海参性腺作为海参精深加工过程中的副产物，其营养价值极高（蛋白质含量约为55%[1]，脱脂海参性腺蛋白质含量约为80%[2]），富含多种氨基酸（谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等），是优质的动物多肽来源[3]。但因相应加工技术落后和人为认知等原因，海参性腺大多在加工海参产品后被抛弃，既造成资源浪费又引起环境污染[4]。因此，海参性腺的回收利用不仅可以有效保护环境和减少资源浪费，而且以海参性腺为原料提取的功能物质也具有极高的生物活性和利用价值。胡杨[5]和蔡彬新等[6]研究表明，海参内脏中还富含血管紧张素转化酶（angiotensin convert enzyme，ACE）抑制肽，可作为制备抑制肽的原料。
ACE抑制肽是一类具有ACE抑制活性的多肽物质，其可以抑制ACE酶的活性，从而起到预防和治疗高血压等相关疾病的作用[7]。其中，动物性ACE抑制肽的安全性高、稳定性好、易被人体消化吸收，成为一种具有开发潜力的材料[8]。ACE抑制肽的提取方法有：分离提取法、微生物发酵法、基因工程法和酶解法等，其中酶解法最为常用[9]。虽然酶解法具有温和、专一性强、操作简单、安全性高且不会对环境造成污染等优点[10]，但其酶解时间长、效率低[11]。因此，为了提高酶解效率，可以采用其它技术相辅助，其中超声辅助技术研究最为广泛[12]。超声波作用于酶解体系时可产生热、空化以及机械效应等，提高传质能力的同时促进底物进入酶的催化部位，使底物与酶的接触机会增加，提高酶解速率，缩短酶解时间，获得含量丰富的活性多肽[13]。Wang等[14]研究表明超声波预处理可以显著提高燕麦蛋白水解液的水解率和ACE抑制活性。李莹等[15]利用超声波辅助菠萝蛋白酶制备泥鳅源ACE抑制肽，结果表明超声波有效提高了酶解液的ACE抑制率。
因此，本文采用超声预处理辅助中性蛋白酶水解海参性腺制备海参性腺ACE抑制肽，得出可以高效制备海参性腺ACE抑制肽的超声预处理参数（功率、时间）和酶解条件（底物浓度、酶添加量、酶解时间），分析超滤后海参性腺ACE抑制肽的体外消化情况，从而为超声辅助酶解制备海参性腺ACE抑制肽提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海参性腺：大连水产有限公司；中性蛋白酶（酶活力为 81 137 U/g）、胃蛋白酶（酶活力为 16 000 U/g）、胰蛋白酶（酶活力为11 400 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；血管紧张素转化酶（ACE）（酶活力为2 U/mg～6 U/mg）、呋喃丙烯酰三肽 [N-（3-（2-furyl）acryloyl）-phe-gly-gly，FAPGG]、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 {2-[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazine]ethanesulfonic acid，HEPES}：Sigma公司；所用化学试剂为分析纯。
1.2 仪器与设备
AL-104-精密电子天平：广州森美特轻工机械制造有限公司；DHG-9240A型电热鼓风干燥箱：苏州欧文烘箱制造有限公司；FE20K型pH计：苏州华宏仪表有限公司；GL-21M冷冻离心机：上海思龙科学仪器有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞粉碎机：南京吮玛仪器设备有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：广州仪德精密科学仪器股份有限公司；721型可见分光光度计：西安凯美克仪器设备有限公司；Millipore超滤管3、10 kDa：密理博中国有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 海参性腺基本物质含量的测定
参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》，利用直接干燥法测定水分含量[16]；参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》，利用索式抽提法测定粗脂肪含量[17]；参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》，利用灼烧称重法测定灰分含量[18]；参照GB5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，利用凯氏定氮法测定粗蛋白含量[19]；氨基酸组成分析参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[20]。
