黄酮类化合物是天然产物中富有活性的植物成分，在医药、食品等领域均有重要的意义。木犀草素是一种具有代表性的天然黄酮类化合物[1]，具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗肿瘤[4]以及保护心血管[5]等多种生物活性。花生壳是木犀草素的最重要来源之一[6]。目前木犀草素的分离纯化主要采用有机溶剂提取[7]、硅胶柱层析[8]或大孔吸附树脂吸附[9]等，但由于植物中活性成分种类多样，结构相似，所以存在着分离效果差、溶剂消耗量多以及操作繁琐等缺点，利用传统的分离纯化技术得到高纯度的目标分子存在较大难度[10-11]。因此研究和开发木犀草素的高效分离纯化技术具有重要的意义。
分子印迹固相萃取技术是利用分子印迹聚合物作为固相萃取剂，选择性分离目标物的技术[12]。相较于传统的固相萃取，分子印迹固相萃取对目标化合物具有特异选择性，能分离复杂样品中的特定成分，并且具有较强的富集能力，检测灵敏度高[13]。因此分子印迹-固相萃取现已成为分离纯化的热点之一，有着广泛的应用前景[14-16]。高文姬[17]、肖淑娟等[18]采用本体聚合法制备木犀草素分子印迹聚合物，并以其为填料制备分子印迹固相萃取柱，从花生壳提取物中分离纯化了木犀草素。本体聚合法制备的分子印迹聚合物存在模板分子除去困难、在研磨过程中容易破坏位点、印迹位点效率低等缺点，严重影响了分离柱效及选择性[19]，而采用沉淀聚合法制备分子印迹聚合物则不需研磨，颗粒大小较均匀，并且具有更多的均一识别位点[20-21]。
本研究以木犀草素为模板分子，α-甲基丙烯酸（α-methyl acrylic acid，MAA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）为交联剂，采用沉淀聚合法制备木犀草素分子印迹聚合物；并以其为固相萃取柱填料，制备分子印迹固相萃取柱，研究萃取柱对木犀草素的萃取性能，为花生壳中木犀草素的提纯提供了一种高效的分离方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
木犀草素（纯度97.81%）：上海毕得医药科技有限公司；花生根茎：仲恺农业工程学院种子科学与工程研究所培育；α-甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、偶氮二异丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
THZ-82水浴恒温振荡器：金坛市荣华仪器制造有限公司；HH-14数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；KH-45A电热恒温干燥箱：康恒仪器有限公司；ATY124电子天平：日本岛津公司；Agilent-1200S高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；Visiprep DL SPE真空固相萃取装置：美国Supelco公司。
1.3 试验方法
1.3.1 分子印迹聚合物的制备
以木犀草素为模板分子，MAA为功能单体，按1∶8质量比溶解于30 mL甲醇溶液中，加入6 mmol交联剂EGDMA、100.0 mg引发剂AIBN到该混合溶剂中，超声脱气5 min，通氮气5 min脱氧，密封后于60℃恒温水浴中聚合24 h。所得固体以甲醇-乙酸溶液（8∶2，体积比）为溶剂进行索氏提取洗脱，直至洗脱液不含模板分子为止，再用甲醇反复洗涤聚合物除去残留乙酸，真空干燥，得分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）。非分子印迹聚合物的制备除不加入木犀草素模板分子外，步骤与处理方法均与上述制备过程相同，得非分子印迹聚合物（non-imprinted polymers，NIPs）。
1.3.2 高效液相色谱条件（high performance liquid chroma-tography，HPLC）
色谱柱型号：CNW Athena C18-WP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（30∶70，体积比），柱温：28℃，流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：350 nm，进样量：20 μL。
1.3.3 木犀草素标准曲线
配制1.0 mg/mL木犀草素标准储备液，甲醇稀释，制备 2、4、8、12、16、20、28、40 μg/mL 的木犀草素标准工作液，按照1.3.2高效液相色谱条件测定峰面积，绘制木犀草素的标准曲线。
