狭果茶藨子（Ribes stenocarpum Maxim.）又名长果醋栗，与黑果茶藨（黑加仑）同属虎耳草科茶藨属（Ribes L.）浆果植物[1]。据统计茶藨属植物全世界有160多种，我国约50余种，青海、西藏、甘肃、陕西、云南、四川等地均有分布[2]，其中青海省有11种1个变种[3]。狭果茶藨子果实味酸、性温，具有解毒功能，种子富含亚油酸，具有软化血管、防治动脉硬化等功效[4]。其果实营养丰富，含有丰富的糖类、氨基酸等多种元素[5-7]，是制作果汁、果酒、果酱等的佳品。
我国茶藨子资源丰富[8]，种类较多，但尚未进行有效开发利用，研究进展缓慢，已有的文献报道也是屈指可数。何可群等[6]研究了贵州亨利茶藨子中化学成分的提取与分离方法，并对茶藨子粗提物进行了抗菌活性研究；袁凤莲[7]对新疆茶藨子的茶产品加工工艺进行了报道；贾健辉等[9]对东北茶藨子复合饮料制备工艺进行了研究；李静等[10]发现五裂茶藨子叶中黄酮类化合物可抑制炎症因子；叶英等[11]对青藏高原狭果茶藨子粗提物进行了研究，发现其具有良好的抑菌活性及抗疲劳活性。狭果茶藨子发酵性能良好，在前期研究中发现，狭果茶藨子鲜果在一定条件下放置一段时间后可自行发酵产生独特的酒香味，具有加工成优质果酒的潜力。
果酒是水果经发酵制成的低度饮料酒，主要成分除乙醇外，还富含还原糖、氨基酸、维生素及多酚类等营养物质[12]。果酒具有抗氧化[13]、激发肝功能的功效[14]，还有利于情绪的调节[15]，饮用适量果酒可促进机体血液循环和新陈代谢[16]。陈玲等[17]研究表明枸杞果酒中富含多种生物活性成分，具有清除自由基、抗肿瘤和调节免疫等功能；孙晓伟等[18]研究发现黑加仑果酒中富含氨基酸和矿质元素等，具有控制糖尿病、改善血液循环、改善老年人健忘症等功能。
近几年，随着年轻人饮酒习惯的改变，对于酒的口感要求开始朝清新柔和的方向转变，导致果酒需求量逐年上升。据调查显示，2011年～2016年我国果酒销售年增长率平均达23%[19]。如今，新型果酒产品研发具有广阔的市场前景。本试验以青海地区狭果茶藨子果实为原料，采用响应面法优化狭果茶藨子果酒发酵工艺，制备得到新型狭果茶藨子果酒，以期丰富现有果酒品种，并为狭果茶藨子在果酒上的应用提供参考，进而促进青藏高原茶藨子资源的开发利用。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
狭果茶藨子：采自青海省互助县；果胶酶（酶活力≥60 000 U/mL）、香槟酵母、降酸酵母、陈酿型干红酵母、焦亚硫酸钾、发酵助剂：烟台帝伯仕自酿机有限公司；丹宝利酿酒高活性干酵母：丹宝利酵母股份有限公司；安琪果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；单宁：齐齐哈尔台龙食品有限公司；白砂糖：山东雅汇糖业有限公司。
1.2 仪器与设备
YM-75高压蒸汽灭菌锅：海三申医疗器械有限公司；JA1003电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；DHG 9070A电子鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；WDP-450电热恒温培养箱：上海安亭科学仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：国华电器有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计：苏州岛津仪器有限公司；PAL-109酒精计：河北省武强县威尔仪表厂。
1.3 狭果茶藨子果酒制备工艺
1.3.1 工艺流程
原料处理→打浆→果胶酶酶解→调酸→调糖→添加SO2、单宁、发酵助剂→接种酵母→发酵→过滤→澄清→灭菌装瓶
1.3.2 操作要点
原料选取及破碎：选取果粒大且饱满、无虫眼的狭果茶藨子鲜果，去除果梗后，打浆备用。
果胶酶处理：果胶酶添加量为0.5 g/L，在45℃水浴锅中酶解4 h，以提高果浆的出汁率。
添加SO2、单宁、发酵助剂：焦亚硫酸钾、单宁和发酵助剂的添加量分别为0.1 g/L、0.1%和0.5%，并与果浆充分混匀。
酵母活化：酿酒酵母用5%的糖水活化20 min，确保酵母的活性，再加入到果浆中搅匀。
1.3.3 试验设计