1.3.2 海参性腺脱脂
海参性腺冻干研磨成粉，过60目筛，取100 g粉加入400 mL正己烷和50 mL乙醇（8∶1，体积比）搅拌1 h，在 4℃、8 000×g离心力条件下离心 10 min，重复操作两次。将脱脂后的海参性腺粉在室温（25±1）℃下自然风干，然后置于-20℃条件下保存。
1.3.3 超声预处理
用蒸馏水溶解海参性腺脱脂冻干粉，将其配制成一定浓度的溶液。研究不同超声功率和超声时间对海参性腺蛋白酶解特性的影响。每个因素的水平设计如下：超声功率 100、200、300、400、500 W，超声 15 min；超声处理时间 5、15、25、35 min，超声功率 200 W。其中超声波间歇模式为超声工作2 s和间歇2 s。
1.3.4 海参性腺酶解
将超声预处理后的溶液调节pH值至7.0，加入中性蛋白酶（酶活力为81 137 U/g），在50℃下酶解一定时间。酶解完成后，再热水浴（100℃）10 min使中性蛋白酶灭活，然后10 000×g离心30 min，得到上清液并检测其ACE酶抑制活性，并将其冻干成粉在-20℃下储存便于后面试验使用。
因素水平考察如下：底物浓度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，酶解时间为2h，酶添加量为4500U/g；酶解时间 1、2、3、4、5、6 h，底物浓度为 2%，酶添加量为 4 500 U/g；酶添加量 1 500、3 000、4 500、6 000、7 500 U/g，底物浓度为2%，酶解时间为2 h。
1.3.5 水解度的测定
水解度采用pH-stat方法测定[21]，由下式计算
式中：Nb为碱液的浓度，mol/L；B为碱液的体积，mL；Mp为水解液中蛋白质质量，g；Htot为原蛋白质中总肽键数，海参性腺蛋白为8.2 mmol/g；h为被裂解的肽键数，mmol/g；1/α为校正系数，受特定pH值和温度影响；pK为α-氨基酸的平均pK值，按7.0算。
1.3.6 ACE抑制率的测定
FAPGG作为ACE的底物，测定时具体添加组分和浓度见表1。
表1 添加组分和浓度
Table 1 Add component and concentration
注：FAPGG（1 mmol/L）为 3.994 mg FAPGG用缓冲液定容到10 mL，混匀，于4℃避光保存；缓冲溶液为HEPES 1.910 g，NaCl 1.755 g用双蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调节pH值至8.3，再补充水到100mL，置4℃备用。
试剂 空白孔/μL 样品孔/μL ACE（0.1 U/mL）FAPGG（1 mmol/L）10 50缓冲溶液 40 0 ACE抑制剂 0 40 10 50
用酶标仪在340 nm处测定空白孔和样品孔的初始吸光度和37℃下反应30 min后的吸光度，初始吸光度分别为A1和B1，反应后吸光度分别为A2和B2。平行测定5组。抑制率可用下式表示。
参考丁青芝[21]的方法在ACE抑制率的基础上测定IC50。
1.3.7 水解物的分级分离
用10、3kDa的超滤管对酶解液超滤离心（10000×g，5 min），得到不同分子量（molecular weight，MW）的3个组分，组分 I：MW＞10 kDa；组分 II：3 kDa＜MW＜10 kDa；组分III：MW＜3 kDa。将得到的肽片段滤出液，一部分经真空冷冻处理后变为冻干粉；一部分4℃保存备用。
1.3.8 体外模拟胃肠消化试验
根据马勇等[22]的方法对海参性腺ACE抑制肽的消化稳定性进行评估。用4 mol/L的HCl将肽溶液的pH值调节至 2.0。加入胃蛋白酶（E/S＝16 000 U/g），然后将混合物在37℃温育2 h。用0.9 mol/L的NaHCO3将pH值调节至5.3，并用1 mol/L的NaOH中和pH值至7.0。将试管放于沸水中10 min以终止反应。随后将样品在冰上冷却至室温（25±1）℃，并在 10 000×g、4 ℃下离心10 min。将上清液分为两部分。一部分冻干并在分析之前储存在-20℃。另一部分用1 mol/L的NaOH调节pH值至7.5，并在37℃下用胰蛋白酶（E/S=11 400 U/g）进一步消化2 h。然后将混合物灭活，离心并冻干以进行进一步分析。
1.4 数据统计分析
每个进行3次重复。所得数据用Excel整理，使用Statistix 8.0软件的Tukey HSD程序进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。采用SigmaPlot 12.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 海参性腺基本营养成分和氨基酸组成分析
