红小米，为南阳盆地特产，因谷壳呈红色，本地俗称红谷，学名为“粟”，也称作粱、粟米，是禾本科一年生草本植物“粟”加工去皮后的成品。红小米与糯米、黍米等农作物相比，淀粉含量较低，蛋白质、脂肪和维生素含量较高，且富含人体必需的8种氨基酸，比例协调，具有较高的营养价值。
黄酒是世界上最古老的酒类之一，在我国已有3 000余年的历史，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1-2]。传统黄酒是以糯米、粟米等为原料，采用酒曲糖化、发酵而成，色泽浅黄或红褐，质地醇厚，品味香甜甘冽，浓郁芳香，集甜、酸、苦、辛、鲜、涩六味一体。黄酒富含8种必需氨基酸、活性多肽、功能性低聚糖、有机酸、多种维生素及微量元素等易被人体吸收的营养成分[3-8]，被誉为“液体蛋糕”。
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，在人体内具有调节心率、降低血压、预防动脉硬化、调节内分泌、预防糖尿病、健肝利肾、防止皮肤老化等特殊生理功能[9-11]。GABA作为一种具有特殊生理活性的功能性因子越来越引起人们的关注，研究表明，黄酒酿造时所用麦曲、红曲、酒药中的霉菌、酵母、细菌等微生物，在代谢过程中可利用谷氨酸（Glu）作为前体物质合成GABA[12]。红小米为南阳盆地特色农作物，与GABA合成代谢所需的前体物质谷氨酸含量达2.92%[13-14]。本研究以红小米为主要原料，对富含GABA的红小米黄酒酿造工艺参数进行优化，可为企业生产实践提供有价值的理论参考。富含GABA的红小米黄酒的产业化生产，将极大提高南阳黄酒的知名度，提升南阳“世界美酒特色产区”的品牌影响力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红小米：南阳市镇平县；绍酒风味T3酿酒曲（根霉菌、α-淀粉酶（20000U/g）、葡萄糖淀粉酶（100000U/g）、酿酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；麦曲：山东梁山徐曙生物工程有限公司。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）对照品：中国食品药品检定研究院；重蒸苯酚：北京索莱宝科技有限公司；四硼酸钠、氢氧化钾：国药集团化学试剂有限公司；次氯酸钠、三氯化铝、硼酸、无水乙醇：天津科密欧化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BS110S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；HHS-6电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；XK05-IMS20制冰机：北京中西远大科技有限公司；752N紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；XH-A旋涡混合器：无锡杰瑞安仪器设备有限公司；DNP-9082电热恒温培养箱：上海精宏试验设备有限公司；TGL-16GR高速台式冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 红小米黄酒酿造工艺流程
采用摊饭法酿造红小米黄酒，具体工艺流程如下。
浸米→蒸煮→摊凉→拌曲（酿酒曲、麦曲）→装罐→前发酵及开耙→后发酵→过滤→煎酒（灭菌）→装坛→陈酿
1.3.2 GABA标准曲线的绘制
精密称取GABA 20.0 mg，蒸馏水溶解，定容至100 mL，摇匀，得浓度为0.2 mg/mL的GABA标准溶液。分别吸取稀释至 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL的GABA标准溶液1.0 mL，于10 mL具塞试管中，分别加入0.2mL浓度为0.2mol/L的H3BO3缓冲液（pH 9.0）、6%的重蒸苯酚1.0 mL、7%的次氯酸钠溶液0.4 mL，置于漩涡振荡器混匀，沸水浴条件下反应10 min，迅速在冰浴条件下冷却15 min，出现蓝绿色后加入60%的乙醇2.0 mL；另吸取1.0 mL蒸馏水代替GABA标准溶液置于10 mL具塞试管，经上述反应及显色等处理后作为空白对照；分别于630 nm波长处测OD值，以测得的OD值为纵坐标，GABA浓度为横坐标，绘制标准曲线[15-16]。
1.3.3 单因素试验