首先以不同种类酵母（香槟酵母、降酸酵母、陈酿型干红酵母、丹宝利酿酒高活性干酵母、安琪果酒专用酵母）、主发酵时间（5、6、7、8、9、10、11 d）、初始糖含量（10%、15%、20%、25%、30%、35%）、初始 pH 值（2、3、4、5、6、7）、酵母添加量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）为单因素，在发酵温度为28℃的条件下按照1.3.1的工艺流程发酵。再以单因素试验为基础，选择初始糖含量（A）、酵母添加量（B）、主发酵时间（C）为评价因素设计三因素三水平响应面试验，因素与水平设计见表1，以果酒酒精度和感官评分为指标，确定果酒发酵的最佳工艺。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Response surface factor level
水平 因素A初始糖含量/%B酵母添加量/%C主发酵时间/d-1 25 0.04 7 0 30 0.05 8 1 35 0.06 9
1.3.4 理化指标检测及感官评价方法
总糖：参考王文平等[20]的方法，采用苯酚-硫酸法测定狭果茶藨子果酒中的总糖含量。以葡萄糖作为标品绘制标准曲线方程Y=0.654 6X+0.022 7，R2=0.997；总酸：参考蔡成翔[21]的方法，利用酸碱滴定原理测定；总挥发酸：参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]检测狭果茶藨子果酒中总挥发酸含量；总有机酸：参考曾竟蓝等[23]的方法，以没食子酸作为标品绘制标准曲线方程Y=0.211 8X+0.123 2，R2=0.998，计算总有机酸含量；总酚：参考吴彭等[24]的方法，采用福林酚法测定狭果茶藨子果酒中的总酚含量；还原糖：参考李雪梅等[25]的方法，采用直接滴定法测定狭果茶藨子果酒中的还原糖含量；总黄酮：参考张自萍等[26]的方法，以芦丁作为标品绘制标准曲线方程Y=22.6X+0.036 8，R2=0.997，计算总黄酮含量；微生物检测：菌落总数的检测采用平板计数法[27]，大肠菌群的检测采用乳糖发酵法，致病菌不得检出。
感官评价方法：主发酵结束后，选取15名食品专业人员从狭果茶藨子果酒的色泽、澄清度、香气、滋味4个方面进行感官评分。评分标准见表2。
表2 感官评价
Table 2 Sensory evaluation
项目 评分标准 分值色泽（20分） 橙黄色、鲜艳悦目、有光泽 16～20橙黄色、基本无光泽 10～15褐变、无光泽 0～9澄清度（10分） 澄清、透亮、无浑浊 8～10较澄清 5～7浑浊 0～4香气（30分） 茶藨子果香及酒香浓郁 24～30茶藨子果香及酒香较淡 17～23果香较淡，有不良气味 0～16滋味（40分） 酒体柔顺、口味较好 31～40酒质酸涩、口感粗糙 21～30口味不爽、柔和性差 0～20
2 结果与分析
2.1 最佳活性干酵母筛选
不同酵母菌菌种对狭果茶藨子果酒酒精度和感官评分的影响见表3。
表3 不同酵母菌菌种对狭果茶藨子果酒酒精度、感官评分的影响
Table 3 Effect of different yeast strains on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine
菌种 酒精度/%vol 感官评分香槟酵母 12.1 79陈酿型干红酵母 12.9 82降酸酵母 13.2 87丹宝利酿酒高活性干酵母 12.4 76安琪果酒酵母 12.6 85
由表3可知，降酸酵母主发酵结束时酒精度最高，为13.2%vol，感官评分也最高，为87分，最终发酵酒体呈橙黄色、澄清透明、协调适口，具有独特狭果茶藨子果香，其它酵母发酵得到的果酒整体口感偏酸。这说明在降酸酵母作用下，狭果茶藨子果实中丰富的有机酸被利用转化为其他物质，可以有效改善狭果茶藨子果实原有的酸涩口感，且降酸酵母相比其他酵母可有效缩短狭果茶藨子果酒主发酵时间。
不同酵母菌菌种发酵过程中总糖含量变化见图1。
图1 不同酵母菌对狭果茶藨子果酒总糖变化的影响
Fig.1 The effect of different yeasts on the fermentation of R.stenocarpum fruit wine
由图1可知，丹宝利酵母发酵较慢，且从第2天起总糖含量下降较快；香槟酵母和陈酿型干红酵母发酵较旺盛，第10天时主发酵结束；安琪果酒专用酵母第7天时发酵较剧烈，总糖含量迅速下降，第11天主发酵结束；使用降酸酵母进行发酵，从第2天开始，总糖含量呈稳定下降趋势，由最初249.65 g/L下降至4.36 g/L，主发酵第8天时终止，发酵过程较稳定。降酸酵母在果酒发酵过程中发酵平稳，发酵时间适中，酒体风味和口感最好，综合酒精度和感官评分的结果，选择降酸酵母作为狭果茶藨子果酒制备的主要酵母。
2.2 主发酵时间单因素试验结果
主发酵时间对狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响见图2。