2.1.1 基本营养成分
海参性腺基本营养成分见表2。
表2 海参性腺基本营养成分
Table 2 Contents of basic nutrients of sea cucumber gonads
基本成分 含量/%水分 4.91±0.11灰分 17.63±0.49粗脂肪 12.83±0.57粗蛋白 42.86±0.67
表2显示了干海参性腺基本成分组成：海参性腺中水分、灰分和粗脂肪含量分别为4.91%、17.63%和12.83%，而粗蛋白含量占总质量的42.86%，这表明海参性腺蛋白质含量丰富，秦洪[23]也发现海参内脏中蛋白质的含量较高（59.5%），远高于一般动物源食品，因此可作为制备动物源蛋白质及相应多肽制品的原料。
2.1.2 氨基酸组成
海参性腺氨基酸组成如表3所示。
表3 海参性腺氨基酸组成分析
Table 3 Amino acid composition of sea cucumber gonads
氨基酸含量/（g/100 g）氨基酸含量/（g/100 g）天冬氨酸 3.87±0.04 亮氨酸 2.65±0.05苏氨酸 2.01±0.02 酪氨酸 1.54±0.04丝氨酸 1.56±0.01 苯丙氨酸 1.98±0.02谷氨酸 5.58±0.04 赖氨酸 3.23±0.01甘氨酸 2.31±0.03 组氨酸 1.10±0.03丙氨酸 0.01±0.06 精氨酸 2.38±0.05半胱氨酸 0.28±0.04 脯氨酸 1.96±0.04缬氨酸 2.03±0.05 疏水性氨基酸 14.57±0.12甲硫氨酸 0.86±0.02 必需氨基酸 17.40±0.16异亮氨酸 3.54±0.03 总氨基酸 36.89±0.38
海参性腺共含有17种氨基酸，包括8种必需氨基酸（苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸）和9种非必需氨基酸，两者分别占总氨基酸含量的47.17%和52.83%，必需氨基酸/非必需氨基酸值为0.89。Lee等[24]发现海参内脏中必需氨基酸/非必需氨基酸值（0.99～1.15）比海参体壁（0.67～0.78）的高。秦洪[23]指出必需氨基酸/非必需氨基酸值越高，蛋白的价值越高。
海参性腺还含有8种疏水性氨基酸（丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸），占总氨基酸含量39.50%。贾俊强[25]研究发现，疏水性氨基酸含量与ACE抑制肽活性呈正相关，因为疏水氨基酸趋向于存在ACE抑制肽的C端，C端氨基酸对提高抑制肽的活性具有重要的作用。故海参性腺疏水性氨基酸含量高说明其适合于ACE抑制肽的制备。
2.2 超声辅助酶解条件对海参性腺水解物水解度和ACE抑制率的影响
2.2.1 超声预处理条件对海参性腺水解物水解度和ACE抑制率的影响
2.2.1.1 超声功率
超声功率对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率影响见图1。
图1 超声功率对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影响
Fig.1 Effects of ultrasound power on DH and ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad
a～e不同字母表示海参性腺水解物水解度的差异显著（P＜0.05）；A～C不同字母表示海参性腺水解产物ACE抑制率的差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，水解度随超声功率的增加呈现先升后降的趋势，水解度在300 W时达到最大值8.75%（P＜0.05）。这可能是因为适度的超声波处理可以改变底物蛋白的空间结构，增加了底物与蛋白酶的结合位点，导致海参性腺蛋白中的大量肽键被水解，从而使水解度升高。ACE抑制率随超声功率的增加呈现相同的趋势，ACE抑制率在超声功率为200 W时达到最大值（73.8%），与未超声组相比，ACE抑制率显著提高了13.7%（P＜0.05）。李莹等[15]得到类似的结果：适当功率（350 W）超声波辅助酶解泥鳅可以显著提高酶解液ACE抑制活性。这是因为超声功率的增加导致空化效应产生的能量增加，疏松了海参性腺蛋白结构，更多酶结合位点和疏水性氨基酸基团被暴露，在酶解过程中释放出更多的ACE抑制肽，由此获得更高的ACE抑制率[26]。而过高功率的超声可能会产生较强的空化效应，使蛋白质发生碰撞而折叠，从而引起蛋白质聚集，进一步导致酶解位点减少，不利于酶解。此外，毛丽等[27]认为高功率超声产生过多的空化泡，形成声波屏障，不利于超声作用于全部物料。综上，超声功率为200 W时酶解效果最理想。
