、（0.49±0.34）、（0.48±0.20）U/mL，未经任何处理的样品PPO活性为27.28 U/mL。300 MPa处理酶活性略有升高，但与对照组差异不显著（p＞0.05），略微升高的原因可能是分子在一定的空间范围内，受到压力作用，使得酶与底物更加充分地接触从而有所升高。压力继续增大使PPO活性降低，400 MPa和500 MPa能使酶活性降低至0.5 U/mL以下（p＜0.05）。JUAREZENRIQUEZ等[13]研究发现在压力较低的情况下，压力大小与PPO失活速率有拮抗作用，压力越大，失活速率越小，当压力高于300 MPa时，压力大小对PPO的失活速率有协同作用，压力越大，失活速率越大。
2.2 DSC检测分析结果
在差示扫描量热过程中，一定的蛋白结构呈现固定的吸收峰，即目标蛋白的特征峰，一旦蛋白发生部分变性或者完全变性，便伴随着其在差示扫描量热图谱上特征吸收峰出现峰值变小或者变性温度发生位移甚至消失的情况[14]。
不同处理压力下黑果枸杞汁PPO蛋白差示扫描量热结果如图2所示。
由图2可知，空白对照组和200 MPa处理组均能观察到明显脱色峰，200 MPa与空白对照组相比，第一个变性吸收峰约降低三分之二，300 MPa处理有吸收峰出现，但峰值明显变小，随着压力的升高特征峰出现了明显降低现象，400 MPa和500 MPa处理组经DSC分析未出现明显脱色峰，说明该条件已经使PPO的蛋白构象被破坏，从而发生变性现象，这与2.1酶活性所得结果基本一致，说明酶活性的大小与蛋白分子热稳定性有关，酶蛋白分子构象变化，导致活性发生变化。
图2 不同压力下黑果枸杞汁PPO差示扫描量热法分析图
Fig.2 Differential scanning calorimetry of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures
热变性温度（T）和热变性焓（ΔH）结果如表 1所示。
表1 不同压力处理黑果枸杞汁PPO的DSC热变性温度和热变性焓
Table 1 DSC denaturation temperature and enthalpy of denaturation of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice treated with different pressures
注：-表示未检测到相应的变性温度；同列中不同字母表示存在显著性差异，p＜0.05。
压力/MPa热变性温度/℃热变性焓/（J/g）空白对照 31.2±0.3a 200.90±0.99a 200 31.3±0.5a 52.66±0.87b 300 - 0.00 400 - 0.00 500 - 0.00
200MPa高压处理的热变性温度与空白对照没有显著差异（p＞0.05），但是热变性焓显著降低（从200.90 J/g降低到了52.66 J/g）（p＜0.05），表明ΔH的变化和处理压力有关，在超高压处理条件下，热稳定性与分子结构的变化密切相关，因此，随着压力的增加ΔH降低，可能是酶蛋白结构轴向压力的作用逐渐占主导，并且更多的三螺旋结构开始从末端肽区域解离。这与NAN等[15]研究的压力对蛋白结构影响结果不一致，该研究发现处理压力低于300 MPa时，ΔH显著增加，造成这种差异的原因可能是由于不同原料的蛋白结构耐压性不同。
2.3 表面疏水性分析
酶蛋白表面疏水性的变化是酶蛋白结构变化的重要表征，正常情况下，为了保证蛋白质大分子结构的稳定性，大多数的非极性氨基酸会排布在分子内部疏水性区域，形成稳定的疏水性内核，蛋白质分子表面排布着极性氨基酸，保证亲水环境的稳定，并与内部环境进行能量交换和分子输出[16]。在超高压作用下，蛋白质空间结构发生改变，疏水性氨基酸在分子内外重新排布，使更多疏水性氨基酸残基在压力作用下暴露在蛋白分子表面。
不同高压处理对黑果枸杞汁PPO蛋白表面疏水性影响如图3所示。
由图3可知，处理压力200 MPa～400 MPa时，随着压力的增大，黑果枸杞汁PPO蛋白的表面疏水性在逐渐增强。说明在压力作用下，PPO蛋白结构发生变化，原本的疏水性侧链在天然蛋白状态下聚集于蛋白分子内部，由于受压力作用，这些疏水性侧链重新排布后，便会有疏水性氨基酸残基移动到蛋白表面，酶蛋白分子之间凝聚性减弱，表面疏水性增加，酶活性降低。
图3 不同压力下黑果枸杞汁PPO表面疏水性
Fig.3 The surface hydrophobicity of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures
不同字母表示存在显著性差异，p＜0.05。
2.4 超高压对黑果枸杞汁PPO蛋白二级结构的影响
不同压力处理的黑果枸杞汁PPO的傅立叶红外光谱图如图4所示。
