核桃（Juglans regia L.）又称胡桃，是人们日常食用非常普遍的干果之一。核桃壳即核桃去仁后的木质外壳，质地坚硬、多孔且无毒，传统工业上主要用来作为抛光材料和过滤材料。现代化学研究发现，核桃壳中含多种化合物，包括酚类、苷类、苯丙酸类、酯类、黄酮类等，具有降脂、抗肿瘤等生物活性[1]。何春梅等[2]用超声辅助提取核桃壳色素中的多酚，利用超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）分析得出核桃壳多酚主要包括酚酸类和黄酮类两大部分。酚酸化合物中含有咖啡酸和原儿茶酸，黄酮类化合物中检测到3种化合物含量较高，分别为芦丁、异槲皮苷、槲皮苷。核桃壳色素作为天然色素，使用安全，具有一定的营养和药用价值，其色素提取与开发正成为研究热点，李维莉[3]按料液比1∶6（g/mL）加入核桃壳粉末和乙醇，控温80℃，利用超声波辅助提取2次，用AB-8树脂进行吸附，最后用50%乙醇洗脱，到了核桃壳色素。孙海涛等[4]利用超声波-微波联合辅助提取核桃壳色素多酚，在乙醇体积分数50%、料液比为1∶20（g/mL）、超声功率405W、微波功率200W条件下，提取率达2.361%。郭瑜等[5]对核桃壳色素提取物的DPPH·、·OH、H2O2和 O2-·的清除率及总抗氧化能力进行测定，结果发现核桃壳乙醇提取物及其氯仿相均具有清除自由基和体外抗氧化活性。现在提取方法多采用超声或微波辅助，发挥超声波振动空化作用及微波高能作用，但微波辅助设备要求高，不如超声辅助工业化易实现。本文利用超声辅助提取核桃壳色素，并表征其性能，以期为工业化生产提供直接数据支撑，拓展核桃壳色素在食品、纺织、医药、化妆品等领域的应用。此外提取后的残渣仍可用于其他工业生产，如制备工业吸附剂[6-7]，提高核桃壳综合利用度。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
核桃壳：采自河北涉县；95%乙醇（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；三氯化铁、氯化钙、氯化钠、氯化铝（均为分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；无水硫酸铜、硫酸镁、硫酸锌、氯化钾、抗坏血酸（vitamin C，VC）、磷酸二氢钠、铁氰化钾（均为分析纯）：天津市光复科技发展有限公司。
KO-500DB数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；800型离心沉淀器：济南市医疗机械厂。
1.2 试验方法
1.2.1 单因素试验
通过前期预试验，核桃壳经干燥、粉碎后过40目筛得核桃壳粉。精确称取核桃壳粉1.00 g，按料液比为1∶10（g/mL）加入提取剂，提取剂为浓度50%的乙醇水溶液，提取温度50℃，提取60 min，超声功率500 W。静置，取上清液，3 000 r/min离心15 min，进一步取上清液，稀释至核桃壳生药浓度为0.002 g/mL，用紫外可见分光光度计测得提取液最大吸收波长及其相应吸光度。
分别以提取温度（30、40、50、60、70 ℃）、乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、95%）、提取时间（10、20、30、40、50、60 min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]作为单因素，考察各影响因素对提取液吸光度的影响。
1.2.2 响应面优化试验
根据单因素试验结果确定Box-Behnken设计的自变量为提取温度、乙醇浓度、提取时间，进行三因素三水平响应面优化，试验重复3次取平均值。自变量取值如表1所示。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Response surface test factor level
水平 因素A提取温度/℃ B乙醇浓度/% C提取时间/min-1 40 45 55 0 50 50 60 1 60 55 65
采用Design expert对所得数据进行处理，得到二次回归方程和误差分析及各影响因素之间的交互作用，并确定最优工艺条件[8]。
取20 g核桃壳粉末，以最优工艺进行色素提取，所得提取液经50℃浓缩、干燥至恒重，研磨得核桃壳色素粉，称重并按如下公式计算色素产率。
色素产率/%=（色素质量/核桃壳干粉末质量）×100
