我国已知牛肝菌科有28属，397种及变种[1]，产地主要集中在云南，由于野生牛肝菌是优良的外生菌根真菌，其生长对寄主要求严格，大多数种类仍不能通过人工栽培形成子实体[2-3]。据报道，在野生牛肝菌子实体生长过程中常常伴随着黄瘤孢菌的寄生，它无性时期产生的孢子粉会导致牛肝菌腐烂[4]，镰刀菌是引起多种食用菌根腐病、枯萎病的主要致病菌[5-6]，故在研究野生牛肝菌子实体栽培的过程中，明确其内生真菌与多种腐败菌的关系是至关重要的。目前对于牛肝菌内生真菌及拮抗腐败菌的报道较少，丁小维等[7]从牛肝菌子实体中分离出内生真菌毛霉属（Mucor sp.）和黄瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus），且菌株的发酵液对于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都表现出较好的抑制效果；岳万松等[8]从牛肝菌子实体中分离出5株内生真菌，分别为毛栓菌（Trametes hitsuta）、假丝酵母属（Candida sp.）、被孢霉属（Mortierella sp.）、散囊菌属（Eurotium sp.）和金色毛壳菌（Chaetomium aureum）。
木霉（Trichoderma sp.）广泛存在于潮湿的土壤及腐木中，也会作为内生真菌定殖于多种健康的生物组织内部[9-11]，因其具有对环境的广泛适应性及对多种腐败真菌的拮抗活性等特点，使得其在植物的生物防治方面备受关注[12]。木霉类生防制剂主要包括菌丝体、厚垣孢子及分生孢子制剂[13]，菌丝体制剂的存储及活化过程中无需无菌环境，真空冷冻干燥菌丝体制剂具有运输方便、储存期长等优点[14]，活化后可在土壤中迅速生长并发挥其防治特性。陈金莲[15]从药三七中分离出内生真菌盖姆斯木霉，该菌对土传病原真菌表现出较好的生防效果，还可产生多种次生代谢产物，促进三七植株的生长；梁忠接[16]研究表明，盖姆斯木霉与引起棉花黄萎病和枯萎病的病原真菌具有拮抗关系；Anees等[17]研究发现盖姆斯木霉可拮抗引起玉米粉穗腐病的病原菌，开发木霉生防制剂可有效减少化学杀菌剂所导致的农药残留及环境污染[18]。
本研究在通过组织分离法从新鲜野生牛肝菌中分离母种菌丝的过程中，获得1株内生真菌，结合该菌株的形态特征和rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列同源性分析对该菌株进行鉴定，构建系统发育树，对影响液态发酵菌丝体产量的关键因素进行优化，并对该菌株与牛肝菌常见腐败菌进行拮抗性研究，以期为牛肝菌等其他食用菌栽培及生物防治提供优良的生防菌株，也可为开发新资源化合物提供菌种资源[19-20]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
鲜野生牛肝菌子实体：采摘于云南省楚雄彝族自治区禄丰县，无菌袋、冰袋封装，空运24 h内分离。
GK2043胶回收试剂盒、GK1071 DNA提取试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司；引物ITS1和ITS4由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
供试腐败菌：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysprum）、黄瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus）从野生牛肝菌子实体中分离并经上海捷瑞生物工程有限公司进行菌种鉴定。
1.1.2 培养基
固态培养基（comprehensive potato dextrose agar，CPDA）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43 g，VB1 1 mg，琼脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。