分别称取经预处理的红小米100 g，置于洁净的500 mL烧杯内，加自来水浸泡，水面超过米层3 cm左右，烧杯口部用2层无菌纱布覆盖，室温20℃下浸泡，早晚各换水1次。24 h后沥干水分，置不锈钢锅内蒸2 h，摊凉冷却至35℃；分别选择麦曲用量（5.5%、7.0%、8.5%、10.0%、11.5%、13.0%）、酿酒曲用量（0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）、前发酵温度（19、22、25、28、31、34 ℃）、前发酵时间（3、5、7、9、11、13 d）、后发酵温度（9、12、15、18、21 ℃）、后发酵时间（25、35、45、55、65、75 d）6 个因素作为考察因素，选择料液比为1∶1.3（g/mL）进行发酵，酿造红小米黄酒。单因素试验时，每次试验固定其余因素，考察单一因素对GABA含量的影响。
1.3.4 均匀设计试验
在单因素试验基础上，选择麦曲用量（X1）、酿酒曲用量（X2）、前发酵温度（X3）、前发酵时间（X4）、后发酵温度（X5）、后发酵时间（X6）6 个因素，进行均匀设计试验[17-19]，选择料液比为 1∶1.3（g/mL）进行发酵，考察不同酿造工艺对红小米黄酒中GABA含量的影响。试验的因素水平如表1所示。
表1 均匀设计试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of uniform design experiment
序号 X1麦曲用量/%X6后发酵时间/d 1 5.5 0.30 19.0 3 9.0 25 2 7.0 0.35 22.0 5 12.0 35 3 8.5 0.40 25.0 7 15.0 45 4 10.0 0.45 28.0 9 18.0 55 5 11.5 0.50 31.0 11 21.0 65 6 13.0 0.35 34.0 13 15.0 75 X2酿酒曲用量/%X3前发酵温度/℃X4前发酵时间/d X5后发酵温度/℃
1.3.5 建立具有预测功能的多层前馈（backpropagation，BP）神经网络
以均匀设计试验结果数据作为BP神经网络的训练样本，考虑到均匀设计试验中因素数为6，输入层神经元个数选择6；试验指标数（GABA含量）为1，输出层神经元个数选择1；中间层神经元个数根据经验选择6；故BP神经网络的拓扑结构为6-6-1，选择BP神经网络训练收敛精度为10-3，利用MATLAB软件，建立BP神经网络[20-21]，并随机选择3组实测值与BP神经网络的预测值进行对比。
1.3.6 确定BP神经网络的最优预测值
以BP神经网络的预测输出值作为遗传算法求解的目标值，以均匀设计试验结果作为遗传算法的初始种群，种群规模为12，根据经验，选择交叉概率0.05，变异概率0.01，采用遗传算法寻优确定BP神经网络的最优预测值[22-23]。
1.3.7 红小米黄酒中GABA含量测定
准确量取30.0 mL红小米黄酒样液，作为待测酒样，向其中加入2.0 mol/L的A1C13溶液150 μL，充分混匀振荡10 min，12 000 r/min离心5 min，吸取15.0 mL上清酒液，加入l.0 mol/L的KOH溶液9.0 mL，充分混匀振荡5 min，12 000 r/min离心5 min。使用移液枪吸取适量经离心处理的上清酒液，根据GABA标准曲线的绘制方法，测定酒样的OD值，计算GABA含量[24-25]。
1.4 数据处理
单因素试验数据处理采用Origin10.5.1软件进行图形绘制，并对结果进行综合分析；均匀设计试验数据处理采用MATLAB软件2019中的神经网络工具箱、动态仿真和优化控制工具箱，进行BP神经网络的模型建立、试验数据的仿真模拟及最优参数的预测。
2 结果与讨论
2.1 GABA标准曲线绘制结果
根据GABA标准曲线制作方法，建立γ-氨基丁酸浓度和吸光度值之间的关系曲线，结果见图1。
图1 GABA标准曲线
Fig.1 The standard curve of GABA
以GABA浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=4.7748x-0.0032，R2=0.9987。
2.2 单因素试验结果及分析
2.2.1 麦曲用量对红小米黄酒GABA含量影响
麦曲用量对红小米黄酒中GABA含量的影响见图2。
图2 麦曲用量对GABA含量影响
Fig.2 Effect of wheat starter dosage on GABA content