1.2.3 核桃壳色素性能表征
1.2.3.1 金属离子对核桃壳色素的影响
取蒸馏水将核桃壳色素粉配制成浓度为1.0 mg/mL溶液，分别取8份1.00 mL溶液于25 mL容量瓶中，分别用浓度均为 0.05 mol/L 的 CuSO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、ZnSO4、KCl溶液定容，室温 20 ℃放置 24 h测定溶液最大吸收波长及吸光度[9]。
1.2.3.2 核桃壳色素对DPPH自由基的清除率
配制浓度为2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，核桃壳色素粉和维生素C分别配制浓度为5、10、15、20、25、30 μg/mL的水溶液。按文献[10]的方法及公式测定色素及VC的DPPH自由基清除率。
1.2.3.3 核桃壳色素还原力的测定
取核桃壳色素粉和VC分别用蒸馏水配制浓度为10、20、30、40、50、60 μg/mL 的溶液，取各溶液 2.5 mL于25 mL锥形瓶中，加0.2 mol/L pH6.6磷酸盐缓冲溶液2.5 mL，1%铁氰化钾溶液2.5 mL，摇匀于50℃水浴20 min后快速冷却，加10%三氯乙酸溶液2.5 mL，摇匀后以3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加1 g/L的三氯化铁溶液2.5 mL摇匀，室温20℃静置10 min，于700 nm处测定吸光度[11]。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验结果与分析
核桃壳提取物紫外可见扫描光谱结果如图1所示。
图1 核桃壳提取物紫外可见吸收光谱
Fig.1 The ultraviolet absorption spectrogram of walnut shell extract
由图1可知，在250 nm～350 nm波段扫描核桃壳提取液，测得其最大吸收波长为279 nm，以此为检测波长，测定提取液吸光度表征色素浓度。
提取温度对核桃壳提取液吸光度的影响如图2所示。
图2 提取温度对核桃壳提取液吸光度的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on absorbance of walnut shell extract
由图2可知，提取液吸光度随着温度变化先升高后降低，一般而言升高温度有利于溶出提取，但温度升高可能会使部分色素分解或聚合形成沉淀。在温度为50℃时，提取液吸光度到达最大值，由此确定响应面试验提取温度为40、50、60℃。
乙醇浓度对核桃壳提取液吸光度的影响如图3所示。
图3 乙醇浓度对核桃壳色素吸光度的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on the absorbance of walnut shell extract
由图3可知，提取液吸光度随着乙醇浓度的变化先减小，后增大，再减小，根据相似相容原理，最佳提取所需乙醇浓度在50%附近，因此确定响应面法试验中乙醇浓度为45%、50%、55%。
提取时间对核桃壳提取液吸光度的影响如图4所示。
图4 提取时间对核桃壳色素吸光度的影响
Fig.4 Effect of extraction time on absorbance of walnut shell extract
由图4可知，前30 min内吸光度随着提取时间的增加变化不大，甚至在20 min时出现降低波动，可能原因是提取液还未能完全浸透物料。提取开始20 min后吸光度呈线性增加，应是物料完全浸透后提取时间越长，析出色素含量越高。由于色素含量有限，到达一定时间后，曲线应趋于平缓，此试验并未出现吸光度极大值，说明应延长提取时间，但继续延长时间会降低效率，因此确定最佳提取时间为60 min，响应面法试验提取时间为 55、60、65 min。
料液比对核桃壳提取物吸光度的影响如图5所示。
图5 料液比对核桃壳提取液吸光度的影响
Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the absorbance of walnut shell extract
由图5可知，提取液吸光度随溶剂增加变化平缓，表明料液比1∶10（g/mL）时，溶剂已经足量，再增加溶剂无助于色素提取且成本增加，减少溶剂则核桃壳粉无法被充分润湿，因此可固定料液比为1∶10（g/mL），并且料液比不作为响应面法试验的影响因素。
