随着生活水平的提高，人们对饮食营养的要求日益增加。水产品中含有丰富的蛋白质、脂肪、人体必需氨基酸，因此水产品经过不同加工后成为餐桌上常见的美味佳肴。但是在进行腌制、油炸过程中，水产品营养物质会转化成少量N-亚硝胺类化合物[1]，该物质是公认的具有较大毒害作用的污染物，也是已知的强致癌物之一，会对人体健康造成严重影响，过量摄入含有亚硝胺的食物后，人体会出现肝脏损伤，血小板破坏，乃至全身中毒[2]等表征。
随着人们对亚硝胺的致癌机理[3]深入了解，对如何有效监管食品中的亚硝胺显得尤为重要。GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定水产动物[4]及其制品中N-二甲基亚硝胺[5]的限量值为4.0 μg/kg。GB 5009.26—2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》中提供了两种检测方法。从仪器角度分析，气相色谱-热能分析法[6]由于仪器价格昂贵，不适用于一般实验室。气相色谱-质谱法，由于结果离子信息少，定性不准确等问题，容易产生N-二甲基亚硝胺假阳性的结果，而且很难消除样品基质干扰。从前处理角度分析，水蒸气蒸馏法[7]的试剂消耗量大，从提取到浓缩过程时间长，易造成目标化合物损失，回收率不稳定而且批量检测存在一定的局限性。由于标准对N-二甲基亚硝胺限量要求低，因此传统试验仪器与前处理方法不能满足水产品中N-二甲基亚硝胺检测的准确度要求。相比之下，QuEChERS方法改进了样品前处理方式，通过对样品提取、净化、直接进样，利用基质分散萃取机理，进而达到吸附干扰物，保留目标物与净化样品的目的。
1 材料与方法
1.1 样品与试剂
扇贝柱、鲜虾滑、巴沙鱼片、墨鱼丸：市售。
4种N-亚硝胺类化合物标准储备液[N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亚硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亚硝基正丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA），纯度均大于 98.0%，质量浓度均为100 mg/L]：安谱实验科技股份有限公司；QuEChERS净化填料除脂分散净化包、除脂萃取盐包：美国安捷伦公司；乙腈、正己烷（色谱纯）：美国Thermo Fisher公司。
1.2 仪器
8860-5977型气相色谱-串联质谱仪（配电子轰击离子源）：美国安捷伦公司；Vortex Genius 3型漩涡振荡器：德国IKA公司；MGS-2200G型氮吹仪、RV10型旋转蒸发仪：日本东京理化公司；KQ-500DV型超声波清洗器：昆山舒美有限公司。
1.3 标准曲线绘制
取亚硝胺类化合物混合标准储备液，用正己烷稀释并配制成质量浓度为10 mg/L的混合标准工作液，放于棕色储液瓶，在-18℃冰箱保存。临用时，移取上述配制好的工作液，用正己烷配制成浓度分别为1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的标准溶液，现用现配，绘制标准曲线。
1.4 样品前处理
1.4.1 提取
称取10 g（精确到0.000 1 g）水产样品，放进50 mL离心管，加入20 mL正己烷，在室温（35℃以下）以5 000 r/min的转速离心5 min，样品残渣再用10 mL正己烷重复提取3遍，合并正己烷提取液于100 mL离心管中，使用涡旋振荡器振荡1 min，在室温（35℃以下）用速率为5 000 r/min的离心机离心3 min，弃去正己烷层，重复两次，然后转移到容量瓶中进行定容，等待净化。
1.4.2 净化
使用移液器量取试样1.5 mL待净化溶液，置于含N-丙基乙二胺混合吸附剂50 mg、硅胶吸附剂150 mg以及无水硫酸镁100 mg的2 mL离心管中，使用漩涡振荡器振荡30 s，使试样混匀，放入转速为12 000 r/min的离心机离心3 min，取上清液待气相色谱-串联质谱仪测定使用[8]。
1.5 空白基质匹配混合标准溶液的配制
提取3种空白基质水产品样品，待净化液减压旋蒸至干后，加入2.0 mL质量浓度分别为1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的混合标准工作溶液复溶，涡旋振荡，量取1.5 mL溶液振荡后进行QuEChERS净化，即可获得空白基质混合标准溶液，现用现配。
