流行病学调查结果显示，在中国，胃病发生率高达85%，其中胃癌居我国城市男女高发癌症的前5位，严重威胁着人类健康[1]。
胃病发生和发展的一个重要表现就是胃黏膜损伤，其主要诱因包括酸碱平衡失调、胃幽门螺旋杆菌侵袭和胃肠黏膜的化学性损伤[2]，可归结为胃黏膜的防护因子及攻击因子失衡，造成胃黏膜内的防护因子弱于攻击因子，进而产生胃黏膜损伤[3]。到目前为止，研究人员已开发出了胃酸中和药、H2受体拮抗剂、H+泵抑制剂等用于临床，使胃黏膜损伤性疾病的治疗取得了一定进展。但是，抗酸药仍存在许多亟待解决的问题，如治疗时间长、溃疡愈合迟缓、复发率高、副作用多等[4]。因此，人们一直在寻找其它替代药物。
多糖是广泛存在于自然界的生物大分子，与蛋白质、核酸和脂质共同构成了最基本的生命物质[5]，与人类生活密切相关，对维持生命活动起着至关重要的作用。除此之外，多糖还被证实具有多种生物活性，如免疫调节[6-9]、抗氧化[10-13]、抗肿瘤[13-14]、胃肠道保护[15-17]、降血糖[18-20]、抗炎[21-22]等。如果能够通过多糖来辅助治疗胃肠道疾病，不仅可对医药和食品行业发展起到积极作用，也将对人类健康作出有利贡献。
茯苓是中医里广泛使用的传统“药食同源”食材，具有渗湿利水、益脾和胃、宁心安神的功效[23]，许多经典养胃健脾方剂中都有茯苓的身影。多糖作为茯苓的主要活性成分，已被证实具有抗肿瘤[24]和提高免疫力[25-26]等作用，但其在胃保护方面的作用鲜有报道。本文通过建立乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤模型[27]，探究茯苓多糖（Poria cocos polysaccharide，PCP）对胃黏膜损伤的辅助保护作用，并为PCP保护胃黏膜损伤的机制研究提供前期理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茯苓原料：江中食疗科技有限公司。西咪替丁：美国Sigma公司；小鼠白细胞介素-10（interlrukin-10，IL-10）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、胃蛋白酶活性酶联免疫吸附试验试剂盒：南京森贝伽生物科技有限公司；苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色液：上海碧云天生物技术有限公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
METTLER TOLEDO XS105电子分析天平：上海梅特勒-托利多仪器公司；JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机：武汉俊杰电子有限公司；KD-P组织摊片机：金华市科迪仪器设备有限公司；RM2016病理切片机：上海徕卡仪器有限公司；3K15高速台式离心机：德国Sigma公司；3001全波长扫描式多功能读数仪（多功能酶标仪）：美国Thermo公司；Nikon Eclipse E100正置光学显微镜：日本Nikon公司；LAQUAtwin-Ph-33微量PH计：日本HORIBA公司；KZ-II组织破碎仪：武汉塞维尔生物科技有限公司。
1.3 实验动物
清洁级5周龄雄性昆明小鼠，体质量32 g～38 g，许可证号：SCXK（京）2016-0011，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验过程中所有动物实验严格遵守南昌大学动物管理条例，伦理委员会鉴定许可。实验垫料、饲料经过辐照杀菌处理，饮用水经高压灭菌处理。
1.4 方法
1.4.1 茯苓多糖的提取与制备
茯苓粉用5倍体积95%乙醇溶液浸泡24 h后，采用改良后的热水浸提结合酶辅助醇沉法提取PCP[28]。将提取液旋蒸浓缩至原体积1/5，采用Sevage法脱蛋白，之后依次用自来水流水透析2 d，蒸馏水透析1 d，再旋蒸浓缩，倒平板冻干即得茯苓多糖。
1.4.2 乙醇致胃黏膜损伤动物模型的建立
将60只昆明小鼠随机分为6组，分别为正常组、模型组、西咪替丁组和PCP低、中、高剂量组，每组10只。
小鼠适应性喂养7d，开始正式实验后，每天称重并根据体重变化调整灌胃剂量（0.1 mL/10 g）。PCP每天灌胃剂量：低剂量组0.05 g/kg bw、中剂量组0.1 g/kg bw、高剂量组0.2 g/kg bw，正常组、模型组、西咪替丁组灌胃相应体积生理盐水。持续灌胃12 d。第13天，西咪替丁组按1 mg/10 g bw灌胃西咪替丁，其它组保持不变，持续3 d。第16天造模前，各组小鼠均严格禁食不禁水12 h，期间亦禁止给予受试物。正式造模当天，各组均继续灌胃对应受试物，1 h后，正常组按0.1 mL/10 g给予生理盐水，其余组均按0.1 mL/10 g给予70%乙醇，70 min后处死。