从图4中可以观察到PPO蛋白的典型吸收峰。酰胺 A 谱带（3 400 cm-1～3 440 cm-1）与 N-H 拉伸振动相关，酰胺 I谱带（1 600 cm-1～1 660 cm-1）是酶蛋白中最强的吸收带，与肽键中羰基的拉伸振动相关，酰胺I谱带内官能团的变化极易影响酶蛋白主链结构，因此二级结构的变化也易受其影响。酰胺II谱带（1 400 cm-1～1 550 cm-1）与N-H弯曲和C-N伸展相关，蛋白质的酰胺II谱带几乎不受侧链振动的影响，而酰胺III谱带（1 220cm-1～1 300 cm-1）与 C-N 键和 N-H 伸展相关，并与酶蛋白三螺旋结构的完整性有关[17]。与未处理的空白对照相比，高压处理组在酰胺A谱带略有蓝移（从3 426.12 cm-1至3 388.13 cm-1），这表明超高压处理可能使酶蛋白分子结构中形成更多或者更强的氢键结构。其它特征谱带没有发生显著变化，说明本试验中的处理压力对黑果枸杞汁PPO蛋白结构中酰胺II谱带和酰胺III谱带没有造成影响。柳青[18]在研究超高压对西瓜汁多酚氧化酶二级结构的影响时发现，压力越大，PPO在傅立叶红外光谱图中酰胺I谱带形成的峰越明显，经过600 MPa处理后，对酶蛋白的二级结构改变最明显，这与本试验结果不一致，原因可能是由于原料不同或是原料中的PPO蛋白分子结构不同。
图4 不同压力下黑果枸杞汁PPO傅立叶红外光谱图
Fig.4 Fourier infrared spectrum of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures
2.5 内源荧光光谱分析
绝大多数蛋白质内含有内源性荧光残基，当蛋白质分子受到超高压作用后，其分子构象可能发生变化，这一过程的发生伴随着酪氨酸和色氨酸空间位置的变化，表现为酪氨酸荧光性减弱和色氨酸荧光性增强的现象[19]。
当激发波长为295 nm时，蛋白质中的色氨酸能够发射荧光，多酚氧化酶蛋白氨基酸残基因为受高压处理而发生改变，这些氨基酸残基内源荧光强度相应也会受到影响，所以可以通过检测荧光强度的变化来判断酶蛋白结构变化[20]。黑果枸杞汁多酚氧化酶经过不同高压处理和对照组的荧光光谱如图5所示。
图5 不同压力下黑果枸杞汁PPO荧光光谱图
Fig.5 The fluorescence spectrum of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures
由图5可知，未经过任何处理的酶蛋白在363 nm处有最大荧光强度，经不同压力处理的PPO蛋白荧光强度均有所降低且都低于空白对照组。同时发现压力大小对PPO蛋白荧光光谱的形状及最大吸收波长影响不显著，但是对荧光强度影响明显。LEFEVRE等[21]研究发现色氨酸残基在蛋白分子内部极性环境内，最大吸收波长为360 nm。在压力为200 MPa和300 MPa条件下，最大吸收波长没有发生移动现象，说明这样的压力大小不足以使蛋白结构发生变化，压力增加到400 MPa和500 MPa，最大吸收波长发生红移（从360 nm移至364 nm处），并且随着压力的增强，荧光强度呈现减小趋势，说明在超高压400MPa和500MPa作用下，色氨酸残基所处的蛋白结构发生变化，内部非极性环境的色氨酸残基在高压作用下，更多地暴露于蛋白分子外部的极性环境[22]，这表明超高压处理对黑果枸杞汁中多酚氧化酶蛋白三级结构产生了影响，因此推测酶蛋白构象的变化可能会影响酶活性的变化。
2.6 电子显微形态观察
黑果枸杞汁多酚氧化酶经过不同高压处理和对照组的扫描电镜图如图6所示。
图6 不同压力下黑果枸杞汁PPO扫描电镜图
Fig.6 Scanning electron micrograph of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures
A.未经任何处理的空白对照；B.高压200 MPa处理10 min；C.高压300 MPa处理10 min；D.高压 400 MPa 处理 10 min；E.高压 500 MPa 处理 10 min。
将所有处理组在同等倍数（2 000倍）下放大，未经任何处理的PPO蛋白以链状形态存在，并且相互交联，束状空间结构完整，经过超高压处理后，PPO蛋白束状完整结构消失，包裹在其中的颗粒状物质裸露在表面，同时伴随着物质粒径减小，表面结构已经从光滑链状变为粗糙的带孔球形颗粒，较小的颗粒状物质团聚黏结在未破碎的大颗粒表面。同时观察发现，随着压力的增大，蛋白酶分子间的间隙逐渐增大，因此图像显示超高压处理对黑果枸杞汁多酚氧化酶蛋白的表面形态有一定影响。
3 结论
高压通过改变黑果枸杞汁中PPO蛋白分子的构象来改变酶的活性，400 MPa以上压力能使其活性显著降低。其中，高压处理后酶的二级结构与常压下酶的二级结构没有明显差异，研究发现导致黑果枸杞汁PPO活性变化的原因是在高压条件下，PPO蛋白分子三级结构发生改变，色氨酸残基所处的微环境极性增强，并更多暴露于蛋白质分子外部极性环境，导致表面疏水性的变化，超高压处理也改变了PPO蛋白表面形态，也就是说，一定的超高压处理使黑果枸杞汁多酚氧化酶三级结构发生变化并引起蛋白质变性，导致酶活性的改变，此研究结果为超高压处理后黑果枸杞汁保存期的延长和品质提升提供一定的理论依据。
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