2.2 响应面法优化试验结果与分析
响应面法优化试验结果见表2。
表2 响应面试验结果
Table 2 Response surface test results
编号 A提取温度/℃ B乙醇浓度/% C提取时间/min 吸光度1 60 50 55 0.459 2 50 50 60 0.515 3 50 50 60 0.544 4 50 45 65 0.569 5 40 50 55 0.490 6 50 55 55 0.509 7 50 55 65 0.559 8 50 50 60 0.532 9 50 45 55.620 10 60 45 60 0.613 11 60 55 60 0.463 12 60 50 65 0.537 13 50 50 60 0.551 14 50 50 60 0.548 15 40 55 60 0.514 16 40 45 60 0.537 17 40 50 65 0.554
对表2数据用ANOVA进行回归分析，得到二次回归方程：吸光度=0.54-2.875×10-3A-0.037B+0.018C-0.032AB+3.5×10-3AC+0.025BC-0.030A2+0.024B2+2.25×10-3C2。方差分析结果见表3。
表3 响应面误差分析结果
Table 3 Response surface error analysis results
注：*表示差异显著，P＜ 0.05；**表示差异极显著，P＜ 0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 0.026 9 2.89×10-3 4.56 0.029 *A提取温度 6.611×10-5 1 6.61×10-5 0.1 0.756 B乙醇浓度 0.011 1 0.011 17.07 0.004 4 **C提取时间 2.485×10-3 1 2.49×10-3 3.93 0.088 AB 4.032×10-3 1 4.03×10-3 6.37 0.039 6 *AC 4.900×10-5 1 4.90×10-5 0.077 0.788 9 BC 2.550×10-3 1 2.55×10-3 4.03 0.084 7 A2 3.853×10-3 1 3.85×10-3 6.09 0.043 *B2 2.425×10-3 1 2.43×10-3 3.83 0.091 1 C2 2.132×10-5 1 2.13×10-5 0.034 0.859 6残差 4.430×10-3 7 6.33×10-4失拟误差 3.560×10-3 3 1.19×10-3 5.46 0.067 4纯误差 8.700×10-4 4 2.18×10-4总误差 0.030 16
对模型的误差分析可得：模型P=0.029，差异显著，失拟误差P=0.0674为不显著。其中，AB、A2对核桃壳色素的提取影响显著；B乙醇浓度对提取液吸光度影响极显著。主要影响因素顺序为乙醇浓度＞提取时间＞提取温度。该模型的C.V.=4.69%，说明该模型的置信度良好。该模型的R2adj=0.880 4、R2=0.854 3，说明提取液吸光度的影响85.43%来源于乙醇浓度、提取时间、提取温度。综上说明回归方程模型合理，该试验设计可靠，所得模型方程可以预测试验结果。
2.3 响应面各影响因素间交互作用
2.3.1 提取时间和提取温度交互作用
提取时间和提取温度响应面曲线见图6。
图6 提取时间和提取温度响应面曲线图
Fig.6 Extraction time and temperature response surface graphs
由图6可知，此响应面变化趋势平缓，当提取时间一定时，吸光度随着提取温度增加，呈现先增加后减少的趋势。当提取温度一定时，吸光度随着提取时间延长稍有增加。提取时间和提取温度的交互作用对核桃壳提取液吸光度值影响不显著，P=0.788 9＞0.05。
2.3.2 乙醇浓度和提取温度交互作用
乙醇浓度和提取温度响应面曲线见图7。
图7 乙醇浓度和提取温度响应面曲线图
Fig.7 Curve of ethanol concentration and temperature response surface
由图7可见，乙醇浓度在45%附近时，吸光度随提取温度增加变化显著，更有利于提取。乙醇浓度和提取温度的交互作用对核桃壳色素提取液吸光度影响显著，P=0.039 6＜0.05。
2.3.3 提取时间和乙醇浓度交互作用