1.4.3 脏器指数的测定
正式造模当天称量并记录体重后，处死，取脏器（肝脏、肾脏、脾脏、胸腺）并用生理盐水清洗，滤纸吸干后称重记录，用于计算脏器指数。
脏器指数/（mg/g）=器官质量（mg）/小鼠体重（g）
1.4.4 胃液pH值的测定
小鼠处死后，剪开腹部取出胃，沿胃大弯剪开，小心取出内容物后，在（25±2）℃条件下，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，用微量pH计测出小鼠胃液pH值。
1.4.5 直观胃黏膜损伤情况观察及胃黏膜损伤指数的测定
小鼠处死后，剪开腹部取出胃，沿胃大弯剪开，洗净残留内容物后展开固定，拍照记录。肉眼观察并记录褶皱和出血点个数，用游标卡尺测量损伤条带的长度和宽度。评分标准见表1[29]。
表1 胃黏膜损伤指数评分
Table 1 Gastric mucosal injury index score
损伤程度 1分 2分 3分 4分出血点 1 分/个糜烂长度 1 mm～5 mm 6 mm～10 mm 11 mm～15 mm 16 mm～20 mm糜烂宽度 1 mm～2 mm ＞2 mm
胃黏膜损伤指数=出血点分数+糜烂长度分数+糜烂宽度分数×2
1.4.6 胃组织病理观察
选取每只小鼠胃黏膜损伤最严重部位，切下约10 mm×2 mm的组织，固定于4%福尔马林溶液中，常规梯度脱水、包埋、切片、烤片，HE染色后置于光学显微镜下观察。
1.4.7 胃组织匀浆液制备
将胃沿胃大弯剪开，洗净内容物并展开胃黏膜。将胃组织与磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）按体积比 1∶9 混合，加入 4 mm 研磨珠，用组织破碎仪进行破碎，制得10%胃组织匀浆。将匀浆液以3 500 r/min在4℃下离心10 min，取上清液，得组织匀浆上清液，以进行后续实验。
1.4.8 胃组织IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性测定
参照试剂盒说明书，测定胃组织匀浆上清液中的IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性。
1.5 数据处理与分析
实验数据结果以平均值±标准差表示，采用Graph-Pad Prism 8软件作图；采用单因素ANOVA分析和Tukey′s多因素t检验进行显著性分析。p＜0.05时，表示组间具有显著差异；p＜0.01时，表示具有极显著差异；0.05＜p＜0.1时，表示与正常组相比倾向于具有显著差异。
2 结果与分析
2.1 伏苓多糖对小鼠脏器指数的影响
各组小鼠脏器指数见表2。
表2 各组小鼠脏器指数
Table 2 Organ index of mice in each group
注：$为与正常组相比倾向于具有显著差异（0.05＜p＜0.1）。
胸腺指数/（mg/g）正常组 39.72±2.39 15.41±1.23 2.49±0.87 1.52±0.28模型组 42.30±2.42$15.63±1.15 2.64±0.64 1.55±0.23西咪替丁组 41.20±3.00 15.36±1.81 2.63±0.85 1.53±0.26 PCP 低剂量组 41.59±1.34 15.54±1.69 2.67±0.63 1.57±0.24 PCP 中剂量组 41.34±2.64 15.43±0.99 2.63±0.8 1.53±0.25 PCP 高剂量组 40.82±4.01 15.37±1.15 2.62±0.86 1.51±0.27组别 肝脏指数/（mg/g）肾脏指数/（mg/g）脾脏指数/（mg/g）
如表2所示，各实验组之间肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数、胸腺指数均无显著性差异，但模型组肝脏指数与正常组相比倾向于具有显著差异。说明乙醇致胃黏膜损伤模型对小鼠的其它脏器无明显损伤，现有实验条件下茯苓多糖及西咪替丁对小鼠无显著毒副作用。
2.2 胃黏膜表观
各组胃黏膜直观图见图1。
图1 各组胃黏膜直观图
Fig.1 The direct view of gastric mucosa in each group
A.正常组；B.模型组；C.西咪替丁组；D.PCP 低剂量组；E.PCP 中剂量组；F.PCP高剂量组。