综合马铃薯培养基（comprehensive potato dextrose broth，CPDB）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO43 g，MgSO·47H2O 1.5 g，VB1 1 mg，水 1 L，pH 值自然。
1.1.3 仪器与设备
JY300C电泳仪、JY02G凝胶成像系统：北京君意电泳设备有限公司；Beckman-JT-25R高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；ABI3730测序仪：北京东迅天地医疗仪器有限公司；HNY-100B恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；FD5-series真空冷冻干燥机：西盟国际公司。
1.2 试验方法
1.2.1 内生真菌的分离纯化及形态学观察
将新鲜野生牛肝菌子实体用自来水冲洗数次，去除表面杂质，无菌水冲洗4次，75%乙醇漂洗2 min，再用无菌水冲洗数次，洗去乙醇，用无菌纱布擦干子实体表面。进行组织分离，用无菌解剖刀将牛肝菌子实体纵切开后，将内部的组织切割成约0.5 cm2的小块，接种到CPDA平板上，29℃恒温避光培养到5 d，待组织小块周围有大量菌丝出现，挑取少许菌丝，采用点植法纯化培养，转接4次，获得纯菌株，显微镜观察其菌丝及分生孢子颜色、形态，再将其转接于斜面培养基上4℃保存。
1.2.2 rDNA ITS的内生真菌分子生物学鉴定
采用GK1071提取试剂盒，对菌株进行DNA提取。使用真菌ITS鉴定通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对DNA的ITS片段进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。扩增体系为30 μL 反应体系，包括 10×Taq Buffer 3 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA 聚合酶 1 μL，上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，DNA 模板 2 μL，双蒸水补足至30 μL。反应条件：预变性 95℃ 5 min，95℃ 15 s，95 ℃ 15 s，95 ℃ 45 s，35个循环，72℃，5 min保存。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳体系检测，采用凝胶成像系统观察结果。
PCR扩增产物用胶回收试剂盒GK2043回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司进行测序。将所测序列在NCBI中进行BLAST对比，选择同源性高于95%的序列，运用MEGA-X软件进行多重比较，通过邻接法（neighbor-joining method，N-J）构建系统发育树，并以bootstrap对发育树进行自举法检验1 000次，从而确定菌株的亲缘关系及分类地位。
1.2.3 单因素及正交试验设计
菌种活化：从CPDA培养基上取1 cm2菌片，接入到装有50 mL CPDB培养基的150 mL三角瓶中，振荡48 h，即为活化种子液。
在 CPDB 培养基中，以瓶中 50、75、100、125、150mL的装液量分别装入250 mL三角瓶，摇床转速100、120、140、160、180 r/min，初始 pH 3、4、5、6、7，培养温度25、27、29、31、33 ℃，接种量 5%，摇瓶培养 8 d，称量菌丝体质量，考察4个单因素对菌丝量的影响。
在单因素试验的基础上，选取四因素三水平进行L9（34）正交试验，确定菌丝体液态发酵条件。
1.2.4 菌株Trg-12菌丝体冷冻干燥