1.6 基质效应（matrix effect，ME）计算
由于质谱分析会普遍存在基质效应，客观存在的基质效应对方法的精密度、灵敏度以及准确度都会造成影响[3]。本试验前处理过程会用到大量有机试剂，而且水产品基质复杂，有可能会对目标物产生一定影响。本文参考李婷等[9]的研究方法，通过先萃取后添加的方法，配制质量浓度为0.100 mg/L的4种N-亚硝胺类化合物标准溶剂以及空白基质匹配校准溶剂，在同样条件下进行分析，根据公式（1）计算ME。
式中：Pm为空白基质匹配校准溶液中N-亚硝胺类化合物的响应值；Ps为标准溶液中N-亚硝胺类化合物的响应值。
当ME=0时，表示溶液中没有基质效应；当ME＜0时，表示溶液中存在基质抑制；当ME＞0时，表示溶液中存在基质增强效应。试验所得4种N-亚硝胺类化合物在水产品中都存在基质增强效应。在基质效应均存在的情况下，采用基质匹配标准曲线定量，就可以在一定程度降低基质效应的影响，提高定量结果的准确性。
1.7 色谱条件
色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为220℃，不分流进样模式。载气为氦气，纯度为99.99%，流速为1.0 mL/min。升温程序：30℃，保持3 min，以5℃/min升至100℃，以30℃/min升至240℃，保持5 min；溶剂放空模式进样：放空温度为30℃，放空流速：100 mL/min，放空时间为0.42 min，以 600℃/min速率升温至 300℃，进样体积：5 μL。
1.8 质谱条件
离子源：EI，离子源的温度为230℃，四极杆的温度为150℃，接口的温度230℃，电子能量为90 eV，碰撞能量均为15 eV。4种挥发性N-亚硝胺类化合物的保留时间、产物离子[10]、前体离子以及其它质谱参数见表1。
表1 4种N-亚硝胺类化合物的保留时间、产物离子以及其他质谱参数
Table 1 Retention times，product ions and other MS paramerters of the four N-nitrosamine compounds
序号 化合物 CAS编号碰撞能量/eV 1 NDMA 62-75-9 10.30 42.2 74.1 15 2 NDEA 55-18-5 11.85 57.0 102.2 5 3 NDPA 621-64-7 15.74 43.2 130.2 5 4 NDBA 924-16-3 18.22 57.3 84.2 5保留时间/min产物离子（m/z）前体离子（m/z）
2 结果与分析
2.1 前处理条件的优化
2.1.1 去脂方式的选择
对于大多数水产品，QuEChERS的净化填料具有较好的去除杂质和油脂的作用[11]。但对于油脂含量较高的动物性食品，在净化浓缩后，会有相对明显的油脂吸附在玻璃容器管壁上。因此试验尝试多种不同的净化、萃取去脂方式。凝胶色谱净化方法弥补上述缺陷，在确保精密度和准确度的同时提高了检测效率。
2.1.2 净化条件的优化
使用乙腈进行提取，鸡心瓶壁内会留有大量复溶不能溶解的油状残留物，如果增加溶剂使用量，会导致检测方法的检测限降低。同时大量油脂会使得硅胶粉末和N-丙基乙二胺填料不能将样品净化干净，致使色谱基线[12]响应偏高、回收率差、仪器污染等，同时还会存在其它明显问题。
1）上机样品量少，如果增加上机样品量会导致目标物分散，造成收集时间延长，杂质数量增加等多种影响。
2）前处理时间较长，净化1个样品基本需要1 h以上。
以上问题在一定程度上限制了凝胶色谱仪的净化作用，为了更好优化前处理阶段去脂效果，参考文献[13]的方法，在乙腈提取过程中添加正己烷溶液（乙腈饱和）进行去脂。与未经去脂或者QuEChERS净化的效果进行对比，考察净化效果。通过回收率考察发现，具有极性的N-亚硝胺类化合物在具有非极性的正己烷中几乎未被分解，即使用正己烷多次去脂也不会影响乙腈提取液中的N-亚硝胺类化合物含量。因此确定采用正己烷去除乙腈层中的油脂。
2.2 定性、定量方法的选择
水产品成分复杂，经常会受到基质效应的影响，而且N-亚硝胺类化合物在前处理过程中不稳定，为了更好地对目标物进行定量、定性分析，试验采用质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）[14]模式进行检测，使用混合基质标准溶液和内标法进行定量，既排除了基质干扰，又弥补了前处理对整体回收率的影响。
2.3 标准曲线方程、检出限和定量限