由图1可知，正常组小鼠胃黏膜完整，形态和色泽正常，未见出血、溃疡、糜烂等异常情况；模型组小鼠胃黏膜有明显的出血、溃疡和糜烂，可见粗大的出血条带及大量的出血点，表明乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤模型造模成功；西咪替丁组小鼠胃黏膜有少量出血点，未见溃疡、糜烂等情况，说明西咪替丁能有效防止胃黏膜损伤；PCP低、中、高剂量组均有少量出血点，未见溃疡、糜烂等情况，说明PCP能有效防止胃黏膜损伤。
2.3 伏苓多糖对胃液pH值的影响及损伤评价
胃液pH值及胃黏膜损伤评价见图2。
图2 胃液pH值及胃黏膜损伤评价
Fig.2 PH of gastric juice and evaluation chart of gastric mucosal injury in each group
##为与正常组相比有极显著差异（p＜0.01）；**为与模型组相比有极显著差异（p＜0.01）。
由图2A可知，模型组胃液pH值极显著高于正常组（p＜0.01），西咪替丁是胃酸抑制剂，故西咪替丁组胃液pH值与正常组和模型组差异极显著。PCP低剂量组与模型组相比未能降低胃液pH值，而PCP中、PCP高剂量组相比模型组pH值均显著降低，且数值与正常组无显著差异。
由图2B可知，模型组损伤评分极显著高于其它组，说明乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤造模成功。其余各给药组相比模型组损伤评分均有极显著下降，其中PCP高剂量组评分最低，且与正常组无显著差异，之后依次为西咪替丁组、PCP中剂量组和PCP低剂量组。
2.4 胃组织病理学观察
各组胃组织病理学观察图见图3。
图3 各组胃组织病理学观察图（×200 μm）
Fig.3 Histopathological observation of stomach in each group（×200 μm）
A.正常组；B.模型组；C.西咪替丁组；D.PCP 低剂量组；E.PCP 中剂量组；F.PCP高剂量组；a.炎性细胞浸润；b.上皮细胞脱落；c.腺体结构紊乱；d.黏膜充血。
如图3所示，正常组小鼠胃组织结构完整，腺体排列整齐，未见胃黏膜上皮细胞脱落、水肿及充血现象。与正常组相比，模型组小鼠胃组织腺体结构紊乱，胃黏膜严重充血，上皮细胞大量脱落，可见明显的炎性细胞浸润。与模型组相比，西咪替丁组和PCP低、中、高剂量组胃黏膜损伤状态均有明显改善，胃黏膜上皮细胞脱落、胃黏膜充血及腺体结构紊乱情况有所减轻，炎性细胞浸润减少。由此可知，西咪替丁和PCP低、中、高剂量都对胃黏膜损伤有辅助保护作用。
2.5 胃组织IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性测定结果
胃组织IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性见图4。
图4 胃组织IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性变化
Fig.4 The content of IL-10、LPS and the activity change of pepsin in gastric tissue
##为与正常组相比有极显著差异（p＜0.01）；**为与模型组相比有极显著差异（p＜0.01）；*为与模型组相比有显著差异（p＜0.05）。
由图4可知，模型组IL-10含量极显著低于正常组，PCP低剂量组与模型组有显著差异，其余各给药组与模型组相比均无明显差异；模型组LPS含量极显著高于正常组，各给药组均较模型组有一定降低，其中西咪替丁组和PCP低、中剂量组与模型组相比有极显著差异，PCP高剂量组与模型组相比无明显差异；模型组胃蛋白酶活性与正常组相比有极显著差异，各给药组相对模型组均有极显著改善。
3 结论
饮酒伴随着中国传统文化传承多年，形成了中国特有的“酒文化”，但酒精会对人体造成伤害。本文通过脏器指数数据可知，短时间乙醇暴露虽未对其它脏器造成不利影响，但肝脏指数有增大的趋势，因此在传承“酒文化”的同时降低酒精对人的伤害成了近年来热门的研究方向。茯苓作为常见的“药食同源”食材，有很大的利用前景和发展空间。本实验各项结果表明，茯苓多糖可以恢复胃正常状态下的产酸能力，同时通过降低胃蛋白酶活性以及减少胃组织中脂多糖含量起到对胃黏膜的辅助保护作用。实验结论可为以茯苓多糖为原料的相关产品开发提供理论基础。值得注意的是，茯苓多糖对胃黏膜损伤具体的保护机制尚不明确，仍需进一步探讨。
[1] BRAY F,FERLAY J,SOERJOMATARAM I,et al.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2018,68(6):394-424.