液态摇瓶培养8 d后，在三角瓶中加入5%甘油作为抗冻保护剂，在恒温摇床上160 r/min振荡15 min，使其充分混合后，在5 000 r/min离心10 min，滤纸过滤收集菌丝体，并用无菌水冲洗3次，放到培养皿中，在-20℃冰箱中预冻12 h后，将样品放入冷冻干燥机中，冻干条件为在冷阱-45℃，真空度10 Pa～20 Pa冻干12 h。精确称量并计算发酵液中干基菌丝量（g/L），每个样品重复3次。
1.2.5 菌株Trg-12与牛肝菌腐败菌的平板对峙试验
冻干菌丝1 g，溶于100 mL最佳液态发酵培养基中，在160 r/min、29℃，初始pH6在摇床上培养1 d制成活化菌液，将活化后的菌种涂布于CPDA培养基上，置于29℃条件下避光培养至5 d。参照刘青等[21]、梁晓洁等[22]的方法利用平板对峙法进行拮抗试验，采用点植法将菌株Trg-12与腐败真菌接种到新的固体培养基上，置于29℃条件下避光培养至5 d，十字交叉法测量菌落生长直径，以第5天时菌落直径计算抑菌率。对照组设置为单独接种腐败菌（尖孢镰刀菌及黄瘤孢菌为腐败菌）与对峙组培养条件相同，3组平行试验。
抑菌率/%=（对照组腐败菌的菌落直径-对峙组腐败菌的菌落直径）/对照组腐败菌的菌落直径
1.3 数据处理
试验中所有数据均进行3次平行试验，数据以平均值±标准表示。利用Origin 2018和SPSS 26软件对单因素试验进行数据处理，差异显著水平为p＜0.05。
2 结果与分析
2.1 菌株Trg-12的菌落与菌体形态特征
通过组织分离法从野生牛肝菌实体中分离出1株内生真菌，经纯化后接种于CPDA平板上，在29℃下培养5 d，观察其菌落、菌体及孢子形态（10×100），如图1所示。
图1 内生真菌菌落、菌体、孢子形态结果
Fig.1 Morphological results of endophytic fungi colony，hyphae，and conidia
a.牛肝菌子实体；b.菌落形态；c.菌丝形态；d.厚垣孢子形态。
由图1可知，菌落生长迅速，产生白色的气生菌丝覆盖整个培养基，不产生明显的分生孢子；菌丝无色有隔，有侧生分支，宽度为 2.1 μm～4.5 μm；厚垣孢子呈圆形，直径 7 μm～12 μm，壁厚约 1.5 μm，内部包裹着孢子颗粒。
2.2 菌株Trg-12的ITS rDNA鉴定
将菌株进行分子生物学鉴定，以引物ITS1和ITS4为模板对内生真菌的DNA进行PCR扩增，获得长度约为620 bp的特异性片段，菌株的ITS扩增产物电泳结果，如图2所示。
图2 Trg-12的ITS-PCR扩增电泳图
Fig.2 Electrophoresis pattern of ITS-PCR amplification of Trg-12
1.Trg-12的rDNA-ITS扩增片段；M.Marker模板。
将ITS扩增序列在NCBI库中进行BLAST比对，采用MEGA-X软件，按照N-J法构建系统发育树，见图3。
图3 基于rDNA-ITS序列构建菌株Trg-12的系统发育树（Bookstrap≥50%）
Fig.3 Construction of phylogenetic tree of strain Trg-12 based on rDNA-ITS sequence（Bookstrap≥50%）
对菌株进行种水平的分类鉴别，在NCBI中BLAST比对结果显示：100条序列中，菌株Trg-12与76株木霉属（Trichoderma sp.）的序列同源性为99%以上，说明该菌为木霉属；树枝的长短表示各菌株之间的遗传距离，同一支说明亲缘关系较近，以系统发育方法可以对关系较为密切的菌株序列进行较好的判别。结合形态学鉴定及BLAST对比及系统发育树结果：菌株与NCBI数据库中的Trichoderma gamsii聚类在同一支上，自检支持率99%，鉴定该菌为盖姆斯木霉（Trichoderma gamsii）。
2.3 菌株Trg-12产菌丝体的正交试验优化
2.3.1 装液量对菌株Trg-12菌丝量的影响
氧是影响Trg-12菌丝产量的重要因素，装液量能够反映液态发酵中培养基的供氧程度。采用250 mL三角瓶分别装入不同体积的培养基，装液量对菌丝量的影响结果，见图4。