称取10.00 g试样，加入100 μL混合内标溶液，配制成质量浓度为 5、10、20、30、50、100、150 μg/L 的 N-亚硝胺类化合物溶液，按照标准方法进行处理，在仪器工作条件下进行测定，得到4种N-亚硝胺类化合物的线性回归方程，见表2。
表2 4种N-亚硝胺类化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限
Table 2 Linear equations，correlation corfficient，limit of detection and limit of quantitation of the 4 N-nitrosamine compounds
定量限/（μg/kg）N-二甲基亚硝胺 y=1.510x+0.032 99 0.999 9 0.06 0.2 N-亚硝基二乙胺 y=1.358x+0.079 19 0.999 7 0.07 0.4 N-亚硝基二丙胺 y=0.905 5x+0.029 82 0.998 5 0.05 0.1 N-亚硝基正丁胺 y=1.828x+0.032 48 0.999 9 0.10 0.5化合物 线性回归方程 相关系数检出限/（μg/kg）
由表2可见，4种N-亚硝胺类化合物的线性关系良好，相关系数为0.9985～0.9999。检出限为0.05 μg/kg～0.10 μg/kg，定量限为 0.1 μg/kg～0.5 μg/kg。本方法灵敏度高，线性范围广。
2.4 精密度和回收试验
将不同质量浓度水平的混合标准溶液添加到空白水产品试样中，分别制成 1.0、3.0、10.0 μg/kg的加标样品，按试验方法每个浓度平行测试6次，得出回收率和测定值的相对标准偏差，结果见表3。
表3 4种N-亚硝胺类化合物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 3 Recoveries and relative standard deviation of the 4 kinds of N-nitrosamines compounds（n=6）
序号 化合物 加标量/（μg/kg）相对标准偏差/%1 N-二甲基亚硝胺 1.0 0.96 96.0 2.0 3.0 3.00 100.0 1.3 10.0 9.90 99.3 1.6 2 N-亚硝基二乙胺 1.0 0.96 96.0 1.2 3.0 3.02 100.6 0.8 10.0 10.07 101.0 0.8 3 N-亚硝基二丙胺 1.0 1.04 104.2 1.7 3.0 3.03 101.0 2.1 10.0 9.99 99.9 0.6 4 N-亚硝基正丁胺 1.0 0.89 89.0 2.2 3.0 2.84 94.7 2.0 10.0 10.08 101.0 1.0实测量/（μg/kg）加标回收率/%
结果显示，经QuEChERS前处理的样品回收率较未经处理的样品回收率数值偏高，表明QuEChERS方法在准确性方面具有一定的优势。
3 结论
本文使用改进的QuEChERS方法，建立了水产品中4种N-亚硝胺类化合物的气相色谱-质谱联用仪分析方法，前处理快捷简单、便于操作，目标化合物损失较低、回收率较高，具有较高的准确性，适用于大批量水产品的检测，实际检测运用良好，对日常检测工作具有一定的指导和借鉴意义。该方法也可以应用于高油脂含量的各类食品中的N-亚硝胺类化合物的测定。
[1] 王甜,王丽,孙世萍,等.HPLC-MS/MS法测定三角帆蚌中多种N-亚硝胺类化合物[J].环境监测管理与技术,2019,31(2):47-49,53.WANG Tian,WANG Li,SUN Shiping,et al.Determination of N-nitrosamines in hyriopsis cumingii using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].The Administration and Technique of Environmental Monitoring,2019,31(2):47-49,53.
[2]MUELLNER M G,WAGNER E D,MCCALLA K,et al.Haloacetonitriles vs.regulated haloacetic acids:Are nitrogen-containing DBPs more toxic?[J].Environmental Science&Technology,2007,41(2):645-651.