[2] 唐蕾.中西医结合治疗胃肠疾病的思路与方法[J].中医药管理杂志,2014,22(13):2282-2283.TANG Lei.Thoughts and methods for treating gastrointestinal diseases with integrated traditional Chinese and western medicine[J].Journal of Traditional Chinese Medicine Management,2014,22(13):2282-2283.
[3]TARNAWSKI A S,AHLUWALIA A,JONES M K.Increased susceptibility of aging gastric mucosa to injury:the mechanisms and clinical implications[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(16):4467-4482.
[4] 王蕾,周四元,梅其炳.多糖治疗胃溃疡的研究进展[J].中成药,2003,25(8):52-53.WANG Lei,ZHOU Siyuan,MEI Qibing.Research progress of polysaccharides in treating gastric ulcer[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2003,25(8):52-53.
[5] 聂少平,黄晓君.天然产物多糖对胃肠道功能的影响[J].中国食品学报,2015,15(5):11-19.NIE Shaoping,HUANG Xiaojun.Effects of natural polysaccharides on gastrointestinal function[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2015,15(5):11-19.
[6] 刘贝女,张屏,吴迎香,等.悬钩子木多糖的分离纯化及免疫调节活性研究[J].中草药,2019,50(24):5941-5949.LIU Beinv,ZHANG Ping,WU Yingxiang,et al.Separation,purification and immunomodulatory activity of polysaccharides from Rubus sachalinensis[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2019,50(24):5941-5949.
[7] 陈金龙,张月巧,袁娅,等.植物多糖通过NF-κB信号通路对巨噬细胞的免疫调节作用研究进展[J].食品科学,2015,36(23):288-294.CHEN Jinlong,ZHANG Yueqiao,YUAN Ya,et al.Progress in research on immune-regulatory effects of plant polysaccharides on macrophages through NF-κB signaling pathway[J].Food Science,2015,36(23):288-294.
[8] 赵明明,余强,王辉,等.黑灵芝多糖对免疫抑制小鼠肠道黏膜形态及肠道黏膜免疫的影响[J].食品科学,2019,40(1):137-142.ZHAO Mingming,YU Qiang,WANG Hui,et al.Effect of Ganoderma atrum polysaccharide on intestinal mucosal morphology and immunity in immunosuppressed mice[J].Food Science,2019,40(1):137-142.
[9] YU Q,NIE S P,WANG J Q,et al.Chemoprotective effects of Ganoderma atrum polysaccharide in cyclophosphamide-induced mice[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,64:395-401.
[10]江国勇,雷艾彤,杨莹,等.黑灵芝多糖对丙烯酰胺致大鼠肝脏氧化损伤的保护作用[J].食品科学,2020,41(1):121-126.JIANG Guoyong,LEI Aitong,YANG Ying,et al.Protective effect of Ganoderma atrum polysaccharides against acrylamide-induced liver injury in rats[J].Food Science,2020,41(1):121-126.
[11]邱现创,赵宁,李晨,等.铁皮石斛多糖提取工艺优化及对果蝇抗氧化能力的影响[J].食品科学,2018,39(2):273-280.QIU Xianchuang,ZHAO Ning,LI Chen,et al.Optimization of extraction of polysaccharide from Dendrobium officinale and its antioxidant effect on Drosophila melanogaster[J].Food Science,2018,39(2):273-280.
[12]WU Y T,HUO Y F,XU L,et al.Purification,characterization and antioxidant activity of polysaccharides from Porphyra haitanensis[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,165:2116-2125.
[13]LI J G,NIE S P,XIE M Y,et al.Chemical composition and antioxidant activities in immumosuppressed mice of polysaccharides isolated from Mosla chinensis Maxim cv.Jiangxiangru[J].International Immunopharmacology,2013,17(2):267-274.