图4 装液量对菌丝量的影响
Fig.4 The effect of liquid volume on the amount of mycelium
不同小写字母代表差异显著（p＜0.05）。
由图4可知，随着装液量的增加，菌丝量呈先增加后减小的趋势，在装液量100 mL后菌丝量下降，这与瓶中溶氧量有关，供给菌丝体生长代谢的氧不足，装液量50 mL时，由于培养基中营养物质有限，能供给菌丝体生长的营养不足，故菌株Trg-12在250 mL三角瓶中最适装液量为100 mL，此时菌丝量为4.15 g/L。
2.3.2 摇床转速对菌株Trg-12菌丝量的影响
摇床转速是与装液量协同完成液态培养基中氧的溶解，保证Trg-12菌丝生长所需的氧。在250 mL三角瓶中装入100 mL装液量，选择不同的摇床转速，摇床转速对菌丝量的影响结果，见图5。
图5 摇床转速对菌丝量的影响
Fig.5 The effect of shaking speed on the amount of mycelium
不同小写字母代表差异显著（p＜0.05）。
由图5可知，在180 r/min时菌丝量为4.27 g/L，表明摇床转速过高时，虽然溶氧水平有所提高，但相应的剪切力也增加，导致菌体出现老化与死亡的状况，使得菌丝量有所降低，在摇床转速较低时，体系内溶氧不足，进而影响菌丝体的生长与代谢，故菌株Trg-12液态发酵的摇床转速以160 r/min为宜，既能保证菌株Trg-12的溶氧需求，又不会对菌体造成损伤，菌丝量也达到最高，为4.35 g/L。
2.3.3 初始pH值对菌株Trg-12菌丝量的影响
培养基中pH值是影响微生物生长与繁殖的重要环境因素，最直接的表现形式为菌丝量的改变。不同的初始pH值对菌丝量的影响结果见图6。
图6 初始pH值对菌丝量的影响
Fig.6 The effect of initial pH on the amount of mycelium
不同小写字母代表差异显著（p＜0.05）。
从图6可知，初始pH 5.0～7.0较适宜菌株Trg-12菌体的生长，这说明培养基pH值在偏酸性或中性状态下，适宜其菌体内酶活力的发挥，故菌株Trg-12液态发酵的初始pH值以6为宜，此时菌丝量为4.20g/L。
2.3.4 培养温度对菌株Trg-12菌丝量的影响
改变温度可影响菌体内进行的许多生化反应，从而影响菌体的生命活力。不同的培养温度对菌丝量的影响结果，见图7。
图7 培养温度对菌丝量的影响
Fig.7 The effect of culture temperature on the amount of mycelium
不同小写字母代表差异显著（p＜0.05）。
由图7可知，菌株Trg-12在25℃～33℃均有不同程度的生长，随着温度的升高，菌丝产量呈先增加后减少的趋势，29℃时的菌丝量均高于同培养时间的其他温度下的菌丝量，故菌株Trg-12液态发酵的培养温度以29℃为宜，此时菌丝量为4.27 g/L。
2.3.5 菌株Trg-12正交试验优化结果
在单因素试验基础上选择装液量（A）、摇床转速（B）、初始 pH 值（C）和培养温度（D）4个因素，各取3个水平进行L9（34）的正交试验，确定液态培养的最佳条件，结果如表1所示。
表1 液态培养条件优选正交试验设计及结果
Table 1 Optimal orthogonal experimental design and results of liquid culture conditions
试验号 A装液量/mL菌丝量/（g/L）1 1（75） 1（120） 1（5） 1（27） 2.58 2 1 2（140） 2（6） 2（29） 3.29 3 1 3（160） 3（7） 3（31） 3.15 4 2（100） 1 2 3 2.83 5 2 2 3 1 3.02 6 2 3 1 2 4.26 7 3（125） 1 3 2 3.26 8 3 2 1 3 2.98 9 3 3 2 1 3.84 B摇床转速/（r/min）C初始pH值D培养温度/℃
续表1 液态培养条件优选正交试验设计及结果