1.3.4 木犀草素分子印迹聚合物的吸附性能
1.3.4.1 分子印迹聚合物的动态吸附试验
准确称取30.0 mg MIPs于20 mL具塞锥形瓶中，加入10 mL 1.0 mmol/L的木犀草素标准液，置于25℃恒温水浴中振荡，每隔一段时间（0.5、2、4、5、6、8 h），取出MIPs上清液，通过HPLC测定其中木犀草素的含量，绘制木犀草素吸附量Q（μmol/g）与吸附时间（h）之间的变化曲线。其中吸附量Q按下式（1）进行计算。
式中：Q为吸附量，μmol/g；Co为底物的初始浓度，μmol/mL；Ce为平衡后底物的浓度，μmol/mL；V 为吸附溶液的体积，mL；m为吸附剂印迹聚合物微球的质量，g。
1.3.4.2 分子印迹聚合物的选择性考察
分别称取30.0 mg MIPs与NIPs置于20 mL具塞锥形瓶中，加入10 mL 1.0 mmol/L的木犀草素标准液，置于25℃恒温水浴中振荡吸附8 h，取上清液，利用HPLC检测木犀草素的含量，参照袁波的方法[22]，印迹因子IF按下式（2）进行计算。
式中：IF为印迹因子；QMIPs为分子印迹聚合物对木犀草素的吸附量，μmol/g；QNIPs为非分子印迹聚合物对木犀草素的吸附量，μmol/g。
1.3.5 花生壳提取物的制备
称取花生壳粉末8.0 g，加入160 mL乙醇-水溶液（8∶2，体积比），置于80℃恒温水浴中萃取3 h，将得到的乙醇提取液旋蒸至近干得花生壳提取液，自然干燥得花生壳乙醇提取物，密封放入干燥器中备用。
1.3.6 分子印迹固相萃取柱的制备
在固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）中通过干法分别装入约0.3 g MIPs与NIPs填料，确保填料紧实平整，再加入少许石英砂于MIPs上方固定。装柱完毕后，加入10 mL甲醇润湿柱子。取2 mL花生壳提取液溶解于不同体积比的甲醇-水溶液后，装入固相萃取柱，以不同体积比的甲醇-水溶液进行淋洗除去杂质，真空抽干，以25 mL不同种类的甲醇-酸溶液进行洗脱，收集淋洗液及洗脱液，HPLC检测其中木犀草素的含量，木犀草素在固相萃取柱中的保留率A、洗脱率B 按下式（3）、（4）进行计算。
式中：A为木犀草素的保留率，%；m0为上样液中木犀草素的质量，μg；m1为流出液中木犀草素的质量，μg。
式中：B为木犀草素洗脱率，%；m0为上样液中木犀草素的质量，μg；m1为洗脱液中木犀草素的质量，μg。
2 结果与分析
2.1 木犀草素标准曲线
根据木犀草素的浓度C（μg/mL）与色谱图峰面积A（mAU）之间的对应关系，建立线性方程，绘制相对的标准曲线：y=72.026x+19.419，相关系数R2=0.999 2。木犀草素标准曲线见图1。
图1 木犀草素标准曲线
Fig.1 The standard curve of luteolin
2.2 分子印迹聚合物制备条件的优化
2.2.1 模板分子与功能单体的摩尔比选择
以木犀草素为模板分子，α-甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，固定交联剂EGDMA用量为5 mmol/L，引发剂AIBN用量为100.0 mg，分别以不同摩尔比的木犀草素与 MAA（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）制备 MIPs，考察模板分子与功能单体的摩尔比对MIPs吸附量的影响，结果见图2。
图2 模板分子与功能单体的摩尔比对MIPs吸附量的影响
Fig.2 Effect of the molar ratio of template to monomer on MIPs adsorption capacity
由图2可知，随着MAA用量的增加，MIPs的吸附量逐渐增加，当木犀草素与MAA的摩尔比为1∶8时，MIPs的吸附量达到最大值32.22 μmol/g，而随着MAA用量的继续增加，MIPs的吸附量逐渐减少。这是因为当功能单体MAA用量较少时，只有少量的木犀草素能与功能单体结合形成复合物，还有大量未结合的印迹分子存在，制备的MIPs中只有较少的木犀草素选择性吸附位点，导致吸附量较少；而随着MAA用量的增加，木犀草素与MAA间形成更多的选择性吸附位点，吸附量逐渐增加，但MAA用量过多时，过量的MAA会导致非选择性的结合位点增加，还会引发自身分子的聚合，导致MIPs中木犀草素的吸附位点减少，吸附量减少。因此，木犀草素与MAA的最佳摩尔比为1∶8。