由图2可知，麦曲用量为5.5%～10.0%时，随着麦曲用量增大，霉菌菌群所产糖化酶量不断增加，并与酿酒曲中的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及根霉所产糖化酶共同作用，将红小米中淀粉降解，为酿造体系中的微生物菌群提供更多碳源，微生物在增殖及代谢过程中，通过GABA合成代谢途径关键酶谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）产生大量 GABA，黄酒醪液中GABA含量不断增加；麦曲用量为10.0%时，红小米所含淀粉水解达到饱和，微生物通过GAD合成GABA与通过γ-氨基丁酸转氨酶（γ-aminobutyric acid transaminase，GABA-T）及琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）对GABA进行转化的速率处于动态平衡，继续增大麦曲用量，黄酒醪液中GABA含量增加也不明显。
2.2.2 酿酒曲用量对红小米黄酒GABA含量影响
酿酒曲用量对红小米黄酒中GABA含量的影响见图3。
图3 酿酒曲用量对GABA含量影响
Fig.3 Effect of brewing raw starter dosage on GABA content
由图3可知，酿酒曲用量为0.30%～0.40%时，随酿酒曲用量增大，酿酒曲中根霉菌所产糖化酶量逐渐增加，协同酿酒曲中的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及麦曲中霉菌所产糖化酶，将红小米所含淀粉降解，微生物可获得足够碳源，迅速增殖。通过菌体代谢，在GAD作用下产生大量GABA，黄酒醪液中GABA含量不断增加；酿酒曲用量增加至0.40%时，红小米所含淀粉水解达到饱和状态，微生物的生长速率处于稳定状态，GABA通过GAD的合成速率与通过GABA-T及SDH的转化速率处于平衡状态，继续增大酿酒曲用量，对黄酒醪液中GABA含量的影响也不大。
2.2.3 前发酵温度对红小米黄酒GABA含量影响
前发酵温度对红小米黄酒中GABA含量的影响见图4。
图4 前发酵温度对GABA含量影响
Fig.4 Effect of pre-fermentation temperature on GABA content
由图4可知，前发酵温度为19℃～28℃时，黄酒醪液中GABA含量随前发酵温度升高逐渐增加。可能是前发酵温度较低时，麦曲及酿酒曲中微生物增殖缓慢，GAD活性较低，产生的GABA量较少；随前发酵温度升高，菌体代谢活动加快，GAD活性增强，产生GABA量逐渐增加。前发酵温度高于28℃时，麦曲及酿酒曲中微生物快速增殖，释放大量生物热，醪液升温迅速，菌体发生早衰，不利于GABA积累，黄酒醪液中GABA含量随前发酵温度升高而下降。
2.2.4 前发酵时间对红小米黄酒GABA含量影响
前发酵时间对红小米黄酒中GABA含量的影响见图5。
图5 前发酵时间对GABA含量影响
Fig.5 Effect of pre-fermentation time on GABA content
由图5可知，前发酵时间为3 d～9 d时，随前发酵时间延长黄酒醪液中GABA含量逐渐增大。可能是前发酵时间较短时，红小米所含淀粉未被充分降解利用，碳源供给有限，微生物增殖量少，在GAD作用下产生的GABA量也较少；随前发酵时间延长，红小米所含淀粉被充分水解，碳源供给充足，微生物快速增殖，在GAD作用下产生的GABA量逐渐增加。前发酵时间大于9 d时，由于微生物通过缓慢的呼吸代谢，使GABA在GABA-T及SDH的作用下继续转化生成琥珀酸，进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle），黄酒醪液中GABA含量随前发酵时间延长有所下降。
2.2.5 后发酵温度对红小米黄酒GABA含量影响
后发酵温度对红小米黄酒中GABA含量的影响见图6。
图6 后发酵温度对GABA含量影响
Fig.6 Effect of post-fermentation temperature on GABA content
由图6可知，后发酵温度为9℃～15℃时，黄酒醪液中GABA含量随后发酵温度升高逐渐增加。可能是后发酵温度较低时，酿造体系中微生物代谢缓慢，GAD活性较低，生成的GABA量较少；随后发酵温度升高，菌体代谢速率有一定程度增大，GAD活性增强，产生GABA量有所增加。后发酵温度高于15℃，后发酵前期发酵速度过快，酒精迅速积累，抑制菌体内参与GABA合成代谢的关键酶GAD的活性，同时酿造体系中细菌的代谢活动受到抑制，醪液总酸含量较少，进一步降低GAD活性，黄酒醪液中GABA含量随后发酵温度升高快速下降[26]。
2.2.6 后发酵时间对红小米黄酒GABA含量影响
后发酵时间对红小米黄酒中GABA含量的影响见图7。
图7 后发酵时间对GABA含量影响
Fig.7 Effect of post-fermentation time on GABA content