2.2.1.2 超声时间
超声时间对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率影响见图2。
图2 超声时间对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影响
Fig.2 Effects of ultrasound time on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad
a～e不同字母表示海参性腺水解物水解度的差异显著（P＜0.05）；A～C不同字母表示海参性腺水解产物ACE抑制率的差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率随超声时间的延长呈现先升后降的趋势，超声15 min时，与未超声组相比，水解度和ACE抑制率分别提高了25.9%和13.2%。Wang等[14]在超声辅助酶解处理燕麦分离蛋白的试验中得到了相似的结果：水解度和ACE抑制率随超声时间的延长呈现先升后降的趋势，超声20 min时两者均达到最大值。超声波能够诱导蛋白质分子展开，使蛋白质分子间的疏水相互作用被破坏，暴露更多的疏水基团和区域，导致水解度的增加，并产生更多具有ACE抑制活性的肽[28]。而较长时间的超声处理会导致蛋白质重新卷曲、折叠，使暴露的酶位点再次包裹在蛋白质内部，不利于酶解[14]。同时，疏水基团因过长时间的超声处理而暴露、交联，隐藏了疏水性氨基酸，ACE抑制肽的产生被抑制[29]。
2.2.2 酶解条件对海参性腺水解物水解度和ACE抑制率的影响
2.2.2.1 底物浓度
底物浓度对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率影响见图3。
图3 底物浓度对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影响
Fig.3 Effects of substrate concentration on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad
a～e不同字母表示海参性腺水解物水解度的差异显著（P＜0.05）；A～C不同字母表示海参性腺水解产物ACE抑制率的差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，底物浓度的增大导致水解度和ACE抑制率先增后降，水解度在底物浓度为1.0%时有最大值（P＜0.05），ACE抑制率在底物浓度为2.0%～3.0%时较高（P＜0.05）。适当的底物浓度可以使超声空化产生的作用力充分的作用在蛋白颗粒上，使底物与酶的结合更有效，促进酶解反应，从而提高了酶解反应速率，导致水解度和ACE抑制率增大[25]。然而随着底物浓度的不断增加，增加了物料黏度，因而抑制了酶解反应的继续进行，从而使海参性腺中活性肽释放量减少，引起水解度和ACE抑制率下降[30]。
2.2.2.2 酶解时间
酶解时间对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影响见图4。
图4 酶解时间对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影响
Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis time on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad
a～e不同字母表示海参性腺水解物水解度的差异显著（P＜0.05）；A～C不同字母表示海参性腺水解产物ACE抑制率的差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，水解度随着酶解时间的增加先逐渐增大后趋于平缓。王紫微[30]在超声辅助酶解克氏原螯虾的试验中得到了类似的结果：水解度随酶解时间的延长先上升后趋于平缓。在反应初期，蛋白酶活性较高，反应速率较快，随着时间的延长，酶解反应达到终点，蛋白酶的活性降低，导致水解度增长缓慢[31]。ACE抑制率随着酶解时间的增加先急剧升高后逐渐降低，ACE抑制率在酶解2 h时达到最高值73.8%（P＜0.05）。酶解初期，底物蛋白含量高、酶活性高和产物少等条件促使底物蛋白被迅速分解为多肽片段，ACE抑制肽含量增加，因此使ACE抑制率得到提高[21]。随着酶解时间的进一步延长，降低了ACE抑制活性，这是由于过长的酶解时间会导致酶与蛋白质的过度反应，多肽进一步降解为小分子短肽或游离氨基酸，过短的肽段不具有ACE抑制活性[14]。