[3] 魏法山,徐幸莲,周光宏.挥发性N-亚硝基化合物的分析方法[J].食品科学,2008,29(7):479-484.WEI Fashan,XU Xinglian,ZHOU Guanghong.Determination method of volatile N-nitroso compounds[J].Food Science,2008,29(7):479-484.
[4] 赵华,王秀元,王萍亚,等.气相色谱-质谱联用法测定腌制水产品中的挥发性N-亚硝胺类化合物[J].色谱,2013,31(3):223-227.ZHAO Hua,WANG Xiuyuan,WANG Pingya,et al.Determination of volatile N-nitrosamine compounds in salted aquatic products by gas chromatography-mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography,2013,31(3):223-227.
[5] 李玲,徐幸莲,周光宏.气质联用检测传统中式香肠中的9种挥发性亚硝胺[J].食品科学,2013,34(14):241-244.LI Ling,XU Xinglian,ZHOU Guanghong.Determination of nine volatile N-nitrosamines by gas chromatography mass spectrometry in traditional Chinese sausage[J].Food Science,2013,34(14):241-244.
[6]CHARROIS J W A,AREND M W,FROESE K L,et al.Detecting N-nitrosamines in drinking water at nanogram per liter levels using ammonia positive chemical ionization[J].Environmental Science&Technology,2004,38(18):4835-4841.
[7] 杨宁,陈颖慧,邓莉,等.双填料固相萃取-高效液相色谱/质谱法同时检测腌菜中9种N-亚硝胺[J].分析化学,2013,41(7):1044-1049.YANG Ning,CHEN Yinghui,DENG Li,et al.Simultaneous determination of nine nitrosamines in pickled vegalables by solid phase extration column of dual packing materials and HPLC/MS[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2013,41(7):1044-1049.
[8] 韦雨欣.结合冷冻技术的QuEChERS方法测定水产制品中的N-二甲基亚硝胺[J].现代食品,2019(16):158-159,163.WEI Yuxin.Determination of N-dimethylnitrosamine in aquatic products by QuEChERS method combined with freezing technology[J].Modern Food,2019(16):158-159,163.
[9] 李婷,鲜啟鸣,孙成,等.水中N-亚硝胺类消毒副产物的污染现状及分析技术[J].环境化学,2012,31(11):1767-1774.LI Ting,XIAN Qiming,SUN Cheng,et al.The level and analysis of N-nitrosamines in waters[J].Environmental Chemistry,2012,31(11):1767-1774.
[10]CHATTERJEE N S,UTTURE S,BANERJEE K,et al.Multiresidue analysis of multiclass pesticides and polyaromatic hydrocarbons in fatty fish by gas chromatography tandem mass spectrometry and evaluation of matrix effect[J].Food Chemistry,2016,196:1-8.
[11]SHAH A D,MITCH W A.Halonitroalkanes,halonitriles,haloamides,and N-nitrosamines:A critical review of nitrogenous disinfection byproduct formation pathways[J].Environmental Science&Technology,2012,46(1):119-131.
[12]王文勇,张英慧,赖长生.肉及肉制品中亚硝胺的研究进展[J].肉类工业,2017(4):49-53.WANG Wenyong,ZHANG Yinghui,LAI Changsheng.Research progress on nitrosamine in meat and meat products[J].Meat Industry,2017(4):49-53.
[13]黄智,程伟伟,张大磊,等.肉制品中亚硝胺形成影响因素和控制措施研究进展[J].食品工业科技,2016,37(21):372-376.HUANG Zhi,CHENG Weiwei,ZHANG Dalei,et al.Research progress in impact factors and control technology of nitrosamines in meat products[J].Science and Technology of Food Industry,2016,37(21):372-376.
[14]彭俏容,唐涛,于淑新,等.基于冷冻熔炼的液-液萃取/气相色谱法测定啤酒中的N-二甲基亚硝胺[J].色谱,2014,32(4):433-437.PENG Qiaorong,TANG Tao,YU Shuxin,et al.Determination of N-nitrosodimethylamine in beer by frozen zone melting liquid-liquid extraction/gas chromatography[J].Chinese Journal of Chromatography,2014,32(4):433-437.