由图7可知，后发酵时间为25 d～65 d，黄酒醪液中GABA含量随后发酵时间延长逐渐增加。可能是由于从后发酵前期到中期，罐内逐渐处于厌氧环境，抑制GABA分解代谢途径中的GABA-T及SDH活性，同时醪液中总酸含量上升，pH值下降，GAD活性增强，不断积累GABA；后发酵后期，酿造体系中微生物菌体发生自溶，GABA被逐步释放，GABA含量随后发酵时间延长逐渐增加。后发酵时间大于65 d时，GABA已被充分释放，随后发酵时间继续延长，黄酒醪液中GABA含量变化不大。
2.3 均匀设计试验结果
根据均匀设计试验因素水平表的安排进行试验，具体结果见表2。
表2 均匀设计试验结果
Table 2 The results of uniform design experiment
序号 X1麦曲用量X2酿酒曲用量X3前发酵温度X4前发酵时间X5后发酵温度X6后发酵时间γ-氨基丁酸含量/（mg/mL）1 1 2 5 1 4 5 0.138 3 2 2 1 1 4 3 1 0.101 5 3 5 4 6 4 3 6 0.114 9 4 2 6 4 3 6 3 0.123 2 5 6 2 4 6 2 3 0.118 2 6 6 4 2 1 4 2 0.106 4 7 4 5 5 5 5 1 0.109 5 8 3 3 2 6 5 6 0.111 5 9 3 3 6 2 1 2 0.106 7 10 4 6 1 2 2 5 0.111 3 11 1 5 3 5 1 4 0.127 6 12 5 1 3 3 6 4 0.136 8
以均匀设计试验的结果数据作为BP神经网络的训练样本，利用MATLAB软件，建立BP神经网络，神经网络训练过程的均方误差变化曲线如图8所示。
图8 BP神经网络训练过程均方误差变化曲线
Fig.8 The mean square error variation curve of BP neural network training process
由图8可知，经持续学习训练，BP神经网络训练均方误差逐渐减小，当训练8 489次时，BP神经网络均方误差为0.000 499 1，小于设定值0.001，神经网络收敛，训练结束。
随机选择均匀设计试验结果中的3组数据，输入训练后的BP神经网络，将网络预测输出值与实测值进行对比，如图9所示。
图9 3组随机选择实测值与BP神经网络预测值对比
Fig.9 The three groups randomly selected and measured values compared with the predicted values of BP neural network
由图9可知，预测值和实测值比较接近，故可利用训练后的BP神经网络预测红小米黄酒在不同酿造工艺参数情况下，黄酒醪液中GABA含量。
遗传算法对训练后的BP神经网络最优预测值的求解轨迹，如图10所示。
图10 遗传算法寻优求解轨迹
Fig.10 The optimizing and solving trajectory of genetic algorithm
由图10可知，当遗传、交叉、变异、复制进行200代，遗传算法优化求解得出的最大适应度值（即GABA最高含量）为0.138 7 mg/mL，此时，与最大适应度值（GABA含量）相对应的红小米黄酒酿造工艺参数为麦曲用量10.35%，酿酒曲用量0.42%，前发酵温度24.31℃，前发酵时间6.42 d，后发酵温度14.22℃，后发酵时间70.16 d。
为便于实践操作，将上述酿造工艺参数进行适当修正如下：麦曲用量10.35%，酿酒曲用量0.42%，前发酵温度24℃，前发酵时间6 d，后发酵温度14℃，后发酵时间70 d。根据修正后的酿造工艺参数酿造3罐红小米黄酒，测得黄酒醪液中GABA含量平均值为0.139 8 mg/mL。结果比BP神经网络预测最优值稍大，说明修正后的酿造工艺参数具有较强的工程实践意义，可按此工艺参数进行富含GABA红小米黄酒的酿造。
3 结论
在单因素试验基础上，进行均匀设计试验，利用MATLAB软件，以均匀设计试验数据为训练样本，采用BP神经网络建立了红小米黄酒酿造工艺参数与GABA含量之间关系的数学模型，利用模型可对在不同酿造工艺参数组合条件下红小米黄酒中GABA含量进行高精度预测。
采用遗传算法对训练后的BP神经网络最优预测值（GABA含量最高）及相应的红小米黄酒酿造工艺参数进行优化求解，并结合工程实际适当修正，确定富含GABA的红小米黄酒较优酿造工艺参数为：麦曲用量10.35%，酿酒曲用量0.42%，前发酵温度24℃，前发酵时间6 d，后发酵温度14℃，后发酵时间70 d。在此条件下酿造的红小米黄酒，GABA含量可达0.1398mg/mL。
文中主要对富含GABA的红小米黄酒酿造工艺参数进行了优化，但红小米黄酒酿造过程中GABA含量的动态变化及GABA合成的代谢调控还有待于进一步研究。
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