2.2.2.3 酶添加量
酶添加量对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影响见图5。
图5 酶添加量对海参性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影响
Fig.5 Effects of enzyme concentration on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad
a～e不同字母表示海参性腺水解物水解度的差异显著（P＜0.05）；A～C不同字母表示海参性腺水解产物ACE抑制率的差异显著（P＜0.05）。
由图5可以看出，水解度随着加酶量的增加（1 500 U/g～7 500 U/g）先上升后趋于平稳。曹荣等[3]也发现海参性腺水解度随中性蛋白酶添加量的增加呈现先上升后平缓的趋势。当底物浓度一定时，酶含量增加，酶与底物结合位点增多，酶解速率加快，酶解产物中小分子肽含量增加，水解度上升[21]。当酶添加量达到6 000 U/g时，酶与底物间的接触位点可能接近饱和，因此水解度的增加速率逐渐放缓[32]。海参性腺酶解液的ACE抑制率随着酶的添加先升高后降低，当酶添加量为4 500 U/g时产物的ACE抑制率达到最大（73.6%）。这是因为随着酶量的增加，海参性腺的酶解更加充分，增加了ACE抑制肽的释放，从而使ACE抑制率升高[30]。而酶添加量过大会使海参性腺过度水解，把释放出的ACE抑制肽水解成失活片段或变为低活性的肽片段[25]，降低ACE抑制率。
2.3 海参性腺蛋白水解物体外胃肠模拟消化研究
2.3.1 水解物不同组分的ACE抑制率
海参性腺酶解液是由不同分子量（molecular weight，MW）的多肽组成的混合物，超滤离心后，酶解液被浓缩，从而使具有ACE抑制活性的肽的浓度增加。将上述处理条件下（超声预处理功率200 W，超声时间15 min，底物浓度2%，酶解时间2 h，酶添加量4 500 U/g）制备的海参性腺酶解液经超滤后按分子量分为 3 个组分：组分 I（MW＞10 kDa）、组分 II（3 kDa＜MW＜10 kDa）和组分III（MW＜3 kDa），具体见图6。
图6 海参性腺水解物经超滤后得到的3个不同分子量组分以及各自组分的ACE抑制活性
Fig.6 ACE inhibitory activities of hydrolysates from sea cucumber gonad and its three fractions after ultrafiltration
Ⅰ.MW＞10 kDa；Ⅱ.3 kDa＜MW＜10 kDa；Ⅲ.MW＜3 kDa。a～d不同字母表示ACE抑制活性的差异显著（P＜0.05）。
由图6可知，与未超滤组相比（IC50=3.97mg/mL），第III组分显示出最高的ACE抑制活性（IC50=1.37mg/mL），第I组分具有最低的活性（IC50=6.60 mg/mL）。这说明海参性腺ACE抑制活性与肽分子量大小有关，二者呈负相关，当分子量小于3 kDa时，抑制效果最为显著（P＜0.05）。张可佳[33]制备牡蛎ACE抑制肽后发现：与原酶解液和分子量大于3 kDa的组分相比，小于3 kDa的超滤液的ACE抑制活性较高。此外，Jin等[34]也发现肽的活性强弱与其自身的分子量大小密切相关，分子量越小，ACE抑制活性越高。
2.3.2 消化模拟
ACE抑制肽普遍为口服液，进入体内经肠道消化酶降解后会造成生物活性的改变[35]。因此体外模拟降血压肽抗肠道酶降解是很有必要的。表4显示了将海参性腺蛋白酶解液经超滤后得到不同分子量的组分，模拟胃消化（胃蛋白酶）和肠消化（胃蛋白酶+胰蛋白酶）后的ACE抑制活性。
表4 海参性腺水解物超滤所得的不同分子量多肽经体外消化后产物的ACE抑制活性
Table 4 ACE inhibitory activities of peptides of different molecular weights obtained from ultrafiltration of sea cucumber gonad hydrolysate after intestinal digestion in vitro
注：表中数值为平均值±标准差；每一列中的不同小写字母a～c代表差异性显著（P＜0.05）。
样品 ACE抑制活性IC50/（mg/mL）胃蛋白酶 未超滤 3.83±0.23a 3 kDa＜MW ＜10 kDa 2.31±0.23b MW ＜ 3 kDa 1.25±0.13c胃蛋白酶+胰蛋白酶 未超滤 3.74±0.15a 3 kDa＜MW ＜10 kDa 2.26±0.19b MW ＜ 3 kDa 1.14±0.07c酶
