沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）原产于欧亚大陆，在海拔2 500 m～4 300 m的许多国家都有栽培[1]。沙棘中含有丰富的维生素、胡萝卜素、微量元素、氨基酸等生物活性物质[2-4]。因此，沙棘已被临床用于治疗辐射损伤、烧伤、口腔炎症、胃溃疡等疾病[5-7]。沙棘叶含有丰富的活性物质[8]，具有抗氧化、免疫调节[9]、抗应激和炎症[10]的活性功能。目前，针对沙棘叶中的活性成分提取分离研究较多，不同的提取剂对沙棘叶中的活性物质及抗氧化性的影响尚未见报道。
本文采用羟基自由基、超氧阴离子自由基和还原力3种体外抗氧化模型对沙棘叶甲醇提取物以及水相、丙酮相、乙醇相和乙酸乙酯相等5个极性部位的抗氧化活性进行研究，并测定其总多糖、总黄酮、总有机酸、抗坏血酸和氨基酸含量，进行相关性分析，为沙棘叶资源开发利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘叶：采摘于山西庞泉沟风景区。芦丁标准品、谷氨酸标准品、没食子酸标准品、抗坏血酸标准品：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
LGJ-10N真空冷冻干燥机：北京亚星仪科科技发展有限公司；YZH-92A水浴恒温振荡器：江西省生物仪器制造有限公司；752紫外分光光度计：上海精研电子科技有限公司；LH-4035低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 沙棘叶处理
将沙棘嫩叶放置在真空冷冻干燥机中，冷阱温度-40℃，真空度20 Pa、加热板温度10℃。冷冻干燥10 h至质量不变，粉碎备用。
1.3.2 样液制备
称取沙棘叶 2.0 g，按照料液比 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）加入一定体积双蒸水，50 ℃恒温水浴1 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液，获得沙棘叶的水提取溶液。按照同样的方法，制备甲醇提取溶液、乙醇提取溶液、乙酸乙酯提取溶液和丙酮提取溶液，备用。
1.3.3 总黄酮含量的测定
总黄酮含量的测定参照文献[11]进行，以芦丁标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在510 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，其回归方程为y=0.92x+0.0218，R2=0.9915。
1.3.4 总多糖含量的测定
总多糖含量的测定参照文献[12]进行，以葡萄糖标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在489 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，其回归方程为y=3.446 4x-0.001 6，R2=0.999 7。
1.3.5 氨基酸含量的测定
氨基酸含量的测定参照文献[13]进行，以谷氨酸标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在570 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，其回归方程为y=4.498 9x-0.034 9，R2=0.999 2。
1.3.6 总有机酸含量的测定
总有机酸含量的测定参照文献[14]进行，以没食子酸标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在730 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，其回归方程为y=1.987x+0.005 2，R2=0.999 7。
1.3.7 抗坏血酸含量的测定
抗坏血酸含量的测定参照文献[15]进行，以抗坏血酸标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在244 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，其回归方程为 y=0.061 5x-0.015 3，R2=0.999 8。
1.3.8 抗氧化能力测定
超氧阴离子自由基清除能力、羟基自由基清除能力、还原能力测定参照文献[16-18]进行。
1.4 数据处理
数据处理采用SPPS Statistics 21软件对数据进行处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂提取物含量分析
2.1.1 总黄酮含量分析
不同提取剂对沙棘叶总黄酮含量的影响见图1。
图1 不同提取剂对沙棘叶中总黄酮含量的影响
Fig.1 Effects of different extracts on the content of total flavonoids in seabuckthorn leaves
由图1可以看出，用不同的提取剂提取沙棘叶中的总黄酮，总黄酮含量差异性较大，同一种提取剂在不同的料液比下，总黄酮含量也呈现出明显的差异。从图1可以看出，相比其它4种提取剂，用甲醇作为提取剂，提取出沙棘叶中的总黄酮含量最高，其次是水>丙酮>无水乙醇>乙酸乙酯。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂提取出的总黄酮含量呈现先上升后下降的趋势。其中，当以甲醇作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，总黄酮的含量最高，为（64.26±1.38）mg/g。
2.1.2 总多糖含量分析
对沙棘叶的总多糖含量进行测定分析，结果见图2。
图2 不同提取剂对沙棘叶中总多糖含量的影响
Fig.2 Effects of different extracts on the content of total polysaccharide in seabuckthorn leaves