[14]钟闰,吴思伟,何秀苗,等.杜氏盐藻胞外多糖抗肿瘤活性及其机制研究[J].食品工业科技,2020,41(22):126-133.ZHONG Run,WU Siwei,HE Xiumiao,et al.Antitumor activity and mechanism of exopolysaccharide from Dunaliella salina[J].Science and Technology of Food Industry,2020,41(22):126-133.
[15]MIN F F,WAN Y J,NIE S P,et al.Study on colon health benefit of polysaccharide from Cyclocarya paliurus leaves in vivo[J].Journal of Functional Foods,2014,11:203-209.
[16]ZHENG B,YING M X,XIE J H,et al.A Ganoderma atrum polysaccharide alleviated DSS-induced ulcerative colitis by protecting the apoptosis/autophagy-regulated physical barrier and the DC-related immune barrier[J].Food&Function,2020,11(12):10690-10699.
[17]FAN L L,ZUO S,TAN H Z,et al.Preventive effects of pectin with various degrees of esterification on ulcerative colitis in mice[J].Food&Function,2020,11(4):2886-2897.
[18]CHEN H H,NIE Q X,HU J L,et al.Hypoglycemic and hypolipidemic effects of glucomannan extracted from konjac on type 2 diabetic rats[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2019,67(18):5278-5288.
[19]RANI A N A,MAHMUD R,AMRAN N,et al.In vivo hypoglycemic investigation,antihyperglycemic and antihyperlipidemic potentials of Pereskia bleo Kunth.in normal and streptozotocin-induced diabetic rats[J].Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine,2019,9(2):73-79.
[20]LI Q Q,HU J L,NIE Q X,et al.Hypoglycemic mechanism of polysaccharide from Cyclocarya paliurus leaves in type 2 diabetic rats by gut microbiota and host metabolism alteration[J].Science China Life Sciences,2021,64(1):117-132.
[21]杜军霞,宫彬彬,宋菲,等.枸杞多糖的抗炎镇痛作用研究[J].天然产物研究与开发,2019,31(2):236-239.DU Junxia,GONG Binbin,SONG Fei,et al.Anti-inflammatory and analgesic effects of Lycium barbarum polysaccharides[J].Natural Product Research and Development,2019,31(2):236-239.
[22]DENG Y X,ZHAO S Y,BIAN Y G,et al.Anti-inflammatory activity of polysaccharide isolated from Thamnolia subuliformis[J].Journal of Donghua University(English Edition),2017,34(5):641-645.
[23]国家药典委员会.中国药典（一部）[M].北京:中国医药科技出版社,2015:240-241.Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese pharmacopoeia(part 1)[M].Beijing:China Medicine Science and Technology Press,2015:240-241.
[24]KE R D,LIN S F,CHEN Y,et al.Analysis of chemical composition of polysaccharides from Poria cocos Wolf and its anti-tumor activity by NMR spectroscopy[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(1):31-34.
[25]WU Y J,LI S,LI H X,et al.Effect of a polysaccharide from Poria cocos on humoral response in mice immunized by H1N1 influenza and HBsAg vaccines[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,91:248-257.
[26]WANG H L,MUKERABIGWI J F,ZHANG Y N,et al.In vivo immunological activity of carboxymethylated-sulfated (1→3)-β-d glucan from sclerotium of Poria cocos[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,79:511-517.
[27]郝婷婷,马晓鹏,刘芳,等.大鼠急性胃黏膜损伤模型选择方法的比较研究[J].甘肃医药,2019,38(8):686-688,691.HAO Tingting,MA Xiaopeng,LIU Fang,et al.Comparative study on the selection methods of acute gastric mucosa injury in rats[J].Gansu Medical Journal,2019,38(8):686-688,691.
[28]方毅,赵园园,刘永好,等.茯苓多糖提取工艺研究[J].中医学报,2017,32(4):602-605.FANG Yi,ZHAO Yuanyuan,LIU Yonghao,et al.Study on extraction technology of polysaccharides from Poria cocos[J].Acta Chinese Medicine,2017,32(4):602-605.
[29]WU J Z,LIU Y H,LIANG J L,et al.Protective role of β-patchoulene from Pogostemon cablin against indomethacin-induced gastric ulcer in rats:Involvement of anti-inflammation and angiogenesis[J].Phytomedicine,2018,39:111-118.