通过胃消化和肠消化后，与未超滤的海参性腺酶解液相比，超滤后的肽段ACE抑制活性均显著提高（P＜0.05），这可能是由于超滤后的多肽经消化后形成活性更高的小分子ACE抑制肽。Tagliazucchi等[36]也发现了菜豆酶解产物在体外胃肠模拟消化试验中表现出较强的ACE抑制活性。相同肽段的海参性腺酶解液经胃蛋白酶与两种酶共同作用后的IC50值并无显著差异（P＞0.05），说明酶解液中部分ACE抑制肽仍具有较高活性，消化对酶解液活性无显著影响。因此，消化前后海参性腺ACE抑制肽活性差异并不大，在体内能够表现出很好的稳定性并发挥其功能。
3 结论
通过测定水解度和ACE抑制率，筛选得出了制备海参性腺ACE抑制肽的最佳工艺条件：超声预处理功率200 W，超声时间15 min，底物浓度2%，酶解时间2 h，酶添加量4 500 U/g。超滤后肽的分子量与ACE抑制活性呈负相关，经胃消化（胃蛋白酶）、肠消化（胃蛋白酶+胰蛋白酶）后，ACE抑制肽并未降解，稳定性较好。因此，超声波辅助酶解法可作为制备海参性腺ACE抑制肽的有效方法。
[1] 向怡卉,苏秀榕,董明敏,等.复合蛋白酶水解海参生殖腺工艺的研究[J].食品工业科技,2007,28(3):143-144,146.XIANG Yihui,SU Xiurong,DONG Mingmin,et al.Study on the technology of hydrolysis of gonad by mixed protease[J].Science and Technology of Food Industry,2007,28(3):143-144,146.
[2] SUN N,CUI P B,JIN Z Q,et al.Contributions of molecular size,charge distribution,and specific amino acids to the iron-binding capacity of sea cucumber(Stichopus japonicus)Ovum hydrolysates[J].Food Chemistry,2017,230:627-636.
[3] 曹荣,刘淇,殷邦忠.响应面法优化海参性腺酶解工艺[J].食品科学,2012,33(2):29-33.CAO Rong,LIU Qi,YIN Bangzhong.Optimization of enzymatic hydrolysis process for sea cucumber gonads by response surface methodology[J].Food Science,2012,33(2):29-33.
[4]MAMELONA J,SAINT-LOUIS R,PELLETIER É.Nutritional composition and antioxidant properties of protein hydrolysates prepared from echinoderm byproducts[J].International Journal of Food Science&Technology,2009,45(1):147-154.
[5] 胡杨.利用海参内脏制备生物活性肽及其功能分析[D].厦门:集美大学,2017.HU Yang.Preparation and functional analysis of bioactive peptides derived from viscera of sea cucumber[D].Xiamen:Jimei University,2017.
[6] 蔡彬新,周逢芳,林则圣.复合酶法制备海参内脏ACE抑制肽工艺研究[J].广东农业科学,2016,43(12):85-89.CAI Binxin,ZHOU Fengfang,LIN Zesheng.Preparation of ACE inhibitory peptides from sea cucumber viscera by complex enzyme[J].Guangdong Agricultural Sciences,2016,43(12):85-89.
[7]BHASKAR B,ANANTHANARAYAN L,JAMDAR S.Purification,identification,and characterization of novel angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory peptides from alcalase digested horse gramflour[J].LWT-Food Science and Technology,2019,103:155-161.