由图2可以看出，用不同的提取剂提取沙棘叶中的总多糖，总多糖含量差异性较大，同一种提取剂在不同的料液比下，总多糖含量也呈现出明显的差异。相比其它4种提取剂，用甲醇作为提取剂，提取出沙棘叶中的总多糖含量最高。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂提取出的总多糖含量呈现先上升后下降的趋势。其中，当以甲醇作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，总多糖含量为（19.84±0.64）mg/g。
2.1.3 氨基酸含量分析
不同提取剂对沙棘叶氨基酸含量的影响见图3。
图3 不同提取剂对沙棘叶中氨基酸含量的影响
Fig.3 Effects of different extracts on the content of amino acids in seabuckthorn leaves
由图3可知，沙棘叶中氨基酸含量受提取剂的影响也较大，用不同的提取剂提取沙棘叶中的氨基酸，氨基酸含量差异明显。其中，同一种提取剂采用不同的料液比，得到的氨基酸含量也呈现出明显的差异。相比其它4种提取剂，用甲醇作为提取剂，提取出沙棘叶中的氨基酸含量最高，其次是水>丙酮>无水乙醇>乙酸乙酯。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂提取出的氨基酸含量呈现先上升后下降的趋势。其中，当以甲醇作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，氨基酸含量为（7.41±0.07）mg/g。
2.1.4 总有机酸含量分析
对沙棘叶总有机酸含量进行测定，结果见图4。
图4 不同提取剂对沙棘叶中总有机酸含量的影响
Fig.4 Effects of different extracts on the content of total organic acids in seabuckthorn leaves
沙棘叶总有机酸含量的变化随着提取剂的不同，呈现出明显的差异。从图4可以看出，提取剂对沙棘叶总有机酸含量的变化有很大的影响。呈现出的大致规律是甲醇>水>丙酮>无水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一种提取剂采用不同的料液比，得到的总有机酸含量也呈现出明显差异。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂提取出的总有机酸含量呈现先上升后下降的趋势。其中，当以甲醇作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，总有机酸含量为（3.45±0.05）mg/g。
2.1.5 抗坏血酸含量分析
对沙棘叶中的抗坏血酸含量进行测定，结果见图5。
图5 不同提取剂对沙棘叶中抗坏血酸含量的影响
Fig.5 Effects of different extracts on the content of ascorbic acid in seabuckthorn leaves
沙棘叶中抗坏血酸含量随着不同提取剂及料液比的不同而呈现出显著的变化。其中，同一种提取剂采用不同的料液比，得到的抗坏血酸含量也呈现出显著性的差异。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂提取出的抗坏血酸含量呈现先上升后下降的趋势，在料液比为 1∶5（g/mL）和 1∶10（g/mL）时，以甲醇作为提取剂得到的抗坏血酸含量较高，随着提取溶剂的增加，以水作为提取剂得到的抗坏血酸含量较高。其中，当以甲醇作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，抗坏血酸含量为（95.55±0.18）mg/g。
2.2 不同溶剂提取物抗氧化能力分析
2.2.1 羟基自由基清除能力测定
提取剂对沙棘叶羟基自由基清除能力的影响见图6。
图6 不同提取剂对沙棘叶中羟基自由基清除率的影响
Fig.6 Effects of different extracts on the hydroxyl radical scavenging in seabuckthorn leaves
如图6所示，不同提取剂对沙棘叶羟基自由基清除能力的影响不同。羟基自由基清除能力呈现出的大致规律是甲醇>水>丙酮>无水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一种提取剂采用不同的料液比，羟基自由基清除能力也呈现出显著性的差异。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂对羟基自由基清除能力影响呈现先上升后下降的趋势。其中，当以甲醇作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，羟基自由基清除率为（89.37±0.10）%。
2.2.2 超氧阴离子自由基清除能力测定
提取剂对超氧阴离子自由基的清除能力的影响见图7。
图7 不同提取剂对沙棘叶中超氧阴离子自由基清除率的影响
Fig.7 Effects of different extracts on the superoxide anion radical scavenging in seabuckthorn leaves
如图7所示，不同提取剂对沙棘叶超氧阴离子自由基清除能力的影响不同。超氧阴离子自由基清除能力呈现出的大致规律是丙酮>水>甲醇>无水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一种提取剂采用不同的料液比，超氧阴离子自由基清除能力也呈现出明显的差异。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂对超氧阴离子自由基清除能力的影响呈现先上升后下降的趋势。其中，当丙酮作为提取剂，在料液比为 1∶10（g/mL）时，超氧阴离子自由基清除率为（98.28±0.00）%。
2.2.3 还原力测定
还原力受提取剂的影响见图8。
图8 不同提取剂对沙棘叶中还原力的影响
