五加科人参属草本植物人参，药用部位为其干燥根，在亚洲作为一种传统中药已有数千年的历史[1-2]。目前，人参在中草药市场上仍然占有突出的地位，被认为是世界上使用最广泛的药食同源食品之一 [3-5]。2012年人参被列为新资源食品，自此人参行业在中国进入了快速发展的时期[6]。人参内含有多种人体所必需的营养成分和生物活性物质，如人参皂苷、多糖、挥发油等，具有较高的价值[7-8]。人参皂苷是人参中功效作用较为丰富的一种主要活性成分，其分离方法及生理活性研究一直是人们广泛讨论的话题。人参皂苷主要由 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 组成，占人参总皂苷含量的90%[9]。然而，研究表明，通过对原人参皂苷进行糖基修饰而得到的稀有人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5具有更大的功效潜力[10-11]，稀有人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5在诸多药理活性试验中表现出较强的抗癌、抗炎、抗糖尿病等功效[12-16]。
目前，将人参中的人参皂苷转化成稀有人参皂苷主要采用两种方法，即先提取分离人参皂苷，再进行结构修饰[17]；或先进行结构修饰，再提取分离[18]，但这些方法存在制备时间长、专一性差、得率低、溶剂消耗大、耗能高等缺点[19-22]。本文利用多功能改进型索氏提取器，以人参须根粉为原料，研究柠檬汁催化制备稀有人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的工艺条件，探索绿色、高效、简便的稀有皂苷制备方法。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
柠檬、人参须根粉：市售；甲醇（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Tedia公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；人参皂苷标准品：成都曼斯特生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
多功能改进型索氏提取器（专利号CN2017-20660247.5）：吉林化工学院自制；P230P型高效液相色谱 （high performance liquid chromatography，HPLC）仪：大连依利特分析仪器有限公司；PinnacleⅡC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：RESTEK 公司；RE-52C旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
1.3.2 人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5的 HPLC 标准曲线绘制
精密称量人参皂苷对照品20（S）-Rg3 1.926 mg、20（R）-Rg3 1.940 mg、Rg5 2.032 mg，用甲醇定容至10 mL，配成人参皂苷单体对照品储备液，从中分别准确移取2.5、1.0、0.5、0.25 mL溶液用甲醇定容至 10 mL，配制成5种不同质量浓度的人参皂苷对照品溶液。人参皂苷对照品溶液经0.45 μm滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析，并以人参皂苷浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.3.3 人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的制备方法
在多功能改进型索氏提取器的提取筒中放入过100目筛人参须根粉2 g，在提取筒和圆底烧瓶中分别加入20 mL不同浓度的乙醇水溶液，取新鲜的柠檬汁[23]加至圆底烧瓶中并放入搅拌转子，安装索氏提取装置。将装置中的圆底烧瓶置于不同温度的油浴中，并在提取筒中通入预先加热到特定温度的导热液，200 r/min下加热搅拌提取。当提取筒出现回流液时打开提取筒下端活塞，并保持液面至提取达到动态平衡。提取结束，提取液冷却，离心，取上清液，固体残渣用10 mL的甲醇分两次洗涤，离心，与上清液合并。上清合并液经充分混合，移取1/25合并液，小心滴加饱和碳酸钠至pH6，旋蒸至干。残留物中加入4 mL的甲醇，超声溶解，用0.45 μm滤膜过滤，进行HPLC分析，并计算人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的总得率，计算公式如下。
Y/%=m/M×100
式中：Y为总得率，%；m为所提稀有人参皂苷质量，g；M为人参须根粉质量，g。
稀有人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的制备原理见图1。
图1 稀有人参皂苷20(S，R)-Rg3和Rg5的制备原理
Fig.1 Preparation principle of rare ginsenosides 20(S，R)-Rg3 and Rg5
1.3.4 正交试验优化提取制备20（S，R）-Rg3、Rg5的工艺条件
在单因素试验的基础上，为了进一步优化反应条件，在柠檬汁用量2 mL、油浴温度135℃的条件下，选取乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取筒温度（C）3个因素，每个因素选取3个水平进行L9（34）正交试验，确定最优试验方案。因素与水平见表1。
表1 L9（34）正交试验因素与水平
Table 1L9（34）orthogonal experimental factors and levels
水平 A乙醇浓度/% B提取时间/h C提取筒温度/℃1 20 2 75 2 30 3 60 3 40 4 45
1.3.5 HPLC分析方法