Continue table 1 Optimal orthogonal experimental design and results of liquid culture conditions
试验号 A装液量/mL B摇床转速/（r/min）C初始pH值D培养温度/℃菌丝量/（g/L）K1 9.02 8.67 9.82 9.44 K2 10.11 9.29 9.96 10.81 K3 10.08 11.25 9.43 8.96 k1 3.01 2.89 3.27 3.15 k2 3.37 3.10 3.32 3.60 k3 3.36 3.75 3.14 2.99 R 0.36 0.86 0.18 0.61
由表1可知，液态培养条件中的装液量、摇床转速、初始pH值和培养温度均对菌丝体的生长产生影响，各因素作用主次顺序依次为：B＞D＞A＞C。得出最优液态培养条件组合为A2B3C2D2，即250 mL三角瓶装液量 100 mL，160 r/min，初始 pH 6，29℃。为了确定此最佳条件的可靠性，对最佳液态培养条件A2B3C2D2进行3次平行试验验证，平均菌丝量为4.43 g/L，高于正交试验中任何一组的试验结果，说明该组合为Trg-12的最优液态发酵条件。
2.4 菌株Trg-12对牛肝菌腐败菌的拮抗试验结果
镰刀菌与黄瘤孢菌是引起蘑菇枯萎病的主要腐败菌，进行Trg-12与2种腐败菌的拮抗性研究，在CPDA培养基上共同培养5 d，结果见图8。
图8 菌株Trg-12与牛肝菌腐败菌的拮抗效果图
Fig.8 Diagram of the antagonistic effect of Trichoderma gamsii and boletus spoilage fungus
A1.菌株Trg-12对峙尖孢镰刀菌；A0.尖孢镰刀菌对照；B1.菌株Trg-12对峙黄瘤孢菌；B0.黄瘤孢菌对照。
3 d时菌株Trg-12与腐败菌开始接触，5 d时的拮抗状态如图8 A1和图8 B1所示，对2种腐败菌表现出不同的抑制效果，菌株Trg-12抑制了腐败菌菌落的生长，腐败菌菌落边缘不再延伸，形成明显的抑菌带;尖孢镰刀菌的对照组菌落形态如图8 A0所示，菌落在平板上为圆形生长，平板背面有紫色色素产生；由图8 A1可知，此时菌株Trg-12对尖孢镰刀菌的抑制率为（53.7±1.9）%；由图8 B1可知，菌株Trg-12对黄瘤孢菌的生长有明显的抑制作用；黄瘤孢菌的对照组菌落形态如图8 B0所示，黄瘤孢菌初期为白色菌丝，后期为黄色孢子粉，5 d时，对峙组黄瘤孢菌有少量产孢现象，对照组已完全为黄色孢子，此时菌株Trg-12对黄瘤孢菌的平均抑制率为（74.7±1.6）%。
3 结论
目前对于牛肝菌内生真菌报道较少，为探究牛肝菌内生真菌与其腐败菌是否存在拮抗关系，本研究以新鲜野生牛肝菌子实体为分离材料，获得1株内生真菌Trg-12，对其进行形态观察和rDNA ITS序列分子生物学鉴定，鉴定该内生真菌为盖姆斯木霉（Trichoderma gamsii）。通过正交试验优化后的最佳液态发酵条件：以250 mL三角瓶中装液量100 mL，初始pH 6，摇床转速160 r/min，培养温度29℃。此条件下发酵的菌丝量为4.43 g/L。且经过平板对峙培养法测定，菌株Trg-12对牛肝菌常见腐败菌尖孢镰刀菌和黄瘤孢菌的抑制率分别为（53.7±1.9）%和（74.7±1.6）%，证明了木霉Trg-12对这两种腐败菌均有明显的抑制作用，且两菌交界处有较明显的抑菌带，推测可能是盖姆斯木霉菌分泌的抑制物作用的结果，说明菌株Trg-12具有较好的生防应用潜力。已有研究表明，盖姆斯木霉产纤维素酶的能力较强，且在生防方面具有安全无毒、无污染、保护植株不受腐败菌损害的同时提高植株的萌发率等优点，故木霉菌Trg-12作为大型真菌的病害生物防治研究与应用的潜力较大。本研究从野生牛肝菌中分离获得1株优良的生物防治菌株，为实现工业化生产菌丝体生防制剂提供技术参考。
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