Fig.8 Effects of different extracts on the reducing power in seabuckthorn leaves
从图8可以看出，沙棘叶提取物还原力的大小随着提取剂的不同而不同。其中，以甲醇和水作为提取剂时，还原力较为接近。在料液比1∶5（g/mL）和1∶10（g/mL）时，以丙酮作为提取剂，测定得到的还原力与甲醇和水作为提取剂时较为相近，随着料液比的增加，还原力逐渐下降，低于以水和甲醇作为提取剂测定得到的还原力。
提取剂相同时，随着提取溶剂体积的增加，5种提取剂对还原力大小的影响呈现先上升后下降的趋势。在沙棘叶原料与提取剂的比值为1∶10（g/mL）处达到最高。其中，当丙酮作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，还原力为 0.85±0.01。
2.3 提取物含量与抗氧化性相关性分析
对提取物与抗氧化相关性进行分析，结果见表1。
表1 沙棘叶抗氧化性与活性物质含量相关系数
Table 1 Correlation coefficient between antioxidant capacity and active components of seabuckthorn leaves
氨基酸还原力 1 0.643**0.618**0.854**0.804**0.878**0.750**0.724**·OH 0.643** 1 0.651**0.675**0.773**0.562**0.750**0.731**O2-· 0.618**0.651** 1 0.680**0.652**0.734**0.654**0.690**指标 还原力 ·OH O2-· 总多糖总黄酮抗坏血酸总有机酸
续表1 沙棘叶抗氧化性与活性物质含量相关系数
Continue table 1 Correlation coefficient between antioxidant capacity and active components of seabuckthorn leaves
注：**在0.01水平（双侧）上显著相关。
氨基酸总多糖 0.854**0.675**0.680** 1 0.887**0.929**0.851**0.897**总黄酮 0.804**0.773**0.652**0.887** 1 0.831**0.931**0.941**抗坏血酸 0.878**0.562**0.734**0.929**0.831** 1 0.807**0.851**总有机酸 0.750**0.750**0.654**0.851**0.931**0.807** 1 0.858**氨基酸 0.724**0.731**0.690**0.897**0.941**0.851**0.858** 1指标 还原力 ·OH O2-· 总多糖总黄酮抗坏血酸总有机酸
由表1可见，沙棘叶各极性部位对还原力、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力与提取物中不同物质含量均显示正相关。
各极性部位还原力与总多糖、总黄酮、抗坏血酸和总有机酸含量显示相关性较高。各极性部位羟基自由基清除能力与总黄酮和总有机酸的含量显示相关性较高。各极性部位超氧阴离子自由基清除能力与抗坏血酸的含量显示相关性较高。综合提取物不同物质和抗氧化性结果发现，甲醇、水和丙酮部位抗氧化活性最好，总多糖、总黄酮、抗坏血酸和总有机酸等含量也较高。由此表明，沙棘叶抗氧化的物质基础可能是总多糖、总黄酮、抗坏血酸和总有机酸等物质。
3 讨论与结论
沙棘叶活性物质的含量受到不同提取剂及料液比的影响，本研究结果表明，沙棘叶中的总黄酮、总多糖、总有机酸、抗坏血酸和氨基酸含量都是在料液比为1∶10（g/mL）时达到最大值。这可能是由于料液比为1∶10（g/mL）时，溶剂对沙棘叶中活性物质的溶解已基本达到饱和，继续增加溶剂的用量，并不能显著提高活性物质的提取量。有研究者研究菠萝蜜果皮总黄酮的提取时发现，料液比对黄酮得率的影响很大，随料液比增大，黄酮提取率逐渐增大，持续增大料液比，黄酮提取率反而降低。因为在一定范围内，料液比增大利于增加溶剂和原料的接触效果，增大浓度差，加快溶剂扩散，从而提高黄酮浸出率；而当料液比过大时，黄酮溶出量达到饱和，而其它杂质溶出增多，反而降低了黄酮提取率[19]。
本研究发现溶剂对沙棘叶活性物质有明显的影响，多数研究文献也证实了活性物质的提取率受提取剂的影响较大。有研究者指出，沙棘叶中的芦丁（黄酮类物质）含量受到不同溶剂的影响，沙棘叶中水提物芦丁的提取量和提取率都低于醇提物[20]。沙棘叶中粗多糖提取率随着提取剂的不同，得率也不相同，有文献报道，采用乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水提取沙棘粗多糖，得率分别为1.52%、1.71%和2.41%，比水提取得到的多糖得率要高[21]，与本试验研究结果有区别。赵玉琪等研究者[22]对沙棘叶黄酮的提取研究发现，甲醇水溶液的提取率高于乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和水等溶剂，并且抗氧化能力强，与本研究结果一致。
本研究发现，不同提取剂及料液比对沙棘叶的抗氧化活性也有显著影响。有文献报道，用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇4种不同溶剂对沙棘籽分别进行8 h萃取,甲醇作为萃取剂的提取物具有最高的抗氧化活性[23]。有研究者采用不同浓度的丙酮、甲醇、酸化甲醇、乙酸乙酯对沙棘籽提取物抗氧化活性进行评估发现，70%丙酮提取物具有最强的还原力[24]，本试验结果表明，当丙酮作为提取剂，在料液比为1∶10（g/mL）时，还原力达到最大值为0.85，该报道与本研究结果较为相似。
试验进一步对不同提取物中活性物质含量与抗氧化活性进行相关性分析，发现活性物质的含量与抗氧化性呈现显著正相关。尤其是抗坏血酸、总多糖、总黄酮的含量与抗氧化活性的相关系数较高，由此证明抗坏血酸、多糖、黄酮化合物可能是沙棘叶抗氧化作用的物质基础。
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