本试验按照文献[24]的色谱条件进行定量分析。
2 结果与分析
2.1 线性关系考察
将 1.3.2 配制的人参皂苷的 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3、Rg5的标准品储备液进行HPLC定量分析，以人参皂苷标准品的质量浓度为横坐标X（μg/mL），以峰面积为纵坐标 Y（mV）绘制标准曲线，得 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3和Rg5的回归方程及R2值如下。
Y20（S）-Rg3＝7.425 8X＋0.861，R2＝0.999 9
Y20（R）-Rg3 ＝8.376 0X-6.340 2，R2＝0.999 9
YRg5＝16.883 0X-40.53，R2＝0.999 6
结果显示 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3 和 Rg5 的标准曲线线性关系良好，可信度较高。
2.2 单因素试验
2.2.1 乙醇浓度对人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 得率的影响
分别以20%、30%、40%、50%、60%的乙醇水溶液为提取溶剂，在提取筒温度65℃，油浴温度125℃下提取3 h，考察乙醇浓度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响，结果见图2。
图2 乙醇浓度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5
图2表明，乙醇浓度为20%时，人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的总得率最低，30%时总得率最高。而当乙醇浓度进一步升高时，20（S，R）-Rg3和Rg5的总得率呈整体下降的趋势。分析原因，可能是由于多功能改进型索氏提取器在循环提取过程中，同时可以实现动态的梯度提取。乙醇溶液汽化时气相组分中醇浓度会增大，导致提取过程中提取溶剂的极性由高逐渐转低，根据“相似相溶”原理，不同极性溶剂的梯度提取可能更有助于多种极性的人参皂苷通过结构修饰转化为 20（S，R）-Rg3 和 Rg5。与文献[25-26]中报道的人参皂苷最佳提取乙醇浓度（70%～80%）相比，该工艺所需乙醇浓度仅为30%，因此可以节省乙醇溶剂的使用。
2.2.2 柠檬汁用量对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
柠檬汁中含有丰富的柠檬酸，此外还含有酒石酸和苹果酸，均可以在水中解离质子催化人参皂苷的结构修饰反应。以30%的乙醇水溶液为提取溶剂，分别加入 0.5、2.0、3.5、5.0、6.5 mL 柠檬汁，在提取筒温度65℃，油浴温度125℃下提取3 h，考察不同柠檬汁用量对人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 得率的影响，结果见图3。
图3 柠檬汁用量对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
Fig.3 Effect of lemon juice dosage on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5
图 3 表明，人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的总得率在0.5 mL～2.0 mL范围内随着柠檬汁用量的增加而增加，2.0 mL～5.0 mL范围内几乎保持不变，进一步提高柠檬汁用量，总得率有所下降。这说明柠檬汁用量为2.0 mL～5.0 mL 时比较适合人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5的制备，如果过少，酸催化能力下降，总得率低；若过多，会导致人参皂苷Rg5部分分解，使总得率下降。
2.2.3 油浴温度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
以浓度30%的乙醇水溶液为提取溶剂，在提取筒温度 65℃下，分别在 105、115、125、135、145℃油浴温度下提取3h，考察不同油浴温度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响，结果见图4。
图4 油浴温度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
Fig.4 Effect of oil bath temperature on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5
由图 4可见，油浴温度为 105℃时，20（S，R）-Rg3和Rg5的总得率只有0.14%，这是因为105℃油浴温度下提取溶剂较难进行汽化，无法完成动态循环提取，致使所提人参皂苷少，故20（S，R）-Rg3和Rg5的总得率也随之减少。随着油浴温度的提高，提取溶剂循环速度加快，20（S，R）-Rg3和Rg5的总得率也逐渐增加，当油浴温度为135℃时，其总得率达到最大值3.03%；而进一步提高油浴温度，皂苷总得率反而下降。
2.2.4 提取筒温度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
以浓度为30%的乙醇水溶液为提取溶剂，提取筒温度分别设置为 35、45、55、65、75℃，在油浴温度 135℃下提取3h，考察不同提取筒温度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响，结果如图5所示。
图5 提取筒温度对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