[8] 彭杰,冉玉琴,徐炜桢,等.郫县豆瓣后发酵期氨基酸呈味效果评价及其ACE抑制肽动态分析[J].食品工业科技,2020,41(8):1-6,14.PENG Jie,RAN Yuqin,XU Weizhen,et al.Evaluation of amino acid taste effect and dynamic analysis of ACE inhibitory peptides in post-fermentation stage of Pixian soybean paste[J].Science and Technology of Food Industry,2020,41(8):1-6,14.
[9] 刘子毅.玉米黄粉ACE抑制肽的制备及其活性研究[D].北京:中国农业科学院,2019.LIU Ziyi.Study on prepartion and activity of ACE inhibitory peptide from corn gluten meal[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2019.
[10]MARCINIAK A,SUWAL S,NADERI N,et al.Enhancing enzymatic hydrolysis of food proteins and production of bioactive peptides using high hydrostatic pressure technology[J].Trends in Food Science&Technology,2018,80:187-198.
[11]FRANCK M,PERREAULT V,SUWAL S,et al.High hydrostatic pressure-assisted enzymatic hydrolysis improved protein digestion of flaxseed protein isolate and generation of peptides with antioxidant activity[J].Food Research International,2019,115:467-473.
[12]任海伟,石菊芬,蔡亚玲,等.响应面法优化超声辅助酶解制备藏系羊胎盘肽工艺及抗氧化能力分析[J].食品科学,2019,40(24):265-273.REN Haiwei,SHI Jufen,CAI Yaling,et al.Peptides from Tibetan sheep placental protein:optimization of ultrasound-assisted enzymatic preparation using response surface methodology and antioxidant activity evaluation[J].Food Science,2019,40(24):265-273.
[13]RIERA E,GOLÁS Y,BLANCO A,et al.Mass transfer enhancement in supercritical fluids extraction by means of power ultrasound[J].Ultrasonics Sonochemistry,2004,11(3/4):241-244.
[14]WANG B,ATUNGULU G G,KHIR R,et al.Ultrasonic treatment effect on enzymolysis kinetics and activities of ACE-inhibitory peptides from oat-isolated protein[J].Food Biophysics,2015,10(3):244-252.
[15]李莹,周剑忠,夏秀东,等.超声波辅助酶解制备泥鳅蛋白源ACE抑制肽[J].中国食品学报,2018,18(9):182-187.LI Ying,ZHOU Jianzhong,XIA Xiudong,et al.Preparation of angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptide from loach(Misgurnus anguillicaudatus)protein using ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2018,18(9):182-187.
[16]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中水分的测定:GB 5009.3—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.State Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China.National food safety standards Determination of moisture in food:GB 5009.3—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[17]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中脂肪的测定:GB 5009.6—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.State Health and Family Planning Commission,State Food and Drug Administration.National food safety standards Determination of fat in food:GB 5009.6—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[18]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中灰分的测定:GB 5009.4—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.State Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China.National food safety standards Determination of ash in food:GB 5009.4—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[19]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中蛋白质的测定:GB 5009.5—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.State Health and Family Planning Commission,State Food and Drug Administration.National food safety standards Determination of protein in food:GB 5009.5—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[20]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中氨基酸的测定:GB 5009.124—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.State Health and Family Planning Commission,State Food and Drug Administration.National food safety standards Determination of amino acids in food:GB 5009.124—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[21]丁青芝.脉冲超声辅助酶解法制备玉米黄粉ACEI活性肽的研究[D].镇江:江苏大学,2008.DING Qingzhi.Preparation technology of ACEI peptides from corn gluten meal by the pulsed ultrasonic-assisted enzymolysis[D].Zhenjiang:Jiangsu University,2008.
[22]马勇,高丽辉,冯晓文,等.模拟胃肠消化对牡蛎低聚肽抗氧化活性的影响[J].食品与机械,2020,36(11):133-137,176.MA Yong,GAO Lihui,FENG Xiaowen,et al.Effect of simulated gastrointestinal digestion in vitro on the antioxidant activity of oyster oligopeptides[J].Food&Machinery,2020,36(11):133-137,176.
