金银花（Lonicerae japonica Thunb.），属忍冬科又名忍冬，以其干燥花蕾或带初开的花入药，含绿原酸、木犀草苷、肌醇、皂甙、鞣质等生物活性物质[1-2]。大别山具有丰富的金银花资源，“罗田金银花”被批准为中国国家地理标志产品，因此科学利用好本地的金银花资源具有现实意义。
肌醇是维生素B族中的一种，与维生素有类似的功能，可用于治疗各种维生素缺乏症[3]；而且能促进肝中脂肪的代谢，临床上用于治疗肝硬化、脂肪肝、肝炎等疾病[4]；同时还能降低血液中胆固醇含量[5]。作为生长因子，肌醇可用于多种菌种的培养并且具有促进酵母生长等作用[6]。在食品工业，肌醇作为食品营养强化剂具有抗氧化、抗衰老等功效[7-9]。目前，全球肌醇消耗量约为3 600 t，我国肌醇产量为1 600 t，约90%用于出口[10]。
肌醇制备主要有菲汀法[11]、化学合成法[12]、微生物法[13]、电渗析法[14]等方法。这些方法中有的工艺路线比较复杂，对设备要求较高、能量消耗高，随之消费也比较高；还有一些方法在生产过程中，需要使用大量的酸、碱溶液，对环境造成了不可逆污染，致使处理“三废”的费用增加[15]。因此，面对日益增长的应用需求，探讨从天然植物中制备肌醇的安全加工工艺具有应用价值。
酶能温和高效地降解植物细胞壁，酶法提取不会破坏物质活性，且副产物少，实用安全。其中，纤维素酶能破坏金银花细胞壁，使活性物质从细胞中释放出来[16]。半纤维素酶能够水解与肌醇相连的半纤维素，有利于肌醇的浸出。本试验利用纤维素酶和半纤维素酶协同，探讨罗田金银花中肌醇的酶法提取工艺，从而为大别山金银花资源的科学利用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗田金银花：罗田县塔山，自然阴干，粉碎过80目筛备用；肌醇标准品（色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司；维生素C标准品（色谱纯）：武汉睿辰标物科技有限公司；纤维素酶（1 800 U/ng）、半纤维素酶（200 000 U/g）：上海金穗生物科技有限公司；高氯酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；九水硝酸铁（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；总抗氧化试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
CP413电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；DEKW-D-2型电热恒温水浴锅：北京西城区医疗器械厂；UV1901PCS型双光束紫外可见光分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵：河南省予华仪器有限公司；DHG-9147A电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；KQ-500DB型台式数控超声波清洗器：东莞市科桥超声波设备有限公司；GL-21M医用离心机：湖南平凡科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 肌醇标准曲线及提取率测定
根据文献[17-19]，精确称取肌醇标准品100 mg，用超纯水溶解配制1 g/L的肌醇标准品母液。取2 mL母液于 100 mL 容量瓶中，加 0.05%Fe（NO3）3溶液（用1%HClO4配制）2 mL，用超纯水定容至刻度线，以超纯水作空白对照，在200 nm～800 nm处扫描，确定最大吸收波长为201 nm。
精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 标准母液置于7个10 mL的容量瓶中，加0.05%Fe（NO3）3溶液（用1%HClO4配制）2 mL，用超纯水定容至刻度线，配制成肌醇浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/L 的标准溶液，以超纯水作空白，在201 nm波长下测吸光度，除去0.7 g/L浓度，得到肌醇标准曲线回归方程为A=1.492 9C+0.02，R2=0.999，A表示吸光度，C表示肌醇质量浓度，结果表明肌醇质量浓度在0.1 g/L～0.6 g/L范围内与吸光值线性关系良好。并按下式计算金银花中肌醇提取率。
式中：Y为肌醇提取率，%；C为样品中肌醇质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；M为金银花粉末的质量，g；V为提取液体积，mL。
1.3.2 精密度试验
取肌醇标准母液5 mL于10 mL容量瓶，加0.05%Fe（NO3）3溶液 2 mL，用超纯水定容至刻度线，以超纯水作空白，以最大吸收波长201 nm处测吸光度，并计算其肌醇含量。平行5次，求平均值及相对标准偏差。
1.3.3 加样回收率