2.2.2 交联剂用量的选择
固定木犀草素与MAA的摩尔比为1∶8，引发剂AIBN用量为100.0 mg，分别以不同用量的交联剂EGDMA（2、4、6、8、10 mmol）制备 MIPs，考察交联剂用量对MIPs吸附量的影响，结果见图3。
图3 交联剂用量对MIPs吸附量的影响
Fig.3 Effect of the cross-linker dosage on MIPs adsorption capacity
由图3可知，随着交联剂EGDMA用量的增加，MIPs的吸附量逐渐增加，当交联剂EGDMA的用量为6 mmol时，MIPs的吸附量达到最大值42.56 μmol/g，而随着EGDMA用量的继续增加，MIPs的吸附量逐渐减少。这是因为当交联剂EGDMA用量较少时，低交联剂用量会使MIPs的印迹空穴刚性过低，洗脱后难以维持空穴原来的形状和大小，导致木犀草素的识别效果不佳，吸附量较少；而随着EGDMA用量的增加，MIPs的印迹空穴刚性增强，减少聚合物在不同溶剂中的溶胀，但当EGDMA的用量过多时，木犀草素在聚合物体系内的传质会被高度交联的网络阻断，导致分离效果下降，吸附量减少。因此，交联剂EGDMA的最佳用量为6 mmol。
2.3 木犀草素分子印迹聚合物的吸附性能
2.3.1 分子印迹聚合物的动态吸附性能
用动态吸附试验考察聚合物MIPs的吸附性能，绘制动态吸附曲线，结果如图4。
图4 MIPs动态吸附曲线
Fig.4 Dynamic adsorption curve of MIPs
由图4可知，MIPs在前5 h内吸附量先迅速增大，后缓慢上升，在5 h时MIPs达到最大吸附量37.22 μmol/g，而5 h后，吸附量出现先下降后上升的现象。这是由于在吸附的初期，MIPs的结合位点未达到饱和状态，吸附量随着吸附时间的增加而迅速上升；当吸附量增大到一定程度时，溶液中木犀草素的浓度降低，MIPs出现外吐现象，使得吸附量降低，降低到一定程度时MIPs又重新开始吸附木犀草素。因此，MIPs在5 h时吸附量最大且基本达到吸附平衡。
2.3.2 分子印迹聚合物选择性吸附性能
试验结果表明，在1.0 mmol/L的木犀草素标准液中，MIPs的吸附量可达44.75 μmol/g，而NIPs的吸附量仅有 36.38 μmol/g，印迹因子按式（2）进行计算，得IF=1.23。MIPs比NIPs具有更强的选择吸附性，这是由于NIPs在合成的过程中并没有加入相应的模板分子，无法形成具有特异性吸附的空穴，所以NIPs的吸附主要是物理吸附作用，而合成的MIPs除了具有物理吸附外，还有特异性吸附，因此它的吸附量较NIPs高。
2.4 分子印迹-固相萃取条件的优化
2.4.1 上样溶剂的选择
由于木犀草素在甲醇溶液中溶解性较好，同时花生壳中木犀草素的提取以甲醇-水溶液为溶剂，因此试验分别以不同体积比的甲醇-水溶液（0∶100、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、100∶0）作为上样溶剂，考察其对木犀草素保留率的影响，结果见图5。
图5 上样溶剂对木犀草素保留率的影响
Fig.5 Effect of sample solvent on luteolin retention rate
由图5可知，随着溶剂中甲醇含量的增加，木犀草素的保留率逐渐下降。当采用纯水作为上样溶剂时，木犀草素的保留率达到最高84.63%，而采用纯甲醇作为上样溶剂时，木犀草素的保留率达到最低56.06%。这是由于木犀草素在甲醇中溶解度较大，当上样溶剂中甲醇浓度较高时，木犀草素容易随着上样液流出萃取柱，造成样品的损失，保留率下降；而甲醇浓度过低时，则溶剂极性过大，容易影响聚合物中印迹空穴与木犀草素物质间的氢键作用[23]；且甲醇浓度过低不利于粗提取物的溶解，造成上样过程中部分提取物析出，进行淋洗时，容易随着淋洗液流出，影响萃取效果。故选用甲醇-水溶液（50∶50，体积比）作为上样溶剂。
2.4.2 淋洗液的选择
试验以10 mL不同体积比的甲醇-水溶液（10∶90、20∶80、30∶70、35∶65、40∶60、50∶50）作为淋洗液，考察其对木犀草素保留率的影响，结果见图6。
图6 淋洗液对木犀草素保留率的影响
Fig.6 Effect of abluent solvent on luteolin retention rate