[23]秦洪.海参(Stichopus japonicus)内脏多肽和多糖提取纯化及活性研究[D].泉州:华侨大学,2016.QIN Hong.Study on the extraction,purificatin and activities of polypeptide and polysaccharide from sea cucumber(Stichopus japonicus)viscera[D].Quanzhou:Huaqiao University,2016.
[24]LEE M H,KIM Y K,MOON H S,et al.Comparison on proximate composition and nutritional profile of red and black sea cucumbers(Apostichopus japonicus)from Ulleungdo(Island)and Dokdo(Island),Korea[J].Food Science and Biotechnology,2012,21(5):1285-1291.
[25]贾俊强.超声对酶法制备小麦胚芽ACE抑制肽的影响及其作用机理[D].镇江:江苏大学,2009.JIA Junqiang.Effect and mechanism of ultrasound on enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from wheat germ protein[D].Zhenjiang:Jiangsu University,2009.
[26]王珂,马海乐,李景,等.超声预处理辅助酶解玉米胚芽ACE抑制肽的研究[J].食品工业科技,2018,39(9):11-15,22.WANG Ke,MA Haile,LI Jing,et al.Study on effects of ultrasonic pretreatment on enzymolysis preparation of ACE-inhibitory peptides from corn germ protein[J].Science and Technology of Food Industry,2018,39(9):11-15,22.
[27]毛丽,马海乐,潘忠礼,等.超声预处理对脱脂小麦胚芽酶解制备ACE抑制肽的影响[J].食品工业科技,2016,37(12):200-205.MAO Li,MA Haile,PAN Zhongli,et al.Effect of ultrasound pretreatment on enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from defatted wheat germ[J].Science and Technology of Food Industry,2016,37(12):200-205.
[28]JIA J Q,MA H L,ZHAO W R,et al.The use of ultrasound for enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from wheat germ protein[J].Food Chemistry,2010,119(1):336-342.
[29]耿静静.超声辅助酶法制备燕麦蛋白ACE抑制肽的研究[D].镇江:江苏大学,2010.GENG Jingjing.Preparation of angiotensin-converting enzyme inhibiting peptides from oat protein with utrasonic assisted zymohydrolysis[D].Zhenjiang:Jiangsu University,2010.
[30]王紫微.超声辅助酶解制备克氏原螯虾调味料的研究[D].长春:吉林大学,2019.WANG Ziwei.Study on preparation of Procambarus clarkii flavoring by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis[D].Changchun:Jilin University,2019.
[31]郭福军.河蚌蛋白粉的制备及其抗氧化活性的研究[D].无锡:江南大学,2014.GUO Fujun.Study on the protein powder preparation of freshwater mussel meat and its antioxidant activity[D].Wuxi:Jiangnan University,2014.
[32]崔楠.木瓜蛋白酶酶解制备黄粉虫ACE抑制肽的研究[D].北京:北京林业大学,2015.CUI Nan.The research of Tenebrio molitor's ACE inhibitory peptides enzymolyzed by papain[D].Beijing:Beijing Forestry University,2015.
[33]张可佳.牡蛎ACE抑制肽的制备工艺及活性研究[D].大连:大连海洋大学,2019.ZHANG Kejia.Study on preparation process and activity of ACE inhibitory peptides from oyster[D].Dalian:Dalian Ocean University,2019.
[34]JIN J,MA H L,WANG B,et al.Effects and mechanism of dual-frequency power ultrasound on the molecular weight distribution of corn gluten meal hydrolysates[J].Ultrasonics Sonochemistry,2016,30:44-51.
[35]祝素莹,朱瑜,张银志,等.复合蛋白酶水解核桃粕制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺优化[J].食品研究与开发,2020,41(17):56-63.ZHU Suying,ZHU Yu,ZHANG Yinzhi,et al.Optimization of complex protease hydrolysis for preparation of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from walnut dregs[J].Food Research and Development,2020,41(17):56-63.
[36]TAGLIAZUCCHI D,MARTINI S,BELLESIA A,et al.Identification of ACE-inhibitory peptides from Phaseolus vulgaris after in vitro gastrointestinal digestion[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition,2015,66(7):774-782.