根据文献[20]方法，取8个50 mL容量瓶，分4组。每组容量瓶中各准确加入0.1 mL肌醇提取液，分别加入肌醇标准母液 0（1～2号试管）、3 mL（3～4号试管）、5 mL（5～6号试管）、7 mL（7～8号试管），然后用超纯水定容至50 mL，于201 nm下测其吸光值，并计算其肌醇含量。
1.3.4 单因素试验
平行称取3份金银花粉末5 g分别置于圆底烧瓶中，加入适量的纤维素酶和半纤维素酶，按照1∶20（g/mL）料液比加入 100 mL 超纯水，搅拌均匀，置于恒温水浴锅中酶解一段时间后放入沸水浴锅中灭酶10 min后，冷却到50℃～60℃左右抽滤，定容制得肌醇提取液。考察复合酶（纤维素酶和半纤维素酶）质量比（5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2）、复合酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解时间（60、90、120、150、180 min）、酶解温度（40、45、50、55、60、65℃）对金银花肌醇提取率的影响。
1.3.5 正交优化试验
根据单因素试验结果，选取对金银花中肌醇提取率影响较为显著的复合酶质量比、复合酶添加量和酶解时间3个因素，进行正交试验设计，正交试验因素和水平如表1所示。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Orthogonal test factors and level
水平 因素A酶解时间/min B复合酶添加量/% C复合酶质量比1 60 0.5 4∶1 2 90 1.0 2∶1 3 120 1.5 1∶1
1.3.6 总抗氧化能力检测试验
根据文献方法[21-22]，分别加入 2、4、6、8、10 mL 肌醇提取液于10 mL容量瓶，超纯水定容至刻度线，得到系列肌醇样液。以VC为阳性对照，根据总抗氧化试剂盒说明书操作，将测试管和对照管中样液在520 nm波长处测定吸光度，并按下式计算其总抗氧化能力。
式中：T为总抗氧化能力，U/mL；As为测定管吸光度；Ac为对照管吸光度；V为反应液总体积，mL；Vt为取样量，mL；n为稀释倍数。
1.4 数据处理
利用正交设计助手II（v.3.1）和Microsoft Excel 2010等软件完成试验设计和数据分析。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
精密度试验的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.4%，加样回收率试验的RSD为1.7%，且加样回收率在98.3%～103.1%之间，表明试验所用的测量仪器精密度良好，检测方法可靠。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 复合酶添加量对肌醇提取率的影响
按照纤维素酶和半纤维素酶质量比1∶1，料液比1∶20（g/mL）加入超纯水，搅拌均匀，置于 60 ℃恒温水浴锅中酶解120 min，根据1.3.4的方法考察复合酶添加量对金银花中肌醇提取率的影响，结果如图1所示。
图1 复合酶添加量对肌醇提取率的影响
Fig.1 Effect of the amount of multi-enzyme on the extraction rate of inositol
由图1可知，肌醇提取率随复合酶添加量的增加呈现先升后降趋势，当复合酶添加量为1.0%时，提取率最高，为1.94%；继续增加复合酶量，提取率则下降。这可能是因为复合酶量增加到一定时，酶分子过于饱和，一部分酶不能与底物结合，使得酶水解细胞壁的速度变慢，并且太多的酶具有黏附性，能够阻塞肌醇的溶出，导致提取率下降[23]。因此，不考虑其他因素的情况下，复合酶添加量以1.0%为宜。
2.2.2 复合酶质量比对肌醇提取率的影响
按照复合酶添加量1.0%，料液比1∶20（g/mL）加入超纯水，搅拌均匀，置于60℃恒温水浴锅中酶解120 min，根据1.3.4的方法考察纤维素酶和半纤维素酶质量比对金银花中肌醇提取率的影响，结果如图2所示。
图2 复合酶质量比对肌醇提取率的影响
Fig.2 Effect of the mass ratio of multi-enzyme on the extraction rate of inositol
由图2中可知，肌醇提取率随着纤维素酶与半纤维素酶质量比的变化呈现明显的先增后减趋势，在复合酶质量比2∶1时达到最高，此时肌醇提取率为1.96%。其中复合酶质量比 4∶1、2∶1、1∶1 对肌醇提取率的影响均不明显，当复合酶质量比为1∶2时肌醇提取率明显下降。纤维素酶能破坏金银花细胞壁，使肌醇便于从细胞中释放出来，半纤维素酶能够水解与肌醇相连的半纤维素，有利于肌醇的浸出。因此，复合酶（纤维素酶∶半纤维素酶）质量比以2∶1为宜。
2.2.3 酶解温度对肌醇提取率的影响
按照复合酶添加量1.0%，纤维素酶和半纤维素酶的质量比 1∶1，料液比 1∶20（g/mL）加入超纯水，搅拌均匀，酶解120 min，根据1.3.4的方法考察酶解温度对金银花中肌醇提取率的影响，结果如图3所示。