提取时间和乙醇浓度响应面曲线见图8。
图8 提取时间和乙醇浓度响应面曲线图
Fig.8 Curve of response surface of extraction time and ethanol concentration
由图8可知，提取时间一定时，提取液吸光度随乙醇浓度增加缓慢降低。乙醇浓度在45%附近时，吸光度随时间变化不明显，且此时吸光度较高。乙醇浓度在55%附近时，吸光度随时间增加而增加，但总体低于45%附近。以上均表明乙醇浓度为显著影响因素，且其最优值应在45%附近。提取时间和乙醇浓度交互作用不显著，P=0.0847＞0.05。
2.4 响应面最优工艺筛选与验证
用Design expert中Solutions分析，拟定最优工艺为乙醇浓度47%、提取温度51.53℃、提取时间55 min，预测最佳条件下提取液吸光度为0.613。
结合实际工艺操作，确定乙醇浓度47%、提取温度51℃、提取时间55 min为最优提取工艺并进行验证，得最佳工艺下提取液吸光度为0.614，色素产率为1.65%。
2.5 核桃壳色素性能表征
2.5.1 金属离子对核桃壳色素的影响
金属离子对核桃壳色素的影响如表4所示。
表4 金属离子对核桃壳色素的影响
Table 4 Effect of metal ions on the pigment of walnut shell
注：-为未测得数值。
金属离子最大吸收波长λmax/nm吸光度（λmax）吸光度（279 nm） 现象Cu2+ - - - 蓝色浑浊液体Mg2+ 274 0.303 0.300 微黄色透明液体Ca2+ 279 0.258 0.258 微黄色液体Na+ 276 0.288 0.287 微黄色透明液体Fe3+ - - - 黄色浑浊液体Al3+ 274 0.558 0.552 黄色液体Zn2+ 280 0.293 0.292 微黄色液体K+ 279 0.286 0.286 微黄色透明液体
由表4可知，加入Fe3+、Cu2+溶液都使原液浑浊，说明这两种离子对核桃壳色素的结构有所影响；Al3+溶液吸光度较其他离子溶液大，色素溶液颜色加深，但不影响色素应用；Mg2+、Na+、Zn2+溶液的加入使得原液的波峰位置偏移，但变化细微对吸光度及外观影响可以忽略；Ca2+、K+的加入对原液没有影响。因此该色素在使用时应注意避免接触Fe3+、Cu2+。
2.5.2 核桃壳色素DPPH自由基清除能力
以VC为对照，核桃壳色素DPPH自由基清除能力如图9所示。
图9 DPPH自由基清除率
Fig.9 DPPH radical scavenging rate
由图9可知，核桃壳色素对DPPH自由基具有一定清除能力，且浓度越大，DPPH自由基清除能力越大强，但总体较VC弱。在配制浓度为25 μg/mL时清除率已达临界值73%，此时实际溶液体系中核桃壳色素浓度为 12.5 μg/mL，DPPH 浓度为 0.1 mmol/L。
2.5.3 核桃壳色素还原力
以VC为对照，核桃壳色素还原力如图10所示。
图10 核桃壳色素还原力
Fig.10 Reducing power of walnut shell pigment
由图10可知，核桃壳色素具有一定还原能力，且浓度越大吸光度越高，则对应还原力越强，但总体较VC弱。
3 结论
通过单因素试验，考察了影响核桃壳色素提取液吸光度的主要因素为乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比。结果显示：前3个因素对色素提取影响较大。提取时间包含了物料浸润时间，提取时间应大于30 min，料液比对提取影响较小，其可固定为 1∶10（g/mL）。运用响应面法进一步优化试验条件，得到影响因素顺序为乙醇浓度>提取时间>提取温度，并获得二次回归模型，确定最优提取条件为乙醇浓度47%、提取温度51℃、提取时间55 min，此时色素的提取产率为1.65%。利用最佳条件下获得的色素，测定其对Fe3+、Cu2+、Mg2+、Na+、Al3+、Zn2+、Ca2+、K+等金属离子稳定性，结果表明，除Fe3+和Cu2+外，其他离子对其影响较小或没有影响。以VC为对照，测定色素DPPH自由基清除能力和还原力，结果表明，该色素具有一定的DPPH自由基清除能力和还原能力，但均较VC弱。综上，核桃壳作为原料提取色素工艺条件易实现工业化并可达到一定提取产率，所得色素对多数金属离子稳定且有清除自由基及抗氧化能力。
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