由图6可知，随着甲醇含量的增加，木犀草素的保留率呈现下降的趋势。当采用甲醇-水溶液（10∶90，体积比）作为淋洗液时，木犀草素的保留率达到最高98.11%，当采用甲醇-水溶液（50∶50，体积比）时，保留率达到最低39.08%。且当甲醇体积占比大于35%时，木犀草素的保留率快速下降，这是由于甲醇含量的增加，使木犀草素在淋洗液中的溶解度大幅上升，容易随着杂质一起流出，造成保留率骤减。而甲醇-水体积比处于 10∶90～35∶65 时，木犀草素的保留率为 98.11%～90.24%，相对影响较小，因此选用甲醇-水溶液（35∶65，体积比）作为淋洗液。
2.4.3 淋洗液用量的选择
试验以 5、10、15、20、25 mL 的甲醇-水溶液（35∶65，体积比）作为淋洗液，考察其对木犀草素保留率的影响，结果见图7。
图7 淋洗液用量对木犀草素保留率的影响
Fig.7 Effect of dosage of abluent solvent on luteolin retention rate
由图7可知，随着淋洗液用量的增加，木犀草素的保留率呈现下降的趋势。当淋洗液用量为5 mL时，木犀草素保留率达到最高99.00%，而当淋洗液用量为25 mL时，保留率达到最低74.25%。淋洗液用量在5 mL～15 mL时，大部分杂质以及少量木犀草素随淋洗液流出，而当淋洗液用量为15 mL～25 mL时，大量木犀草素开始溶解于淋洗液中，随着淋洗液流出，造成保留率的下降。但是淋洗液用量过低易造成杂质残留。因此选用15 mL的甲醇-水溶液（35∶65，体积比）作为最佳淋洗液。
2.4.4 洗脱液的优化
试验分别选取25 mL甲醇-乙酸溶液（80∶20，体积比）、甲醇-甲酸溶液（80∶20，体积比）、甲醇-乙酸溶液（90∶10，体积比）、纯甲醇溶液作为洗脱液，考察其对木犀草素洗脱率的影响，结果见图8。
图8 洗脱液对木犀草素洗脱率的影响
Fig.8 Effect of elution solvent on luteolin elution rate
1.体积比 80∶20 的甲醇-乙酸溶液；2.体积比 80∶20 的甲醇-甲酸溶液；3.体积比90∶10的甲醇-乙酸溶液；4.纯甲醇溶液。
由图8可知，当采用纯甲醇作为洗脱液时，木犀草素的洗脱率达到最低67.76%，当采用体积比80∶20的甲醇-甲酸溶液作为洗脱液时，洗脱率达到最高85.57%。这是由于MIPs主要通过氢键作用吸附木犀草素，在保持相同洗脱剂用量的前提下，加入少量的有机酸易于破坏木犀草素与MIPs间的氢键作用，洗脱率上升。甲酸的酸性比乙酸强，所以80%甲醇-甲酸洗脱率最高，因此选用25 mL的体积比80∶20的甲醇-甲酸溶液作为最佳洗脱液。
2.5 花生壳提取物中木犀草素分子印迹-固相萃取纯化
按照1.3.2的HPLC条件对花生壳提取物上样液、固相萃取淋洗液以及洗脱液进行检测，木犀草素标准品、花生壳提取物上样液、固相萃取淋洗液以及洗脱液的HPLC色谱图见图9。液相色谱的分析结果见表1。
图9 HPLC色谱图
Fig.9 The HPLC figure
（a）木犀草素标准品；（b）上样液；（c）淋洗液；（d）洗脱液。
表1 液相色谱的分析结果
Table 1 Analysis results of HPLC
项目 木犀草素保留时间/min 木犀草素峰面积百分比/%木犀草素标准品 15.838±0.154 93.80上样液 15.597±0.126 51.99固相萃取洗脱液 15.779±0.029 94.18
由图9、表1可知，木犀草素标准品的平均保留时间是（15.838±0.154）min；花生壳提取物上样液中木犀草素的平均保留时间是（15.597±0.126）min，除此之外还存在大量杂质峰；固相萃取洗脱液中木犀草素的平均保留时间是（15.779±0.029）min，杂峰显著减少。固相萃取淋洗液在保留时间15 min～16 min无木犀草素的特征峰出现，只存在大量杂峰，说明固相萃取的淋洗液可较好地除去杂质。花生壳提取物上样液中木犀草素的峰面积占总面积51.99%，经分子印迹-固相萃取分离纯化后，木犀草素的峰面积占总面积94.18%，提高了42.19%。
3 结论
采用沉淀聚合法制备了木犀草素分子印迹聚合物，该印迹聚合物对木犀草素具有优良的吸附效果以及选择性。以其为填料制备了木犀草素分子印迹固相萃取柱，确定了固相萃取柱的最优上样溶剂为甲醇-水溶液（50∶50，体积比）、淋洗液为甲醇-水溶液（35∶65，体积比）、洗脱液为体积比80∶20的甲醇-甲酸溶液，用此固相萃取柱对花生壳提取物中的木犀草素进行分离纯化，该固相萃取柱对木犀草素表现出较好的选择性吸附效果，可分离纯化出相对纯度为94.18%的木犀草素，为花生壳中木犀草素的分离纯化提供了一种高效的分离方法。
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