图3 酶解温度对肌醇提取率的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of inositol
由图3中可知，酶解温度由40℃升到60℃时，肌醇提取率逐渐增加，最高为1.94%；升温至65℃时，提取率则显著降低。这可能是随着酶解温度的升高，扩散速度加快，复合酶分子活性增加，同时复合酶与底物的碰撞速率也加快了，使得复合酶水解细胞壁的反应速率加快，提取率增加[24]。当温度升高至65℃，肌醇提取率急剧下降，则是由于温度升高导致酶分子的空间结构发生了变化，大部分复合酶失活所致。因此，酶解温度以60℃为宜。
2.2.4 酶解时间对肌醇提取率的影响
按照复合酶添加量1.0%，纤维素酶和半纤维素酶的质量比 1∶1，料液比 1∶20（g/mL）加入超纯水，搅拌均匀，置于60℃恒温水浴锅中酶解，根据1.3.4的方法考察酶解时间对金银花中肌醇提取率的影响，结果如图4所示。
图4 酶解时间对肌醇提取率的影响
Fig.4 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of inositol
由图4可知，当酶解时间从60 min增加到90 min时，肌醇提取率迅速增加到最大值，为1.95%。随着酶解时间延长至150 min，提取率略有下降但不明显；当酶解时间增加到180 min时，提取率则明显降低。因此，酶解时间对肌醇提取影响明显，考虑实际操作成本，以90 min为宜。
2.3 正交试验结果
在单因素试验结果的基础上，固定酶解温度为60℃，以肌醇提取率为评价指标，选取酶解时间（A）、复合酶添加量（B）、复合酶质量比（C）为自变量，设计L9（34）肌醇提取工艺正交优化试验，结果如表2所示，方差分析如表3所示。
表2 肌醇提取工艺优化试验设计与结果
Table 2 Design and results of orthogonal test for inositol extraction
试验号 A B C 空列 肌醇提取率/%1 1 1 1 1 1.74 2 1 2 2 2 1.44 3 1 3 3 3 1.73 4 2 1 2 3 1.82 5 2 2 3 1 1.96 6 2 3 1 2 1.90 7 3 1 3 2 1.83 8 3 2 1 3 1.71 9 3 3 2 1 1.90 k1 1.637 1.797 1.783 1.867 k2 1.893 1.703 1.720 1.723 k3 1.813 1.843 1.840 1.753 R 0.256 0.140 0.120 0.144
表3 正交试验方差分析
Table 3 Analysis and variance of orthogonal test
注：“-”表示对结果影响不显著（P>0.05）。
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性酶解时间 0.103 2 3.029 19.000 -复合酶添加量 0.030 2 0.882 19.000 -复合酶质量比 0.022 2 0.647 19.000 -空列 0.034 2 1.000 19.000误差 0.03 2
由表2、表3可知，酶解时间对肌醇提取率影响最大，其次为复合酶添加量，复合酶质量比影响最小；优化工艺条件为A2B3C3，即酶解时间90 min、复合酶添加量1.5%、复合酶质量比为1∶1。
2.4 验证试验
根据预测的优化条件，按复合酶质量比为1∶1，复合酶添加量1.5%，酶解时间90 min，根据1.3.4的方法，平行测定 5次，得肌醇提取率为（1.99±0.02）%，高于表2中最大提取率1.96%。
2.5 总抗氧化能力评价
依据1.3.1测得优化工艺所得金银花提取液肌醇浓度为（0.99±0.01）g/L；根据1.3.6的方法，制得肌醇质量浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的稀释液，并以相同浓度VC为阳性对照，计算各溶液的总抗氧化能力，结果如图5所示。
图5 肌醇和VC的总抗氧化能力
Fig.5 The total antioxidant capacity of inositol and VC
由图5可知，肌醇和VC的总抗氧化能力变化趋势一致，在0.2 g/L～0.6 g/L浓度范围内线性增长关系明显，0.6 g/L时达到峰值，分别为（5.31±0.10）U/mL和（41.38±0.35）U/mL；继续增加浓度则趋于稳定。相同质量浓度肌醇的总抗氧化能力相当于VC的10.0%～12.8%。
3 结论
本试验以罗田金银花为材料，利用正交试验优化金银花中肌醇的纤维素酶和半纤维素酶协同提取工艺，即复合酶质量比1∶1、复合酶添加量1.5%、料液比1∶20（g/mL），60℃酶解 90 min，肌醇提取率为 1.99%，其总抗氧化能力为相同质量浓度VC的10.0%～12.8%。该工艺条件温和，简单可行，可用于金银花中肌醇提取物的工业化制备。
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