Fig.5 Effect of extraction cylinder temperature on yield of ginsenosides 20（S，R）-Rg3 and Rg5
随着提取筒温度从35℃到75℃不断升高，人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的总得率也随之增加，这是因为提取筒温度升高，人参皂苷在提取溶剂中的溶解度增加，在相同时间内可以提取更多人参皂苷，这就可以使较多的人参皂苷转化成稀有人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。
2.2.5 提取时间对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
以浓度为30%的乙醇水溶液为提取溶剂，在提取筒温度75℃，油浴温度135℃下分别提取1、2、3、4、5h，考察不同提取时间对人参皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响，结果见图6。
图6 提取时间对人参皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影响
Fig.6 Effect of extraction time on yield of ginsenosides 20（S，R）-Rg3 and Rg5
在提取时间 1 h～4 h 范围内，20（S，R）-Rg3、Rg5的总得率随着提取时间的增加呈增长趋势，当提取时间进一步延长至5 h时，人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的总得率略有下降，可能是持续高温会导致副反应发生。考虑到实际操作及能源节约的角度，选择3 h为皂苷最佳提取时间。
2.3 正交试验结果
正交试验结果见表2。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results
序号 A B C D（误差） 总得率/%1 1 1 1 1 1.43 2 1 2 2 2 2.42 3 1 3 3 3 2.53 4 2 1 2 3 2.49 5 2 2 3 1 2.66 6 2 3 1 2 3.68 7 3 1 3 2 1.82 8 3 2 1 3 2.72 9 3 3 2 1 2.49 K1 6.38 5.74 7.83 6.58 K2 8.83 7.81 7.40 7.92 K3 7.04 8.69 7.01 7.74 k1 2.13 1.91 2.61 2.19 k2 2.94 2.60 2.47 2.64 k3 2.35 2.90 2.34 2.58极差R 0.81 0.99 0.27 0.45因素主次 B>A>C最优组合 A2B3C1
由表2可知，乙醇浓度（A）、提取时间（B）和提取筒温度（C）的极差R分别为0.81、0.99和0.27，说明影响20（S，R）-Rg3和Rg5总得率的因素主次顺序为B（提取时间）>A（乙醇浓度）>C（提取筒温度）。最优组合方案为A2B3C1，即乙醇浓度30%、提取时间4 h、提取筒温度75℃。按最优方案进行3次重复性验证试验，所得稀有人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的总得率分别为3.69%、3.71%和3.72%，表明工艺稳定可行。
图7是优化条件下不加入柠檬汁和加入柠檬汁提取人参皂苷时人参提取物的HPLC分析图。
图7 人参须根粉提取物的HPLC分析图
Fig.7 HPLC analysis chart of fine ginseng root powder extract
A.不加柠檬汁提取；B.加柠檬汁提取。
由图7可知，无柠檬汁加入时，提取得到的是原人参二醇组皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 以及原人参三醇组皂苷 Rg1 和 Re，而加入柠檬酸提取时，Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd以及Rg1和Re的吸收峰明显变小或消失，而在保留时间约65 min～67 min和80 min时，出现明显的稀有人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的吸收峰，这说明柠檬汁的加入可以很好地通过结构修饰将提取皂苷转化成目标产物稀有皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。
结果表明，当人参须根粉中的原人参二醇组皂苷完全转化成20（S，R）-Rg3和Rg5时，理论计算得率在2.86%～2.93%之间，而在相同提取条件下 20（S，R）-Rg3和Rg5的实测总得率为3.68%，明显高于理论计算值。分析原因，可能是因为人参中不仅含有常见的原人参二醇组皂苷，还含有极性更大的丙二酸单酰基人参皂苷，当利用多功能改进型索氏提取器对人参须根粉进行提取时，提取桶内乙醇浓度不断变化，可以实现对不同极性人参皂苷和丙二酸单酰基人参皂苷的梯度提取，而丙二酸单酰基人参皂苷在柠檬汁作用下会水解生成相应的人参皂苷，进而提高稀有人参皂苷20（S，R）-Rg3和 Rg5的总得率。
3 结论
本文利用多功能改进型索氏提取器，在柠檬汁催化下从人参须根粉中提取制备稀有人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。试验过程具有溶剂循环提取、溶剂梯度提取、连续动态提取、绿色催化、固液分离等特点，可以有效提高稀有人参皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的制备效率。利用多功能改进型索氏提取器，既能对不同极性的人参皂苷进行高效梯度提取和转化，又能减少醇类提取剂的使用，同时试验操作简单，环境友好，实现了提取和结构修饰的有机结合，这对于高附加值稀有人参皂苷的大量制备以及相关产品的开发具有重要借鉴意义。
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