图2 主发酵时间对狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.2 The effect of main fermentation time on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine
由图2可知，狭果茶藨子果酒酒体的酒精度和感官评分随着主发酵时间延长呈现先增大再下降的趋势。发酵至第8天时，果酒的酒精度和感官评分均达最高，酒精度为13.5%vol，感官评分为89分。结合2.1结果可知，主发酵时间较短时发酵不充分，酒体中总糖含量高，酒精度和香气成分积累不够，进而会影响酒体的感官品质；当主发酵时间过长时由于营养物质的过度消耗不利于酵母菌生长繁殖，此时酵母菌会大量自溶或者代谢产生不良产物。因此，选择8 d为果酒发酵的最佳主发酵时间。
2.3 初始糖含量单因素试验结果
初始糖含量对狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响见图3。
图3 初始糖含量对狭果狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.3 The effect of initial sugar content on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine
由图3可知，初始糖含量为10%、15%时，果酒的口感有酸涩味，且酒精度和感官评分偏低；初始糖含量为30%时果酒酒精度和感官评分均达到最大值，酒精度达14.5%vol，感官评分为88分。初始糖含量为35%时，果酒的口感偏甜，掩盖了狭果茶藨子果实本身独有的风味。因此，选择初始糖含量30%作为茶藨子果酒发酵的最佳初始糖含量。
2.4 初始pH值单因素试验结果
初始pH值对狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响见图4。
图4 初始pH值对狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.4 The effect of initial pH on the alcohol content and sensory scores of R.stenocarpum fruit wine
由图4可知，当初始pH值为2、3、4时，果酒的口感较酸，当初始pH值调整至5时，果酒的口感风味较好，酒精度和感官评分均达到最大值，酒精度达14.0%vol，感官评分为87分，pH值进一步增加，果酒略带钠盐味，感官评分较低。因此，初始pH 5适宜茶藨子果酒发酵。
2.5 酵母添加量单因素试验结果
酵母添加量对狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响见图5。
图5 酵母添加量对狭果茶藨子果酒酒精度及感官评分的影响
Fig.5 The effect of yeast addition on alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine
由图5可知，酵母添加量为0.02%和0.03%时，果酒酒精度和感官评分都较低，可见此时发酵并不完全；酵母添加量为0.05%时酒精度和感官评分均达最大值，酒精度为14.2%vol，感官评分达88分，此时果酒的香气成分和风味物质形成较完全；继续增加酵母添加量，酒精度和感官评分均下降，这可能是酵母对发酵底物消耗速度过快造成的。因此，选择酵母添加量0.05%作为果酒发酵的最佳条件。
2.6 响应面试验结果
2.6.1 响应面试验结果及方差分析
狭果茶藨子果酒发酵的响应面试验结果见表4，方差分析见表5。
表4 响应面试验结果与分析
Table 4 Response surface test results and analysis
试验号 A初始糖含量B酵母添加量C主发酵时间酒精度/%vol 感官评分1 0 1 -1 9.4 64 2 0 0 0 12.3 87 3 0 -1 -1 10.0 75 4 -1 -1 0 11.7 81 5 0 -1 1 9.8 71 6 -1 0 1 10.4 83 7 0 0 0 9.2 67 8 1 0 1 12.1 83 9 0 0 0 12.7 86 10 0 1 1 10.6 82 11 -1 0 -1 9.7 76 12 1 -1 0 10.6 74 13 1 1 0 13.1 89 14 0 0 0 13.8 94 15 1 0 -1 13.1 89 16 -1 1 0 12.8 87 17 0 0 0 13.4 92
表5 以感官评分为指标的响应面试验方差分析结果
Table 5 The variance analysis result of response surface test with sensory score as index
注：* 差异显著，P＜0.05；** 差异极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1 205.17 9 133.91 29.95 ＜0.000 1 **A 364.50 1 364.50 81.52 ＜0.000 1 **B 32.00 1 32.00 7.16 0.031 8 *C 8.00 1 8.00 1.79 0.222 9 AB 49.00 1 49.00 10.96 0.012 9 *AC 4.00 1 4.00 0.89 0.375 7 BC 36.00 1 36.00 8.05 0.025 1 *A2 212.25 1 212.25 47.47 0.000 2 **B2 212.25 1 212.25 47.47 0.000 2 **C2 212.25 1 212.25 47.47 0.000 2 **残差 31.30 7 4.47失拟项 0.50 3 0.17 0.002 0.995 0纯误差 30.80 4 7.70总和 1 236.47 16
采用多元回归拟合上述试验结果，得到以感官评分为目标函数Y=-1 016.8+20.29A-0.12B+121.6C-70AB+0.2AC-300BC-0.284A2-71B2-7.1C2。由表5可知，该试验模型 P＜0.01（极显著），失拟项 P=0.995 0（不显著），此外，该模型相关系数R2=0.974 7，说明该试验模型设计合理，能充分拟合试验数据，可用于狭果茶藨子果酒制备的工艺分析和预测。在所设计的试验范围内各因素对狭果茶藨子感官评分的影响依次为A>B>C，即初始糖含量＞酵母添加量＞主发酵时间。
2.6.2 交互作用分析
各个因素交互作用关系见图6。
图6 两因素交互作用的响应曲面图
Fig.6 Response surface plot of the interaction of each two factors
由图6可知，A与B、B与C交互作用的三维图较陡，曲面变化较为明显，等高线图呈椭圆形，说明A、B交互作用和B、C交互作用对果酒的感官评分影响较大，初始糖含量的曲线变化幅度较大，尤其说明该因素对果酒感官评分的影响较大；A与C交互作用三维图坡面较陡，但变化不显著，故主发酵时间与初始糖含量的交互作用对茶藨子果酒的感官评分影响并不明显。
2.6.3 验证试验
通过响应面设计试验结果分析，狭果茶藨子果酒最佳发酵工艺条件为：初始糖含量30.13%，酵母添加量0.047%，主发酵时间8 d，在此条件下，得到果酒酒精度为14.10%vol，感官评分为95分。考虑到实际可操作性和便利性，将主发酵条件修正为初始糖含量30%，酵母添加量为0.05%，主发酵时间为8 d，在此条件下进行验证试验。经过3组平行试验，得到最终狭果茶藨子果酒酒精度为14.0%vol，感官评分为94分，与模型预测值接近，验证了试验结果的可靠性。
2.7 狭果茶藨子果酒理化指标检测结果
狭果茶藨子果酒理化指标检测结果见表6。
表6 狭果茶藨子果酒理化指标测定结果
Table 6 Determination of physical and chemical indexes of Ribes stenocarpum wine
酒精度/%vol感官评分14.00 30.35 0.32 1.16 4.36 4.27 1.36 2.15 94.00总酸/（g/L）挥发酸/（g/L）总有机酸/（g/L）总糖/（g/L）还原糖/（g/L）总酚/（g/L）总黄酮/（g/L）
由表6可知，发酵得到的狭果茶藨子果酒中营养物质丰富，其中总酚含量达1.36 g/L，总黄酮含量达2.15 g/L，这可能是其风味的主要物质来源，具体风味成分种类有待进一步分离鉴别。狭果茶藨子果酒细菌总数为16 CFU/mL（≤100 CFU/mL），未检测出大肠杆菌和致病菌，符合相关卫生标准。
3 结论
通过响应面分析法得到狭果茶藨子果酒的最佳发酵工艺条件：初始糖含量30%，初始pH5，酵母添加量0.05%，主发酵时间8 d。在此工艺条件下发酵得到的果酒色泽鲜艳，呈橙黄色，果香浓郁，滋味醇厚，酒体协调，酒精度达14.0%vol，感官评分94分。测得果酒中总酸含量30.35 g/L，挥发酸含量为0.32 g/L，总有机酸含量为1.16 g/L，总糖含量4.36 g/L，还原糖含量4.27 g/L，总酚含量1.36 g/L，总黄酮含量2.15 g/L，细菌总数和大肠杆菌总数均符合国家标准。
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